Vorsprung-Kraft-Mikroskopie: Eine Methode, um Kräfte entwickelt von Zelle Vorsprünge zu quantifizieren

Summary

Hier zeigen wir die experimentellen Techniken verwendet, um den Vorsprung Kräfte auszuwerten, die Podosomes auf einem konformen Film, von der Vorbereitung des Films für die automatisierte Analyse von topographische Bilder gelten.

Abstract

In zahlreichen biologischen zusammenhängen müssen tierische Zellen physisch mit ihrer Umgebung interagieren durch mechanische Kräfte zu entwickeln. Unter diesen Zugkräfte gut charakterisierten gewesen, aber es fehlt an Techniken ermöglichen die Messung der Kräfte, Vorsprung durch Zellen orthogonal zu ihrem Substrat. Wir entwarfen eine Versuchsanordnung, die Kräfte, Vorsprung durch adhärente Zellen auf ihrem Substrat zu messen. Zellen, die auf einem kompatiblen Formvar Blatt vergoldet verformen dieses Substrat und die daraus resultierende Topographie wird durch Rasterkraftmikroskopie (AFM) auf der Nanometerskala zugeordnet. Kraftwerte werden dann von einer Analyse der Verformung Profil basierend auf der Geometrie der hervorstehende zellulären Strukturen extrahiert. Daher können die Kräfte, die von den einzelnen hervorstehenden Einheiten einer lebenden Zelle im Laufe der Zeit gemessen werden. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Krafterzeugung und deren Regulierung in viele zelluläre Prozesse, die mit Vorsprung. Hier beschreiben wir ihre Anwendung auf die hervorstehende Kräfte erzeugte Podosomes gebildet durch menschliche Makrophagen zu messen.

Introduction

Tierische Zellen interagieren körperlich mit der Matrix und den anderen Zellen, die ihre Umwelt¹darstellen. Dies ist erforderlich für sie zu migrieren, Körper zu verinnerlichen, externe Informationen zu erwerben oder zu unterscheiden. In solchen Prozessen muss die Zelle mechanische Kräfte erzeugen, und wie in den letzten Jahren zahlreiche Studien gezeigt haben, beeinflusst die Fähigkeit einer Zelle zu erzeugen Kräfte und seiner Umgebung Sonde sein biologische Verhalten, Regie zum Beispiel Verbreitung oder Differenzierung-^2,-³. Die Messung von zellulären Kräften ist wiederum eine große H....

Protocol

1. Vorbereitung des Formvar-beschichtete Netze

1. Reinigen Sie Raster-Elektronen-Mikroskopie mit Aceton und trocknen Sie sie auf Filterpapier. Reinigen Sie anschließend einen Objektträger mit reinem Ethanol, mit einem Objektiv-Papier wischen Sie ab und entfernen Sie den Staub mit einem Gebläse.
2. Stellen Sie eine Folie mit Ethanol gereinigt Glas senkrecht in den Trichter eines Film-Casting-Gerätes mit einer Lösung von Formvar im unteren Teil. Decken Sie die Spitze des Trichters.
3. Pumpen Sie Formvar Lösung (0,5 % Ethylen Paraquatdichlorid) 100 mL mit Zerstäuber Birne, bis die zwei Drittel der Folie erreicht.
4. Halten Sie die Folie in die....

Results

Das obige Protokoll beschreibt die Vorbereitung der Versuchsaufbau, Vorwölbung Krafteinwirkung durch Makrophagen Podosomes auf einem Formvar Substrat zu quantifizieren. Dies erfolgt über AFM und in Abbildung 1dargestellt ist.

Bei der Analyse der topographischen Bild Ausbuchtungen unter Podosomes mit JPK Datenverarbeitungs-Software sollte ein dritten Grades Polynom passen jede Scanzeile unabhängig vo.......

Discussion

Materialeigenschaften

Die Wahl des Materials für die verformbare Membran, in unserem Fall Formvar, muss einige Voraussetzungen erfüllen. Das Material muss für sichtbares Licht transparent sein und weisen begrenzt Auto-Fluoreszenz um Beobachtungen im Hellfeld und Fluoreszenz-Mikroskopie erlauben. Die Rauheit des dünnen Films muss deutlich unter 10 nm eine topographische Beeinträchtigung Zelladhäsion zu vermeiden und klare Betrachtung der Zelle-induzierte Vorsprünge von AFM Bild.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 Mesh Nickelgitter	Elektronenmikroskopie Sciences	G200-Ni
Filterpapier	Sigma-Aldrich	1001-055
Objektträger	Fisher Scientific	10235612
Weiße Aufkleber 26 x 70 mm	Avery	DP033-100
Filmgießgerät mit Ventil im Auslass	Elektronenmikroskopie Sciences	71305-01
Rasierklingen	Elektronenmikroskopie Sciences	72000
Ethanol	VWR	1.08543.0250
Aceton	VWR	20066.321
Formvar 0,5% ige Lösung in Ethylendichlorid	Elektronenmikroskopie Sciences	15820
12 mm Deckgläser	VWR	631-0666
Inverses Mikroskop	Carl Zeiss	Axiovert 200
Rasterkraftmikroskop	JPK Instruments	NanoWizard III
Temperaturgesteuerter Probenhalter	JPK Instruments	BioCell
Siliziumnitrid-Cantilever, mit einer nominalen Federkonstante von 0,01 N/m	Veeco Instruments	MLCT-AUHW
PBS	Gibco	14190-094
Doppelseitiges Klebeband	APLI AGIPA	118100
RPMI 1640	Gibco	31870-025
FCS	Sigma-Aldrich	F7524
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
35 mm Petrischalen mit Glasboden	WPI	FD35-100