Methodenartikel

Einzelne Zelle Multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-clamp

DOI:

10.3791/57627

⸱

20. Juni 2018

 ,  ,  , 
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt die kritische Schritte und Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, einzelne Zelle multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-Clamp durchzuführen. Diese Technik ist eine einfache und effektive Methode um das Expressionsprofil eines vorgegebenen Satzes Gene aus einer einzigen Zelle zeichnet sich durch Patch-Clamp-Aufnahmen zu analysieren.

Zusammenfassung

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Die Großhirnrinde besteht aus zahlreichen Zelltypen, die verschiedenen morphologische, physiologische und molekulare Eigenschaften ausstellen. Diese Vielfalt behindert einfache Identifizierung und Charakterisierung dieser Zelltypen, Voraussetzungen, um ihre spezifischen Funktionen zu studieren. Dieser Artikel beschreibt das Multiplex-Einzelzelle reversen Transkription Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) Protokoll, das, nach Patch-Clamp-Aufnahme in Scheiben schneiden, ermöglicht gleichzeitig die Expression von Zehntausenden Gene in einer einzelnen Zelle erkennen. Diese einfache Methode kann mit Morphologische Charakterisierung durchgeführt werden und gilt allgemein für die phänotypische Merkmale der verschiedenen Zelltypen und ihre bestimmten zellulären Umgebung, wie z. B. in der Nähe von Blutgefäßen zu bestimmen. Das Prinzip dieses Protokolls ist aufzeichnen eine Zelle mit der Patch-Clamp-Technik, zu ernten und umkehren transkribieren zytoplasmatischen inhaltlich und qualitativ zu erkennen der Ausdruck der einen vordefinierten Satz von Genen durch multiplex-PCR. Es erfordert eine sorgfältige Planung der PCR Zündkapseln und intrazellulären Patch-Clamp-Lösung kompatibel mit RT-PCR. Um eine selektive und zuverlässige Abschrift zu gewährleisten benötigt-Erkennung, diese Technik auch entsprechende Kontrollen von Zytoplasma Ernte zur Verstärkung Schritte. Obwohl hier beschriebenen Vorsichtsmaßnahmen strikt befolgt werden müssen, kann praktisch alle elektrophysiologischen Labor die Multiplex-einzelne Zelle RT-PCR-Technik verwenden.

Einleitung

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Die Großhirnrinde besteht aus zahlreichen Zelltypen in verschiedenen physiologischen Prozessen beteiligt. Ihre Identifizierung und Charakterisierung, eine Voraussetzung für das Verständnis ihrer spezifischen Funktionen können sehr anspruchsvoll sein angesichts der großen morphologische, physiologische und molekulare Vielfalt, die kortikale Zelle Arten1 charakterisiert ,2,3,4.

Einzellige Multiplex-RT-PCR basiert auf der Kombination von Patch-Clamp und RT-PCR-Techniken. Es kann gleichzeitig die Expression von mehr als 30 vordefinierte Genen Elektrophysiologisch identifizierten Zellen5Sonde. Die Einbeziehung eines neuronalen Tracers in der Aufnahme-Pipette weiter ermöglicht die Morphologische Charakterisierung der aufgezeichneten Zellen nach histochemische Offenbarung6,7,8,9, 10. es ist eine sehr nützliche Technik für die Klassifizierung von neuronalen Arten anhand der multivariaten Analyse ihrer phänotypischen Merkmale5,9,10,11,12 ,13,14. Einzelne Zelle Multiplex-RT-PCR eignet sich auch zur Charakterisierung von nicht-neuronalen Zellen wie Astrozyten15,16,17und kann praktisch auf jedem Gehirn Struktur18angewendet werden, 19,20,21,22,23 und Zelle Art, vorausgesetzt, sie können in ganz-Zell Konfiguration aufgenommen werden.

Diese Technik ist sehr praktisch für die Identifizierung von zellulären Quellen bzw. Ziele der Übertragung Systeme7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, vor allem, wenn spezifische Antikörper fehlen. Es stützt sich auf Patch-Clamp-Aufnahmen von visuell identifizierte Zellen29und ermöglicht somit auch die Ausrichtung der Zellen in einem bestimmten zellulären Umgebung8,15,16. Außerdem da die Cytoarchitecture von Hirngewebe in Gehirnscheiben bewahrt wird, ermöglicht dieser Ansatz auch Studie über die anatomischen Verhältnisse der gekennzeichneten Zellen mit neuronalen und nicht-neuronale Elements7,8 , 18.

Da diese Technik durch die Menge des geernteten Zytoplasma und die Effizienz des RT begrenzt ist, kann der Nachweis von mRNA ausgedrückt bei geringen Kopienzahl schwierig sein. Obwohl andere Ansätze, basierend auf RNaseq-Technologie ermöglichen, um das ganze Transkriptom Einzelzellen3,4,30,31, zu analysieren, benötigen sie Hochdurchsatz-teure Sequenzer nicht unbedingt Jedes Labor zur Verfügung. Da die einzelne Zelle Multiplex-RT-PCR Technik Endpunkt PCR verwendet, erfordert es nur allgemein verfügbar Thermocycler. Es kann leicht in Laboratorien ausgestattet mit elektrophysiologischen Setups entwickelt werden und erfordert keine teure Ausrüstung. Es kann innerhalb eines Tages eine Qualitative Analyse des Ausdrucks einen vordefinierten Satz von Genen bereitstellen. So bietet dieser Ansatz eine gute Anbindung an die molekulare Charakterisierung einzelner Zellen in einer schnellen Weise.

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Protokoll

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Alle experimentelle Verfahren unter Verwendung von Tieren wurden durchgeführt in strikter Übereinstimmung mit französischen Regelungen (Code Rural R214/87 bis R214/130) und entsprach den ethischen Richtlinien der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft (86/609/EWG) und der französischen Nationalcharta über die Ethik von Tierversuchen. Alle Protokolle wurden von Charles Darwin-Ethik-Kommission genehmigt und dem französischen Ministerium für Bildung und Forschung (Genehmigung 2015 061011367540) vorgelegt. Die IBPS Tierhaus ist von den französischen Behörden (A75-05-24) akkreditiert.

1. Vorüberlegungen

Hinweis: Um Kontaminationen zu vermeiden, richten Sie sich nach den folgenden Empfehlungen vor Unternehmen einzelne Zelle RT-PCR nach Patch-Clamp.

  1. Verwenden Sie keine Plasmide mit Genen von Interesse im Labor sind eine mögliche Quelle der Verschmutzung.
  2. Reservieren Sie einen Labortisch abseits der Gel-Elektrophorese Raum PCRs vorzubereiten.
  3. Widmen Sie einen Satz von Pipetten und Aerosol beständig Filterspitzen, DNA und RNA bei Konzentrationen unter 1 ng/µL zu manipulieren. Verwenden Sie niemals diese PCR-Produkte zu analysieren.
  4. Verwenden Sie RNase - und DNase-freie Produkte und tragen Sie Handschuhe.
  5. Verwenden Sie spezielle Chemikalien für die Zubereitung von internen Patch-Clamp-Lösungen. Nie mit einem Spatel, sondern eher mit einem Gewicht von Papier zu Pulver zu wiegen.
  6. Verwenden Sie eine dedizierte pH-Elektrode und pH-standard-Lösungen, wie sie eine Quelle der Verschmutzung (z.B.RNase) sein können.
  7. Borosilikatglas Kapillaren zu speichern; 20 µL lang, dünn und flexible Tipps; ein 20 µL mikropipette; eine hausgemachte Expeller (Patch-Clamp Pipette Halter befestigt, eine 10 mL Spritze); 500 µL PCR Tubes; 10 µL Aerosol beständig Filterspitzen; und dünnen Permanentmarker in eine eigene Box (Abbildung 1).

2. besser gekleideteres Design

Hinweis: Multiplex RT-PCR beruht auf zwei Verstärker-Stufen. Während der ersten PCR werden die Gene des Interesses Co verstärkt durch Mischen alle PCR-Primer. Um Abschriften von Einzelzellen zuverlässig zu erkennen, gilt es, effiziente und selektive PCR Primer zu entwerfen. Die Verwendung von geschachtelten (intern) Primer für die zweite Runde der PCR verbessert die Spezifität und die Effizienz der Verstärkung.

  1. Die kuratierten mRNA-Sequenzen der Gene des Interesses an NCBI Reihenfolge Referenzdatenbank32 sowie ihrer Verwandten Familie (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/) abrufen.
    1. Geben Sie den Namen der Gendefekt und die Arten von Interesse als Abfrage, und klicken Sie auf die abgerufenen gewünschte Sequenz.
    2. Um die Analyse auf die kodierende Sequenz der DNA zu beschränken, klicken Sie auf Senden an (oben rechts), und wählen Sie Codierung Sequenzen und FASTA Nukleotid als Format. Dann klicken Sie auf Datei erstellen und speichern Sie die FASTA-Sequenz mit einem ".nt"-Datei-Erweiterung.
  2. Verwenden Sie Ara Software33 (mehrere Ausrichtung Bau & Analyse Workbench) oder jede andere mehrere Alignment-Software um zu die Regionen der Homologie zu bestimmen.
    1. Klicken Sie auf -Datei | Neues Projekt... und wählen Sie DNA als Sequenz. Um die Gensequenzen zu importieren, wählen Sie Sequenz | Importieren Sie Sequenz... und eine ".nt" Datei laden. Wiederholen Sie den Vorgang für alle damit verbundenen Folgen.
    2. Klicken Sie und ziehen Sie alle Sequenzen in der schematischen Fenster die ganzen Sequenzen auswählen.
    3. Die Regionen der Homologie durch Auswählen von Ausrichtung suchen | Suche nach Blöcken... (STRG + S). Wählen Sie im Suchmethode Segment paar überlappen . Passen Sie die Pairwise Cutoff score , auf einen relativ hohen Wert (z.B.1.000) und Min. seqs. pro Block auf die Gesamtzahl der Sequenzen richten Sie aus und klicken auf starten.
    4. Wählen Sie im Fenster erscheinenden Suchergebnis die Ergebnisse mit der Höchstnote MP und klicken Sie auf Link. Wenn kein Ergebnis gefunden wird, verringern Sie die Pairwise score Cutoff und/oder der Min. seqs. pro Block.
    5. Um die Visualisierung von Homologen Regionen zu erleichtern, wählen Sie Ausrichtung | Beschattung | Mittelwert.
    6. Wählen Sie Verknüpfung zwischen Teilen der Sequenzen und wiederholen Sie die Schritte 2.2.3–2.2.4 möglicherweise andere Regionen der Homologie mit einem niedrigeren MP-Score ermitteln.
    7. Um die meisten spezifischen Primer zu erhalten, wählen Sie die Regionen mit den geringsten Sequenzhomologie.
  3. Holen Sie die Sequenzen aller Splice-Varianten zu, und wiederholen Sie die Schritte 2.2.1–2.2.6. Wählen Sie ihre gemeinsamen Regionen für eine Gesamt-Erkennung. Prüfen Sie alternative Kassetten für dedizierte Spleiß Varianten Analysen20,34,35,36.
  4. Richten Sie die mRNA-Sequenzen am Tiermodell Genom mit BLAST37 Genomen (grundlegende lokale Ausrichtung Search Tool) zur Bestimmung der Intron-Exon Struktur der Gene (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
    1. BLAST Maus Genom durch Maus Anklicken auswählen und Hochladen der abgerufenen FASTA Sequenz im Abschnitt Geben Sie Abfrage-Sequenz . Wählen Sie bei der Programmauswahl optimieren für sehr ähnliche Sequenzen (Megadruckwelle), dann klicken Sie auf die Schaltfläche " Explosion ".
    2. Abschnitt " Beschreibungen " wählen Sie die Achse mit der höchsten Identität (bis zu 100 %). Stellen Sie sicher, dass er das Gen des Interesses entspricht wie in Funktionen des Abschnitts Achsen angegeben.
    3. Sortieren Sie die Ausrichtung nach Abfrage die Startposition im gleichen Abschnitt, die Exons Nachfolge der kodierenden Sequenz zu erhalten. Beachten Sie die Anfangs- und Endpositionen der alle Hits, die etwa die Position des Introns auf der Abfrage-Sequenz (Abbildung 2A) entsprechen.
  5. Wählen Sie aus zwei verschiedenen Exons für die Sense und Antisense Primer, cDNA von genomischer DNA (gDNA) Verstärkung anhand eines größenkriteriums (Abbildung 2) leicht zu unterscheiden.
    Hinweis: Die Verstärkung der gDNA kann bei einer niedrigen Frequenz auftreten, wenn der Kern mit dem Zytoplasma geerntet wird. Also unbedingt Intron overspanning Primer-Paaren (Abbildung 2A) zu entwerfen. Bei Intron-weniger Gene ist die Sammlung des Kerns problematisch, da es zu potenziell verwirrende Ergebnisse führen kann. Um dieses Problem zu beheben, enthalten Sie eine Reihe von Grundierungen, die darauf abzielen, eine intronischen Sequenz, die auf das Vorhandensein von gDNA25Sonde verstärken. Wenn die genomische Kontrolle positiv ist, müssen die Ergebnisse für alle Intron-weniger Gene verworfen.
  6. Um eine effiziente Verstärkung zu erreichen, wählen Sie Primer erzeugen Amplifikate mit einer Länge, die im Idealfall umfasste zwischen 200 und 400 Basenpaaren (Abbildung 2).
  7. Um gleichzeitig verschiedene cDNAs während der Multiplex-PCR-Schritt zu verstärken, design-Primer mit einer Länge zwischen 18 und 24 Nukleotide und eine Schmelztemperatur (Tm) zwischen 55 und 60 ° C.
  8. Um die Bildung von Sekundärstrukturen, zu minimieren, die den Ertrag der Verstärkung zu reduzieren, wählen Sie Sinn und Anti-Sense Primer mit minimalen Haarnadel und duplex Längen (Abb. 2 b).
  9. Entwerfen Sie interne Primer anhand der gleichen Kriterien (Schritte 2,5-2,8).
  10. Überprüfen Sie die Spezifität der PCR Primer durch Ausrichten der Primer auf die Referenzdatenbank RNA-Sequenz des Organismus mit einem Nukleotid BLAST.
    1. BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) klicken Sie auf Nukleotid BLAST. Fügen Sie die Sequenz eines Primers in der Abfrage-Sequenz eingeben.
    2. Klicken Sie im Abschnitt Suchgruppe wählen auf andere (nr etc.), wählen Sie Referenz RNA-Sequenzen (Refseq_rna) in die Datenbank -Option und geben Sie den Organismus (z.B., Mus Musculus (Taxid:10090) ), die Analyse auf die gewünschte Art zu beschränken.
    3. Programmauswahl wählen Sie optimieren für ähnliche Sequenzen (Blastn). In den Algorithmus-Parameter reduzieren die Wortgröße bis 7 erhöhen die Chance, Treffer zu erhalten.
  11. Selektive Primer Design, halten Sie nur diejenigen, deren Sequenz hat mindestens 3 Diskrepanzen mit unerwünschten cDNAs wenn möglich.
  12. Bestellen Sie entsalzten Primer bei einer relativ hohen Konzentration (z.B. 200 µM) um sicherzustellen, dass alle externen Primer auf eine Endkonzentration von 1 µM gemischt werden können.

3. Vorbereitung des RT-Reagenzien

  1. 5 x RT-Mix: bereiten Sie sich in RNase-freies Wasser 400 µL RT-Mix Lösung (5 X) mit zufälligen Primern bei 25 µM und dNTPs bei 2,5 mM zu arbeiten. Speichern Sie diese Arbeiten-Mischung als 20 µL-Aliquots in 500 µL Röhren.
  2. 20 x Dithiothreitol (DTT): 1 mL 0,2 M DTT in RNase-freies Wasser vorbereiten und speichern Sie es als 50 µL-Aliquots.
  3. Speichern Sie 2.500 U RNase-Inhibitor (40 U/µL) und 10.000 U der reversen Transkriptase (RTase, 200 U/µL) als 5 µL-Aliquots.
  4. Um eine optimale Qualität der RT Reagenzien zu gewährleisten, speichern Sie die Aliquote bei-80 ° C. Benutzen sie für bis zu 10 Zellen und nur für einen Tag.

(4) PCR-Validierung

  1. Bereiten Sie cDNAs dadurch einer reversen Transkription auf eine relativ große Menge an total RNA (in der Regel 1 µg) extrahiert38 aus der Struktur von Interesse.
    1. Verwenden Sie spezielle Pipetten nicht, um einzelne Zelle RT-PCR für diese vorbereitende Schritte aber die RNase-freie Pipetten verwenden. Gesamt-RNS bis 1 µg/µL zu verdünnen.
    2. Fügen Sie in einem 500 µL PCR-Röhrchen 1 µL verdünnter Gesamt-RNS und 8 µL RNase-freies Wasser hinzu. Bei 95 ° C für 1 min denaturieren und das Rohr auf Eis abkühlen.
    3. Fügen Sie 4 µL RT 5 X Puffer vom Hersteller gelieferten, 4 µL RT-Mix-Lösung 1 µL RTase, 1 µL RNase-Inhibitor und 1 µL 200 mM DTT (siehe Abschnitt 3).
    4. Wechseln Sie das Rohr, drehen Sie es, und über Nacht bei 37 ° c inkubieren
    5. Speichern Sie die cDNAs bei-80 ° C bis zu mehreren Jahren. Bereiten Sie eine Aliquote cDNAs verdünnt bis 1 ng/µL Gesamt RNAs äquivalente.
  2. Mischen Sie und verdünnen Sie jedes Primerpaar bei 1 µM mit den Pipetten gewidmet Einzelzelle RT-PCR. Verwenden Sie 20 µL jeder Grundierung-Mix für 100 µL PCRs.
  3. Auf dem Eis bereiten für jede Primerpaar eine Vormischung mit: Wasser (q.s., 80 µL), 10 µL 10-fach Puffer, 1 µL von 100 X dNTPs (50 µM), 500 – 1000 Pg cDNA 1 ng/µL verdünnt und 0.5 µL Taq Polymerase (2.5 U, 5 U/µL).
  4. Verwenden Sie PCR-Röhren, die die Brunnen der PCR-Maschine für eine optimale Temperaturregelung eng Anliegen. Tropfen Sie 2 (~ 100 µL) von Mineralöl auf die Vormischung ohne Berührung der Wand oder der GAP der PCR-Röhre.
  5. Um die Bildung von Primer-Dimere zu minimieren, führen Sie einen Heißstart indem man die PCR-Röhrchen in den Thermocycler bei 95 ° c vorgewärmt Nach 30 s, 20 µL der Grundierung Mischung auf das Öl schnell zu vertreiben.
  6. Nach 3 min bei 95 ° C laufen 40 Zyklen (95 ° C, 30 s, 60 ° C, 30 s; 72 ° C, 35 s) gefolgt von einer endgültigen Dehnung Schritt bei 72 ° C für 5 min.
  7. Analysieren Sie 10 µL jeder PCR-Produkte von Agarose-Gel-Elektrophorese (2 %, Gewicht/Volumen)39. Wenn einige PCR-Produkte nicht die erwartete Größe verfügen, Re-design anderen Primer (siehe Abschnitt 2).
    Achtung: Interkalation bromid ist eine intercalating Chemikalie, die DNA-Mutationen auslösen kann. Wenden Sie sich an der lokalen Sicherheit Büro, bevor Sie es verwenden. Tragen Sie immer Handschuhe, wenn es zu manipulieren. Verwenden Sie eine handelsübliche Lösung Interkalation Bromid (10 mg/mL) Lösung statt Pulver zur Minimierung des Risikos der Inhalation. UV-Licht kann ebenso schädlich sein, so stellen Sie sicher, UV-Schutz-Schutzbrille oder eine Maske tragen. Zurücktreten Sie, verschmutzte Gele, Tipps, Handschuhe und Puffer in Containern Interkalation Abfälle gewidmet.
  8. Nachdem alle Primer Paare einzeln validiert wurden, testen Sie die Multiplex-Protokoll (Abbildung 3).
    1. Mischen Sie und verdünnen Sie alle externen Primer zusammen auf 1 µM. Store die multiplex Primer bei-20 ° C bis zu mehreren Wochen zu mischen.
    2. Auf dem Eis, bereiten eine Vormischung mit: Wasser (q.s., 80 µL), 10 µL 10-fach Puffer, 100 X dNTPs (jeweils 50 µM) 1 µL, 500 – 1.000 Pg cDNAs verdünnt 1 ng/µL und 0.5 µL Taq Polymerase (2.5 U, 5 U/µL).
    3. Streichen Sie das PCR-Röhrchen, drehen Sie es und fügen Sie zwei Tropfen (~ 100 µL) von Mineralöl.
    4. Führen Sie einen Heißstart, wie unter Punkt 4.5 mit 20 µL des Multiplex-Grundierung-Mix beschrieben. Laufen Sie nach 3 min bei 95 ° C 20 PCR-Zyklen, die identisch mit denen der Schritt 4.6.
    5. Bereiten Sie eine Reihe von PCR Schläuche identisch mit der Anzahl von Genen zu analysieren. Bereiten Sie eine Vormischung wie in Schritt 4.8.2, aber mit 1 µL das erste PCR-Produkt pro gen als Vorlage. Passen Sie die Mengen entsprechend der Anzahl der Gene zu analysieren und zu 10 % mehr Volumen zu pipettieren Fehler kompensieren in Betracht.
    6. Leicht schütteln, drehen Sie das Rohr, Versand 80 µL der Vormischung in jedem PCR-Röhrchen, und fügen Sie zwei Tropfen (~ 100 µL) Mineralöl pro Röhre ohne Berührung der Wand oder der GAP der Rohre.
    7. Führen Sie eine heiße beginnen (siehe Punkt 4.5) durch Ausweisung 20 µL des internen Grundierung-Mix in Schritt 4.2 vorbereitet. Laufen Sie identisch mit Schritt 4.6 35 PCR-Zyklen.
    8. Analysieren Sie die zweite PCR-Produkte von Agarose-Gelelektrophorese. Stellen Sie sicher, dass jeder zweite PCR eine Amplifikate der erwarteten Größe erzeugt. Im Falle einer ineffizienten oder unspezifische Amplifikationen, Re-design neue Primer (Schritte 2,5 – 2.12) und überprüfen sie (Schritte 4.2-4.8).

5. Vorbereitung und Überprüfung der intrazellulären Patch-Clamp-Lösung

Hinweis: Das folgende Protokoll beschreibt die Erstellung und Validierung von einer K+-/gluconate-basierte interne Lösung, aber praktisch jede Art von Patch-Clamp-Lösung kann verwendet werden, solange es die Effizienz der RT-PCR nicht behindert wird. Tragen von Handschuhen ist Pflicht, eine RNase-freie interne Lösung zu erhalten.

  1. Bereiten Sie 60 mL der internen Patch-Clamp Aufzeichnungslösung aus dem Stegreif 10 mL 0,1 M KOH.
  2. 11,4 mg der EGTA (endgültige 0,5 mM) in 0,9 mL 0,1 M KOH auflösen.
  3. 40 mL RNase-freies Wasser und lösen Sie 2,02 g K-Gluconat 144 mM (final), 143 mg HEPES (Letzte 10 mM) und 180 µL 1 M MgCl2 (letzte 3 mM).
  4. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 durch Zugabe von ~ 6 mL 0,1 M KOH.
  5. Passen Sie die Osmolarität zu 295 mOsm mit ~ 13 mL RNase-freies Wasser.
  6. Da die interne Lösung auch als Puffer für die reverse Transkription verwendet wird, kontrollieren Sie sorgfältig Mg2 + Konzentration. Kompensieren Sie eine geringere Mg2 + Konzentration in der internen Lösung durch Zugabe von MgCl2 danach um eine Endkonzentration von 2 mM in der RT-Reaktion zu erreichen.
  7. Fügen Sie 2 – 5 mg/mL der RNase-freie Biocytin um die geernteten Zelle nach Patch-Clamp-Aufnahme zu beschriften hinzu, die interne Lösung beschriebenen (Schritte 5.1-5.5).
  8. Filtern Sie (0,22 µm Porengröße) die interne Lösung und Lagern Sie so 100 – 250 µL Aliquots bei-80 ° C.
  9. Um die Nutzung der internen Lösung für einzellige RT-PCR zu validieren, 0,5 µL Gesamt RNAs 1 ng/µL, 6 µL der Patch-Clamp-Lösung verdünnt und lassen Sie es auf der Bank für ca. 30 min.
  10. Mit einer Mikropipette 2 µL hinzufügen 2 µL 5 x 0,5 µL RT-Mix, 0,5 µL 20 X DDT und 0,5 µL RNase-Inhibitor RTase, und über Nacht bei 37 ° c inkubieren
  11. Drehen Sie das Rohr. Fügen Sie auf dem Eis Wasser (q.s., 80 µL), 10 µL 10-fach Puffer und 0.5 µL Taq Polymerase (2.5 U, 5 U/µL).
  12. Führen Sie 40 Zyklen der PCR unter Verwendung eines Satzes von validierten Primern (Schritte 4,4-4,6).
  13. Analysieren Sie die PCR-Produkte durch Agarose-Gelelektrophorese (siehe Punkt 4.7) und stellen Sie sicher, dass sie die erwartete Größe haben.
    Hinweis: Das Weglassen der 0,5 µL Gesamt-RNS und ersetzt sie durch 0,5 µL RNase-freies Wasser werden sichergestellt, dass die interne Lösung frei von RNA bzw. DNA-Kontaminationen ist.

6. akute Slice-Vorbereitung

Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt das Slice Verfahren für Jugendliche (d.h.weniger als 28 Tage postnatale) männlichen und weiblichen Mäusen. Andere Lösungen, wie Saccharose-basierten künstlichen Liquor cerebrospinalis (ACFS) sind ebenfalls verwendbar40.

  1. Bereiten Sie 2 L ACFS enthält (in mM) 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 Nahco33, 10 Glukose und 15 Saccharose. Um glutamatergen Aktivität während der Vorbereitung der Scheibe zu reduzieren, bereiten Sie eine Cutting-Lösung durch Zugabe von 1 mM der Kynurenic Säure.
  2. Vor dem Aufschneiden, bereiten Sie ein Dissektion Set, chirurgische Scheren, feine Iris-Schere, zwei Spatel, Zange, einer Disc mit Papierfilter und Cyanacrylat-Klebstoff.
  3. Verwenden Sie eiskalte Lösung gesättigt mit O2Co2 (95 % / 5 %) und Abkühlen der Schneidekammer bei-20 ° C.
  4. Betäuben Sie die Maus mit einem kleinen Papiertuch mit Isofluran getränkt. Stellen Sie nach ~ 2 min sicher, dass die Maus Tiefe Narkose durch die Überprüfung keine Antwort erhalten, Prise Pfote.
  5. Enthaupten Sie schnell die Maus. Entfernen Sie die Kopfhaut und öffnen Sie den Schädel zu. Extrahieren Sie das Gehirn sorgfältig und legen Sie sie in einen kleinen Becher mit eiskalten (~ 4 ° C)-Cutting-Lösung mit O2Co2Sauerstoff gefüllt.
  6. Entfernen Sie die Schneidkammer von-20 ° C Bedingungen und Feuchtigkeit mit einem Papiertuch.
  7. Untersuchen Sie sorgfältig das Gehirn des Interessenbereichs zu isolieren, auf die Schneidkammer kleben und eiskalte Schneidlösung Sauerstoff mit O2Co2hinzufügen.
  8. Geschnitten Sie 300 µm dicke Scheiben mit einem Vibratome. Übertragen Sie sie bei Raumtemperatur in einer ruhenden Kammer mit Sauerstoff angereichertes Schneidlösung gefüllt und lassen sie mindestens 0,5 h wiederherstellen.

7. einzelne Zelle RT-PCR nach der Patch-Clamp-Aufnahme

  1. Reinigen Sie die Perfusion System regelmäßig mit ~ 100 mL 30 % H2O2 Lösung und spülen Sie ausgiebig mit ~ 500 mL destilliertem Wasser auf das Wachstum von Bakterien zu vermeiden, da es eine übersehene Quelle der RNase Kontamination.
  2. Chloren Sie das Filament mit einer Patch-Pipette gefüllt mit konzentriertem Bleichmittel Ernte täglich. Verwenden Sie eine Mikropipette nicht die Patch-Pipette, sondern eher eine 20 µL langen, feinen, flexiblen Spitze befestigt eine 1 mL Spritze füllen. Dann ausgiebig mit RNase freies Wasser spülen Sie und trocknen Sie sie mit einem Gas-Staubtuch.
  3. Bereiten Sie eine kleine Box mit 5 x RT-Mix und 20 X DTT Aliquote Eis. Speichern der RTase und RNase-Inhibitor Aliquote bei-20 ° C in einem Benchtop Kühler.
  4. Übertragen Sie ein Stück in die Aufnahme Kammer bei 1 – 2 mL/min mit Sauerstoff angereichertes ACFS durchblutet.
  5. Ziehen Sie Patch Pipetten (1 – 2 µm öffnen Spitzendurchmesser, 3 – 5 MΩ) aus Borosilikatglas mit Handschuhen und füllen Sie einer von ihnen mit 8 μL der internen Lösung. Denken Sie daran, dass die Knöpfe von der Pipette Abzieher RNase Kontaminationsquelle sind.
  6. Stellen Sie die Pipette in die Pipette Halterung, während neue Handschuhe tragen und nicht das Filament mit den Fingern zu berühren.
  7. Nähern Sie die Patch-Pipette mit einem Überdruck zu und führen Sie ganze Zelle Aufnahme zur Charakterisierung der gezielte Zelle (Abbildung 4).
  8. Zur Wahrung der mRNAs begrenzen Sie die Zeit in ganz-Zell Konfiguration bis 20 min41.
  9. Am Ende der Aufnahme, bereiten Sie eine 500 µL PCR Rohr gefüllt mit 2 µL 5 x RT Mix 0,5 µL 20 X DTT, drehen Sie es und speichern Sie es auf dem Eis.
  10. Ernten Sie die Zelle Zytoplasma durch einen negativen Druck (Abbildung 4). Visuell-Steuerelement, das den Zellinhalt in die Pipette kommt, und gleichzeitig eine gute Abdichtung.
    1. Vermeiden Sie so weit wie möglich den Kern zu sammeln, wenn einige Gene Intron-weniger gelten. In einem solchen Fall immer enthalten Sie eine Reihe von Primer zur Verstärkung gDNA für genomische Kontamination zu untersuchen.
    2. Wenn der Kern in der Nähe der Pipettenspitze kommt, lassen Sie den negativen Druck und bewegen Sie die Pipette entfernt den Kern. Sicherzustellen Sie, dass die Abdichtung erhalten bleibt und neu starten Sie, um das Zytoplasma am neuen Standort der Pipette zu sammeln.
  11. Der Ernte wenn kein weiteres Material kommt und/oder vor dem Verlust der Abdichtung zu stoppen.
  12. Zurückzuziehen Sie die Pipette vorsichtig, um eine außen-Out Patch, Kontamination durch die extrazelluläre Ablagerungen (Abbildung 4) zu begrenzen und zu Gunsten die Schließung der Zellmembran für nachfolgende histochemische Analysen bilden.
  13. Denken Sie daran, dass Knöpfe, Mikromanipulatoren, Computertastatur, oder Computer-Maus sind mögliche Quellen von RNase Kontamination. Wenn sie während der Aufnahme berührt gewesen sein, ändern Sie Handschuhe.
  14. Legen Sie die Pipette auf die Expeller und vertreiben Sie seinen Inhalt in das PCR-Röhrchen zu, durch einen positiven Druck (Abbildung 1).
  15. Brechen Sie die PIPETTENSPITZE in die PCR-Röhre, die Sammlung des Inhalts zu helfen.
  16. Kurz Zentrifugieren Sie das Rohr, dazugeben Sie 0,5 µL RNase-Inhibitor und 0,5 µL RTase, mischen Sie vorsichtig, Zentrifugieren Sie wieder und über Nacht bei 37 ° c inkubieren
  17. Drehen Sie das Rohr und bei-80 ° C bis zu mehreren Monaten bis zur PCR Analyse zu speichern.
  18. Durchführen Sie den ersten Verstärkung Schritt direkt in die Röhrchen mit ~ 10 µL RT-Produkte durch Zugabe von Wasser (q.s., 80 µL), 10 µL 10 X Puffer und 0.5 µL Taq Polymerase (2.5 U). Dann folgen Sie den Anweisungen in 4.8.2–4.8.8 Schritten beschrieben.

8. histochemische Färbung der aufgezeichneten Zelle (Optional)

  1. Im Anschluss an die elektrophysiologischen Aufnahmen halten Sie Stück für 20 min in sauerstoffhaltigen ACFS ermöglicht die Diffusion von Biocytin in der axonalen und dendritische Struktur.
  2. Legen Sie die Scheibe in einem Brunnen von einer 24-Well-Platte und befestigen es über Nacht bei 4 ° C mit 1 mL 4 % Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer.
  3. Waschen Sie die Scheiben 4 Mal, jeweils 5 min mit 1 mL Phosphat Buffered Saline (PBS).
  4. In der gleichen, permeabilize und sättigen die Scheibe während 1 h bei Raumtemperatur mit 1 mL PBS mit 0,25 % Triton x-100 und 0,2 % Gelatine aus kaltem Wasser Fischhaut (PBS-GT) ergänzt.
  5. Brüten Sie über Nacht mit einem eindringmittel beschrifteten Avidin verdünnt 1/400 in 250 – 500 µL PBS-GT.
  6. Waschen 5 mal 5 min jeweils mit 1 mL PBS und montieren Sie die Scheiben.

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Ergebnisse

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Eine repräsentative Validierung der Multiplex-RT-PCR ist in Abbildung 3dargestellt. Das Protokoll wurde entwickelt, um gleichzeitig die Expression von 12 verschiedenen Genen Sonde. Die vesikuläre Glutamat Transporter vGluT1 wurde als Positivkontrolle für glutamatergen Neuronen42übernommen. Die GABA-Synthese von Enzymen (GAD65 und GAD-67), NEUROPEPTID Y (NPY) und Somatostatin (SOM) dienten als Marker der Gabaergen Interneuronen

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Diskussion

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Einzelne Zelle Multiplex-RT-PCR nach Patch-Clamp zuverlässig und gleichzeitig die Expression von mehr als 30 Genen Elektrophysiologisch identifizierten Zellen5Sonde kann. Analyse der Genexpression auf der Ebene der einzelnen Zelle erfordert hocheffiziente PCR-Primer. Eine der am meisten einschränkenden Maßnahmen ist Sammlung des Zellinhalts. Seine Wirksamkeit hängt vom Durchmesser des Patch-PIPETTENSPITZE, die so groß wie möglich sein muss, während die passende Größe der Zellen. Pipetten mit einem...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Wir danken Dr. Alexandre Mourot für seine Bemerkungen über das Manuskript. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von der Agence Nationale De La Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 und ANR-17-CE37-0010-03), BLG wird von der Fondation Pour la Recherche Sur Alzheimer-Stipendium unterstützt. Wir danken der Tierstation IBPS (Paris, Frankreich).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MACAW v.2.0.5NCBIMehrfachausrichtung für das Primer-Design
DithiothreitolVWR443852ART
Zufällige PrimerSigma-Aldrich (Merck)11034731001RT
dNTPsGE Healthcare Life Sciences28-4065-52RT und PCR
RNasin Ribonuklease-InhibitorenPromegaN2511RT
SuperScript II Reverse TranskriptaseInvitrogen18064014RT
Taq DNA PolymeraseQiagen201205PCR
MineralölSigma-Aldrich (Merck)M5904-5MLPCR
PCR PrimerSigma-Aldrich (Merck)PCR / entsalzt und verdünnt bei 200 & Mikro; M
Röhrchen, 0,5 mL, flacher VerschlussThermoFisher ScientificAB0350RT und PCR
BT10 Serie - 10 & Mikro; L FilterspitzeNeptune ScientificBT10RT und PCR
BT20 Serie - 20 & Mikro; L FilterspitzeNeptune ScientificBT20RT und PCR
BT200 Serie - 200 & Mikro; L FilterspitzeNeptune ScientificBT200RT und PCR
BT1000 Serie - 1000 & Mikro; L FilterspitzeNeptune ScientificBT1000.96RT und PCR
DNA Thermal CylcerPerkin Elmer CetusPCR
EthidiumbromidSigma-Aldrich (Merck)E1510-10MLAgarose-Gelelektrophorese
Tris-Borat-EDTA-PufferSigma-Aldrich (Merck)T4415-1LAgarose-Gelelektrophorese
UltraPureAgarose Life Technologies16500-500Agarose-Gelelektrophorese
& Phi; X174 DNA-Hae III DigestNEB (New England BioLabs)N3026SAgarose-Gelelektrophorese
EDA 290KodakAgarose-Gelelektrophorese
Elektrophorese Stromversorgung EPS 3500Pharmacia BiotechAgarose-Gelelektrophorese
Midi Horizontale Elektrophoreseeinheit Modell SHU13Sigma-Aldrich (Merck)Agarose-Gelelektrophorese
Glattes Papier mit satinierter OptikFisherbrand1748BPatchklemme innere Lösung
KaliumhydroxydeSigma-Aldrich (Merck)60377Patchklemme innere Lösung
Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraessigsäureSigma-Aldrich (Merck)E3889Patchklemme innere Lösung
HEPESSigma-Aldrich (Merck)H4034Patch-Klemme innere Lösung
Kalium-D-gluconatSigma-Aldrich (Merck)G4500Patch-Klemme innere Lösung
Magnesiumchlorid-LösungSigma-Aldrich (Merck)M1028Patch-Klemme innere Lösung
5500 DampfdruckosmometerWescorPatch-Klemme innere Lösung
BiocytinSigma-Aldrich (Merck)B4261Patch-Klemme interne Lösung
SaccharoseSigma-Aldrich (Merck)S5016Schnittvorbereitung
D-(+)-GlukosemonohydratSigma-Aldrich (Merck)49159Schnittvorbereitung
NatriumchloridSigma-Aldrich (Merck)S6191Schnittvorbereitung
KaliumchloridSigma-Aldrich (Merck)60128Schnittvorbereitung
NatriumbicarbonatSigma-Aldrich (Merck)31437-MSchnittvorbereitung
Natriumphosphat monobasischSigma-Aldrich (Merck)S5011Schnittvorbereitung
MagnesiumchloridlösungSigma-Aldrich (Merck)63069Schnittvorbereitung
CalciumchloridlösungSigma-Aldrich (Merck)21115Schnittvorbereitung
KynurensäureSigma-Aldrich (Merck)K3375Schnittvorbereitung
IsofluranPiramal Healthcare UKSchnittvorbereitung
VT 1000SLeica Biosystems14047235613Schnittvorbereitung
WasserstoffperoxidlösungSigma-Aldrich (Merck)H1009Patch Clamp Setup Reinigung
Dünnwandige Glaskapillaren mit FilamentWorld Precision InstrumentsTW150F-4Patch Clamp
PP-83NarishigePatch Clamp
Eppendorf MicroloaderEppendorf5242956003Patch Clamp
BX51WI UprightMikroskop OlympusPatch Clamp
XC-ST70/CE CCD S/W VIDEOKAMERASonyPatch Clamp
Axopatch 200B VerstärkerMolecular DevicesPatch Clamp
Digidata 1440Molecular DevicesPatch Clamp
pCLAMP 10 Software-SuiteMolecular DevicesPatch Clamp
10 mL SpritzeTerumoSS-10ESAustreiben
E-Serie mit geradem Körper (Halter)Phymep64-0997Austreiben
Natriumphosphat zweibasischSigma-Aldrich (Merck)S7907Histochemische Offenbarung
Natriumphosphat monobasischSigma-Aldrich (Merck)S8282Histochemische Offenbarung
ParaformaldehydSigma-Aldrich (Merck)P6148Histochemische Offenbarung
Triton X-100Sigma-Aldrich (Merck)X100Histochemische Offenbarung
Gelatine aus KaltwasserfischhautSigma-Aldrich (Merck)G7041Histochemische Offenbarung
Streptavidin, Alexa Fluor 488 KonjugatThermoFisher ScientificS11223Histochemische Offenbarung
24-Well-PlatteGreiner Bio-One662160Histochemische Offenbarung
der von

Referenzen

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Einzelzell RT PCRPatch Clamp AbleitungMultiplex PCRZytoplasmagewinnungGenexpressionsanalyseHot Start PCRAgarose GelelektrophoreseHerstellungs von Hirnschnittenelektrophysiologische Ableitung

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