Vorsprung-Kraft-Mikroskopie: Eine Methode, um Kräfte entwickelt von Zelle Vorsprünge zu quantifizieren

Zusammenfassung

Hier zeigen wir die experimentellen Techniken verwendet, um den Vorsprung Kräfte auszuwerten, die Podosomes auf einem konformen Film, von der Vorbereitung des Films für die automatisierte Analyse von topographische Bilder gelten.

Zusammenfassung

In zahlreichen biologischen zusammenhängen müssen tierische Zellen physisch mit ihrer Umgebung interagieren durch mechanische Kräfte zu entwickeln. Unter diesen Zugkräfte gut charakterisierten gewesen, aber es fehlt an Techniken ermöglichen die Messung der Kräfte, Vorsprung durch Zellen orthogonal zu ihrem Substrat. Wir entwarfen eine Versuchsanordnung, die Kräfte, Vorsprung durch adhärente Zellen auf ihrem Substrat zu messen. Zellen, die auf einem kompatiblen Formvar Blatt vergoldet verformen dieses Substrat und die daraus resultierende Topographie wird durch Rasterkraftmikroskopie (AFM) auf der Nanometerskala zugeordnet. Kraftwerte werden dann von einer Analyse der Verformung Profil basierend auf der Geometrie der hervorstehende zellulären Strukturen extrahiert. Daher können die Kräfte, die von den einzelnen hervorstehenden Einheiten einer lebenden Zelle im Laufe der Zeit gemessen werden. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Krafterzeugung und deren Regulierung in viele zelluläre Prozesse, die mit Vorsprung. Hier beschreiben wir ihre Anwendung auf die hervorstehende Kräfte erzeugte Podosomes gebildet durch menschliche Makrophagen zu messen.

Einleitung

Tierische Zellen interagieren körperlich mit der Matrix und den anderen Zellen, die ihre Umwelt¹darstellen. Dies ist erforderlich für sie zu migrieren, Körper zu verinnerlichen, externe Informationen zu erwerben oder zu unterscheiden. In solchen Prozessen muss die Zelle mechanische Kräfte erzeugen, und wie in den letzten Jahren zahlreiche Studien gezeigt haben, beeinflusst die Fähigkeit einer Zelle zu erzeugen Kräfte und seiner Umgebung Sonde sein biologische Verhalten, Regie zum Beispiel Verbreitung oder Differenzierung-^2,-³. Die Messung von zellulären Kräften ist wiederum eine große Hilfe für die Regulierung der Truppenaufstellung zu studieren und verstehen seine Auswirkung in Zelle Verhalten und Gewebe Schicksal^4,5.

Den letzten Jahren erlebt haben die Entwicklung von zahlreichen Techniken, um die Kräfte zu messen, die eine Zelle auf seine Umwelt⁶ausüben kann. Die meisten davon haben maßgeblich bei der Enthüllung, dass die Traktion erzwingt, dass Zellen ausüben, wie sie auf mobile Sonden oder einem verformbaren Untergrund ziehen. Jedoch die mechanischen Kräfte beteiligt Vorwölbung in die extrazellulären Umwelt leiden unter einem Mangel an Messtechniken und sind bis heute nicht gut charakterisiert.

Um diese Einschränkung zu umgehen, stellen wir Ihnen eine Methode zur Messung der Kräfte, die orthogonal zum Substrat. Es besteht in der Beschichtung von lebenden Zellen auf eine dünne elastische Folie, die in Richtung orthogonal, die es ermöglichen, Substrat Verformung von Zellen zu messen und daraus die beteiligten Kräfte verformen kann. Substrat Topographie mit nanoskaligen Auflösung mit Rasterkraftmikroskopie gemessen und die Bewertung der Kräfte von Verformung stützt sich auf das Wissen um die Geometrie der hervorstehende Zellstrukturen^{7,8, 9}.

Hier beschreiben wir die Einrichtung und ihre Anwendung auf die erzeugte Podosomes, hervorstehende Adhäsion Strukturen gebildet durch Makrophagen für ihre mesenchymalen Migration in dreidimensionalen Umgebungen^{10,11Kräfte zu messen, 12,13,14,15,16,17}. Wir glauben, dass diese Technik die Krafterzeugung und deren Regulierung in viele zelluläre Prozesse, die mit Vorsprung verstehen wird.

Protokoll

1. Vorbereitung des Formvar-beschichtete Netze

1. Reinigen Sie Raster-Elektronen-Mikroskopie mit Aceton und trocknen Sie sie auf Filterpapier. Reinigen Sie anschließend einen Objektträger mit reinem Ethanol, mit einem Objektiv-Papier wischen Sie ab und entfernen Sie den Staub mit einem Gebläse.
2. Stellen Sie eine Folie mit Ethanol gereinigt Glas senkrecht in den Trichter eines Film-Casting-Gerätes mit einer Lösung von Formvar im unteren Teil. Decken Sie die Spitze des Trichters.
3. Pumpen Sie Formvar Lösung (0,5 % Ethylen Paraquatdichlorid) 100 mL mit Zerstäuber Birne, bis die zwei Drittel der Folie erreicht.
4. Halten Sie die Folie in die Lösung für 1 min.
5. Öffnen Sie das Ventil des Geräts, um die Formvar-Lösung in einem stetigen Strom abtropfen lassen. Ein Volumenstrom von 10 bis 15 mL/s wird einen Formvar Film von 30-80 nm ergeben. Die Dicke der Folie richtet sich nach der Konzentration der Lösung Formvar und die Entwässerung.
   Hinweis: Die Entwässerung-Rate kann durch entlüften der Druck über das Ventil Luft-Out durch langsames Öffnen des Ventils gesteuert werden. Je schneller die Entwässerung, je dicker die Folie. In der Praxis weil es schwierig ist, vorherzusagen, die Schichtdicke von Formvar Strömungsgeschwindigkeit, wir bereiten mehrere Chargen Formvar Filme und steuern ihre Stärke von AFM (siehe Schritt2).
6. Entfernen Sie die Folie aus der Kammer und trocknen Sie es vorsichtig auf Filterpapier, flüssigen Formvar zu entfernen.
7. Schneiden Sie ein Rechteck 20 x 50 mm aus dem Formvar Film mit einer Rasierklinge.
8. Ein Becherglas mit destilliertem Wasser füllen und langsam Tauchen die Folie senkrecht ins Wasser schweben aus dem Film: der Film sollte auf der Wasseroberfläche schweben.
9. Ort trocken Aceton gereinigt Raster auf dem Film, glänzende stellen.
10. Legen Sie eine Runde Glas-Deckglas (Ø 12 mm) auf ein paar der Netze. Das Deckglas wird dazu dienen, die Schichtdicke zu messen (siehe Schritt2).
11. Decken Sie einen Objektträger mit einem weißen Aufkleber geändert, um es zu passen. Tauchen Sie die Folie vertikal an der Grenze des schwimmenden Formvar Films, bis der ganze Film auf die Folie haftet. Entfernen Sie überschüssiges Wasser aus der Folie mit Filterpapier und über Nacht bei Raumtemperatur trocknen lassen.

2. Messung der Schichtdicke

1. Schneiden Sie Formvar um das Deckglas mit Pinzette, um es von der Folie lösen.
2. Markieren Sie die Position des Rasters unter dem Deckglas mit einem Stift.
3. Schneiden Sie die Formvar rund um den markierten Gitter um es von dem Deckglas zu lösen. Daher werden ein Loch in die verbleibenden Formvar Blatt, die es erlauben Ihnen, um die Schichtdicke zu messen. Decken Sie das Deckglas mit PBS zu und legen Sie es auf einen Glasobjektträger am Mikroskop.
4. Montieren Sie ein Silizium-Nitrid-Freischwinger auf dem AFM Glasblock, sicherstellen, dass die goldenen Streifen, die Spitze der Feder nicht gedeckt ist.
   Hinweis: Die Empfindlichkeit und die Federkonstante des nadelträgers sollte vorher mit PBS-Puffer kalibriert haben.
5. Montieren Sie den Glasblock auf das AFM-Modul, und platzieren Sie das Modul auf das Mikroskop.
6. Die Beobachtung Kammer legen Sie Formvar beschichteten deckgläschen auf und bedecken Sie es mit 500 µL PBS.
7. Scannen Sie die Grenze des Lochs in der Formvar Blatt mit AFM in Kontakt-Modus und einem 0,5 nN Kraft-Sollwert.
8. Verwenden Sie die Glasoberfläche Deckglas als Referenz für Höhenmessungen und bewerten die Formvar Dicke wie die Höhe des Querschnitts (mindestens 10 Messungen pro Formvar Charge).

3. Aussaat Zellen auf Gittern

1. Unter einer sterilen Haube legte einen Streifen (12 x 3 mm) doppelseitiges Klebeband auf einem deckgläschen.
2. Schneiden Sie ein Raster Formvar beschichtet mit einer Pinzette und legte es kopfüber auf den Klebestreifen (nur der Rand des Rasters muss das Band befestigt werden). Der Formvar Film muss das Deckglas konfrontiert.
3. Setzen Sie dieses Gerät in einer Kultur gut.
4. Platzieren Sie ein 10 µL Tröpfchen von RPMI ohne FCS mit 10⁴ Makrophagen differenziert aus menschlichen Monozyten¹⁶.
   Hinweis: Stellen Sie sicher nicht, berühren Sie das Gitter mit der Pipettenspitze beschädigen die Formvar Beschichtung zu verhindern.
5. Inkubieren Sie für 30 min (37 ° C, 5 % CO₂) Zellen haften zu lassen.
6. Füllen Sie den Brunnen mit 2 mL RPMI mit 10 % FCS.
7. Inkubieren Sie das Gerät für 2 h bei 37 ° C und 5 % CO₂ Zellen vor AFM Beobachtung halten zu lassen.

(4) Topographie Messungen der Podosome-induzierten Verformungen

1. Ein Glasboden Petrischale zwei Streifen verdoppelt doppelseitigen Klebeband aufkleben.
   Hinweis: Der Abstand zwischen den beiden Streifen sollte kleiner als der Durchmesser des Rasters.
2. Trennen Sie sorgfältig das Raster mit Makrophagen vom Klebeband überzogen.
3. Umdrehen Sie die Gitter um die Zellen mit Blick auf das Glas und kleben Sie das Netz zwischen den zwei Klebestreifen.
4. Fix das Raster mit zwei neu verdoppelt doppelseitigen Klebstoff Streifen: Raster wird somit zwischen zwei Klebestreifen, verlassen den zentralen Bereich des Rasters für die AFM-Spitze eingeklemmt werden.
   Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Gitter gut befestigt und nicht verdreht; ansonsten der AFM Cantilever nähern sich die Formvar Oberfläche möglicherweise nicht.
5. Füllen Sie die Petrischale mit 2 mL Kulturmedium vorgewärmten 37 ° C (RPMI mit 10 % FCS) mit 10 mM HEPES (pH 7,4) ergänzt.
6. Ort der Kulturschale auf 37 ° C Schale Heizung.
7. Der Teller wärmer wird auf der AFM-Bühne.
8. Lassen Sie das System stabilisieren bei 37 ° C.
9. Im Kontakt-Modus mit einer 0,5 nN Kraft einen ersten globalen Bild, Podosomes zu finden, und dann Scannen Formvar Topographie bei 3 Hz mit einer ca. 20 nm große Pixel.
   Hinweis: Vermeiden Sie Scannen am Rand des Rasters.

Ergebnisse

Das obige Protokoll beschreibt die Vorbereitung der Versuchsaufbau, Vorwölbung Krafteinwirkung durch Makrophagen Podosomes auf einem Formvar Substrat zu quantifizieren. Dies erfolgt über AFM und in Abbildung 1dargestellt ist.

Bei der Analyse der topographischen Bild Ausbuchtungen unter Podosomes mit JPK Datenverarbeitungs-Software sollte ein dritten Grades Polynom passen jede Scanzeile unabhängig vo...

Diskussion

Materialeigenschaften

Die Wahl des Materials für die verformbare Membran, in unserem Fall Formvar, muss einige Voraussetzungen erfüllen. Das Material muss für sichtbares Licht transparent sein und weisen begrenzt Auto-Fluoreszenz um Beobachtungen im Hellfeld und Fluoreszenz-Mikroskopie erlauben. Die Rauheit des dünnen Films muss deutlich unter 10 nm eine topographische Beeinträchtigung Zelladhäsion zu vermeiden und klare Betrachtung der Zelle-induzierte Vorsprünge von AFM Bild...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
200 Mesh Nickelgitter	Elektronenmikroskopie Sciences	G200-Ni
Filterpapier	Sigma-Aldrich	1001-055
Objektträger	Fisher Scientific	10235612
Weiße Aufkleber 26 x 70 mm	Avery	DP033-100
Filmgießgerät mit Ventil im Auslass	Elektronenmikroskopie Sciences	71305-01
Rasierklingen	Elektronenmikroskopie Sciences	72000
Ethanol	VWR	1.08543.0250
Aceton	VWR	20066.321
Formvar 0,5% ige Lösung in Ethylendichlorid	Elektronenmikroskopie Sciences	15820
12 mm Deckgläser	VWR	631-0666
Inverses Mikroskop	Carl Zeiss	Axiovert 200
Rasterkraftmikroskop	JPK Instruments	NanoWizard III
Temperaturgesteuerter Probenhalter	JPK Instruments	BioCell
Siliziumnitrid-Cantilever, mit einer nominalen Federkonstante von 0,01 N/m	Veeco Instruments	MLCT-AUHW
PBS	Gibco	14190-094
Doppelseitiges Klebeband	APLI AGIPA	118100
RPMI 1640	Gibco	31870-025
FCS	Sigma-Aldrich	F7524
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
35 mm Petrischalen mit Glasboden	WPI	FD35-100