Organotypischen Kultur-Methode, die Entwicklung der embryonalen Gewebe zu studieren

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine organotypischen Kultivierung Protokoll zur embryonalen Organe wachsen in-vitro-. Mit dieser Methode kann die Entwicklung der embryonalen Gewebe untersucht werden und gleichzeitig ein hohes Maß an Kontrolle über die Kultur Umwelt.

Zusammenfassung

Das embryonale Huhn wird häufig als zuverlässige Modellorganismus für vertebrate Entwicklung verwendet. Seine Erreichbarkeit und kurze Inkubationszeit macht Zeit es ideal für Experimente. Derzeit ist die Studie dieser Entwicklungsstörungen Wege im Huhn Embryo mittels Inhibitoren und Drogen an lokalisierten Standorten und bei niedrigen Konzentrationen mit einer Vielzahl von Methoden. In-vitro- Gewebekulturen ist eine Technik, die es die Untersuchung von Gewebe getrennt vom Wirtsorganismus ermöglicht, während gleichzeitig viele der körperlichen Einschränkungen vorhanden, bei der Arbeit mit ganzen Embryonen, wie die Anfälligkeit der Embryonen zu umgehen hohe Dosen von potenziell tödlichen Chemikalien. Hier präsentieren wir Ihnen eine organotypischen Kultivierung Protokoll für die Kultivierung der embryonalen halben Kopf in Vitro, präsentiert neue Möglichkeiten für die Prüfung von Entwicklungsprozessen über den derzeit etablierten Verfahren.

Einleitung

Das embryonale Huhn (Gallus Gallus) ist ein hervorragendes Modellorganismus häufig verwendet im Bereich der Biologie. Die Inkubationszeit beträgt etwa 21 Tage und viele Eier können inkubiert werden gleichzeitig, Experimente zu machen, schnell und effizient. Vielleicht ist vor allem der Embryo auch leicht manipuliert ermöglicht die umfassende Studie der wichtigsten Entwicklungsprozesse und der Gene und Proteine, die diese Prozesse steuern.

Das embryonale Huhn Auge ist ein komplexes Organ, das durch das Zusammenspiel einer Reihe von verschiedenen Geweben ähnlich wie viele andere Körpersysteme entwickelt. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Entwicklung dieser Gewebe, besonders in fortgeschrittenen Stadien der Entwicklung. Z. B. möglicherweise die mehrschichtige Netzhaut von besonderem Interesse für alle, die die Entwicklung des Nervensystems. Alternative Methoden, die das Studium der anderen Augengewebe zu ermöglichen, wie z. B. die Hornhaut, Glaskörperblutung Körper, der Linse, der Sklera und die Augenlider für Forscher von Nutzen sind. Das Huhn embryonalen Auge enthält auch eine Reihe von flachen Knochen, der skleralen Gehörknöchelchen, die als Modell für die Untersuchung von intramembranous Knochen Induktion und Verknöcherung in Wirbeltieren¹verwendet werden können.

Derzeit gibt es eine Reihe von Methoden zur Untersuchung der embryonalen Entwicklung. Mikroinjektionen von inhibitorischen Antikörpern oder anderen hemmenden Moleküle^2,3, chirurgisch implantiert Microbeads Inhibitor⁴trieft und Elektroporation⁵ sind alle Methoden, die zum Downregulate Gene verwendet werden können oder in einem Embryo interessierender Proteine. Ähnliche Methoden sind an Upregulate Proteine verwendet. Diese Methoden sind nicht ohne ihre Grenzen. Beispielsweise wenn Sie Chemikalien verwenden, um die embryonale Entwicklung zu ändern, die tödlichen Auswirkungen auf den Embryo ausgewertet werden müssen, und dies schränkt die Verwendung der oben genannten Methoden, um lokalisierte Websites Anwendung bei Dosen niedrig genug, um die Überlebensfähigkeit der gewährleisten die Embryo.

In-vitro- Gewebekulturen wurde in einer Vielzahl von Organismen verwendet, um Entwicklung zu studieren und kann verwendet werden, um einige der oben genannten Einschränkungen zu umgehen. Beispielsweise sind die Oberschenkelknochen⁶, Feder Knospen^7,8und Gliedmaßen⁹ des Huhns alle untersucht worden mit Gewebe züchten Methoden, wie die Hoden der Maus¹⁰ und die Wurzeln und stengel der Pflanzen¹¹. Diese Methoden Wissenschaftler gewähren ein hohes Maß an Kontrolle über die Gewebeentwicklung, wie z. B. die Fähigkeit, die Temperatur schwanken und verändern die nährstoffverfügbarkeit. Die Isolierung des Gewebes aus der gesamte Embryo macht es auch weit weniger anfällig gegen die tödlichen Auswirkungen von Chemikalien, wodurch es Manipulation Studien auf globaler Ebene bei höheren Konzentrationen. Ein weiterer bemerkenswerter Vorteil der in-vitro- Kultivierung ist der Erhalt der zellulären Umgebung das Gewebe; die Anordnung der Gewebe relativ unverändert bleibt, die es ermöglichen, die Interaktionen zwischen verschiedenen Gewebe Arten⁹zu untersuchen. In-vitro- Kultivierung öffnet Türen zu weiteren experimentellen nähert sich somit in in Vivo oder in Ovo Modelle nicht verfügbar.

Derzeit ist die Entwicklung des embryonalen Auges mit Chemikalien besonders anspruchsvoll. Eine Reihe von extraembryonic Membranen abdecken des Embryos erschwert Microbeads oder Chemikalien anzuwenden; der Embryo ist auch sehr aktiv in der Eizelle, als es älter, wird eine ohnehin schwierige Methode weiter zu erschweren. Dieses Protokoll ermöglicht einen einfachen Zugang für das Auge und seine umgebenden Gewebe, diese Hindernisse zu beseitigen, und gleichzeitig neue Möglichkeiten, die Entwicklungsprozesse im Auge zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde gegründet, um die Induktion der skleralen Gehörknöchelchen innerhalb der embryonalen Auges zu studieren.

Protokoll

Hinweis: Für Embryo Bühnen, nutzen Sie die Hamburger und Hamilton¹² (HH) Inszenierung Tabelle.

(1) Embryo Inkubation

1. Inkubieren Sie befruchteten Hühnereiern in einem sterilen, temperaturgeführte Inkubator bei 37 ° C ± 1 ° C und ~ 40 % Luftfeuchtigkeit.
2. Drehen Sie die Eier 1 X pro Tag und es ihnen ermöglichen, zu HH34 inkubieren (8 Tage nach Befruchtung).

2. Vorbereitung und Sterilisation von Materialien

1. Für 12 Embryonen, Autoklaven, 2 L destilliertes Wasser, 1 L 0,85 % Küken Kochsalzlösung, 12 glaspipetten, 1 Karton Papiertaschentuch, 24 2,5 x 2,5 cm Quadrate der halbdurchlässigen Filterpapier und 24 2,5 x 2,5 cm Quadrate aus Stahldraht mesh mit den Kanten nach unten gebogen. Um die Materialien zu sterilisieren Autoklaven bei 121 ° C für mindestens 15 Minuten.
   Hinweis: Das Autoklavieren der Materialien kann im Voraus erfolgen.
2. Den Inkubator mit 70 % Ethanol durch Abwischen der Seiten, die Regale und die Tür zu sterilisieren. Platz 2-Kunststoff-Behälter mit autoklaviert destilliertes Wasser in die brutmaschine Feuchtigkeit zu halten. Prewarm Kultur-Inkubator auf 37 ° C ± 1 ° C und ~ 40 % Luftfeuchtigkeit. Sicherzustellen Sie, dass der Inkubator ist völlig dunkel; Wenn die Tür transparent ist, mit Alufolie bedecken.
3. Prewarm 100 mL Nährmedium und 1 mL Penicillin, indem man sie in der Kultur-Inkubator.
4. Decken Sie den Arbeitsbereich mit einem Papiertuch und Sterilisieren der Bank durch Besprühen mit 70 % igem Ethanol. 2 Paar Zangen, Dissektion Schere, einer Rasierklinge und einem Plastiklöffel mit 70 % Ethanol in ähnlicher Weise zu sterilisieren.
5. Platz 12 steril 100 mm Petrischalen und 24 sterile 35 mm Petrischalen auf der Bank für den Einsatz. Stellen Sie sicher, dass die Gerichte bis zum Gebrauch in einem sterilen Beutel bleiben.

(3) Embryo Vorbereitung

Hinweis: Ab diesem Zeitpunkt tragen Sie eine schützende Staub Gesichtsmaske zur Vermeidung einer Kontamination der Kulturen. Eine bakterielle oder pilzartige Infektion wird die Kultur ruinieren und besteht die Gefahr der Ausbreitung schnell auf alle Kulturen im Inkubator.

1. Crack öffnen Sie das Ei und den Embryo zu einem 100 mm Petrischale mit 0,85 % Küken Kochsalzlösung zu übertragen. Stadium des Embryos nach den anatomischen Merkmalen in der Hamburger und Hamilton Inszenierung Leitlinien¹² beschrieben und bestätigen den Embryo ist am HH34.
2. Schneiden Sie den Hals und dann halbieren Sie den Kopf des Embryos an der Mittellinie mit einer sterilisierten Rasierklinge. Mit steriler Pinzette entfernen Sie das Gehirn. Lassen Sie den Schnabel intakt.

4. Kultur-Setup

1. Platz 2 der 35 mm Petrischalen in einem 100 mm Petrischale.
2. Legen Sie ein Stahl Drahtgeflecht im Inneren jedes 35 mm Petrischale.
3. Mit Pinzette, 1 der halbierten Köpfe auf ein Stück 2,5 x 2,5 cm halbdurchlässigen Filterpapier mit dem Auge nach oben übertragen. Stellen Sie sicher, das Gewebe ist sicher und rutscht nicht von durch leicht kippen.
4. Mit Pinzette, sorgfältig legen Sie das Augengewebe und das Filterpapier auf das Stahl Drahtgeflecht in 1 der 35 mm Petrischalen, erstellen eine erhöhte Bühne mit dem Augengewebe an der Spitze.
5. Wiederholen Sie 4.3 und 4.4 mit der anderen Hälfte Kopf.
6. Mit einer sterilen Glaspipette, vorsichtig hinzugeben Sie Nährmedium direkt in jede Petrischale von 35 mm bis die Stufe des Filterpapiers. Tauchen Sie der halbe Kopf im Nährmedium nicht.
7. Das Nährmedium in jede Petrischale 50 µL von 10.000 U/mL Penicillin-Streptomycin hinzufügen.
8. Falten Sie ein Stück Seidenpapier in ein kleines Quadrat und legen Sie sie innen 100 mm Petrischale. Mit autoklaviert destilliertes Wasser befeuchten.
9. Legen Sie die Kulturschale in den sterilen, dunklen Brutschrank bei 37 ° C ± 1 ° C und ~ 40 % Luftfeuchtigkeit für bis zu 4 Tage.
10. Wiederholen Sie die Schritte 3 und 4 für jedes Embryo.
    Hinweis: Die Anzahl der Embryonen benötigt von der spezifischen Experiment abhängen; Hier beschreiben wir das Protokoll für 12 Embryonen.

5. Kultur-Wartung

1. Einmal pro Tag die Kunststoff-Behälter in den Inkubator mit frischem, autoklaviert destilliertes Wasser nachfüllen.
2. Täglich prüfen Sie alle Kulturen für bakterielle oder Pilzinfektionen. Kulturen, die aufgelöst haben oder in denen das Medium Farbe verändert hat, sind infiziert. Entsorgen Sie alle Kulturen, die infiziert sind.

6. Fixierung

1. Nach der Kultivierung, entfernen Sie alle Gerichte aus dem Inkubator.
2. Entfernen Sie mit einer Zange, vorsichtig das Auge aus Filterpapier, kümmert sich nicht um das Gewebe reißen.
3. Befestigen Sie das Augengewebe 4 % Paraformaldehyd in 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung über Nacht bei 4 ° C oder in 10 % Neutral gepufferte Formalin über Nacht bei Raumtemperatur.
4. Das Gewebe bei 4 ° C in 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung aufbewahren.

Ergebnisse

Mit dieser Methode kann Auge embryonalen Huhn vom 8. Tag seiner Entwicklung (HH34) in Vitro für 4 Tage kultiviert werden. Vier Tage in Ovo Entwicklungsstand entspricht HH38.

Diese Kultivierung Methode unterstützt die Entwicklung der Feder Knospen rund um das Auge und an den Augenlidern (Abbildung 1 b). Diese Feder Knospen sind nicht vorhanden in Ovo im HH34 vor der Kultivi...

Diskussion

Dieses Protokoll nutzt etablierten Gewebe züchten Techniken um ein Huhn Auge aus embryonalen Tag 8 (HH34) wachsen in Vitro für 4 Tage. Diese Raster-Kultivierung Methode wurde ursprünglich von Trowell¹⁵beschrieben. Wir optimieren ein Protokoll von Pinto und Halls 1991 Studie¹⁶ unter Verwendung einer halbdurchlässigen Membran mit dem Gitter, induktive Signalübertragung zwischen getrennten Gewebeschichten der embryonalen Auge¹⁵zu studieren. Mit...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
35 mm Petrischalen für Zellkulturen	Corning	353001	griffige Gewebekulturschale, Polystyrol, pyrogenfrei
100 mm Petrischalen für Zellkulturen	Corning	353003	Gewebekulturschale, Polystyrol, pyrogenfreies
Papiergewebe	Kimtech	34155	Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 pro Karton
Drahtgeflecht	n/a	n/a	Edelstahl-Drahtgeflecht (Gittergröße 0,7 mm)
Einweg-Glaspipetten	VWR	14673-010	Borosilikatglas Einweg 5 3/4"
Nährmedium	Gibco	12591-038	Fitton-Jackson Modifikation, [+] L-Glutamin mit Phenolrot (BGJB)
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	10000 Einheiten/ml Penicillin-Streptomycin-Lösung stabilisierter
Filter Papier	Whatman	1454 090	halbporöses Filterpapier 90 mm
befruchtete Hühnereier	Dalhousie University Agricultural College	n/a	kann von lokalen Bauernhöfen bezogen werden
Natriumchlorid (NaCl)	EMD	SX0420-3	Natriumchloridkristalle, Reagenzqualität
1 L Glasflasche	VWR	89000-240	1 L Pyrex autoklavierbare Glasflasche
Ethanol	Fisher Scientific	BP82011	in molekularbiologischer Qualität
	n/a	n/a	Laden gekauft und sterilisiert mit EtOH
Einweg-Rasierklingen	VWR	55411-050	einschneidige industrielle Rasierklingen (chirurgischer Kohlenstoffstahl)
Plastiklöffel	n/a	n/a	im Laden gekauft und sterilisiert mit EtOH-Staubmaske
	3M	n/a	3M 8500 Comfort Mask
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148	Paraformaldehyd, Reagenzqualität, kristallines
neutralgepuffertes	Formalin Fisher Scientific	72210	10% neutral gepuffertes Formalinphosphat
gepufferte Kochsalzlösung (PBS)	n/a	n/a	10X phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH 7,4 (137mM NaCl, 2,5mM KCl, 4,3mM Na2HPO4, 1,4mM KH2PO4)
15 ml Falcon Röhrchen	VWR	21008-216	vorsterilisierte Zentrifugenröhrchen
	Zange FST	n/a	feine Pinzette
Küken Kochsalzlösung	n/a	n/a	0,85 % NaCl
Alufolie	n/a	n/a	Laden gekauft
Papiertuch	n/a	n/a	Laden gekauft