Immunstimulierenden Agent Bewertung: Lymphatischen Gewebe Extraktion und Injektion Route-Dependent Dendritische Zelle Aktivierung

Summary

Experimentelle Verfahren für die spätere Gewinnung von lymphatischen Gewebe, lymphatischen Dendritische Zelle Aktivierung testen werden nach der Behandlung eine immunstimulierende Nanomaterials beschrieben.

Abstract

Für die Bewertung der neuen Therapeutikum für Immuntherapie oder Impfung ist Analyse der immun-Zell-Aktivierung in lymphatischen Geweben unerlässlich. Hier untersuchten wir immunologische Effekte von einem neuartigen Lipid-DNA immunstimulierende Nanoparticle Form aus verschiedenen Verwaltung Routen in der Maus: oral, intranasale, subkutane, Straßenräuber, intraperitoneale und intravenöse. Diese Injektionen direkt beeinflussen, die Immunantwort und Ernte lymphatische Geweben und Analyse von dendritischen Zellen (DC) Aktivierung in den Geweben sind wichtige Teile dieser Bewertungen. Die Gewinnung von mediastinalen Lymphknoten (mLNs) ist wichtig aber recht komplex aufgrund der Größe und Lage dieses Organs. Eine schrittweise Vorgehensweise für die Ernte der inguinalen Lymphknoten (iLN), mLN und Milz und Analyse von DC-Aktivierung durch Durchflusszytometrie wird beschrieben.

Introduction

Fortschritte in der Immunologie und Nanomaterialien haben zu einer Fülle von potenziellen neuen Therapiestrategien für Anwendungen in der Biomedizin, einschließlich Drug-Delivery und Immunstimulierung geführt. Optimierung der Verwaltung Route ist ein wichtiger Aspekt betrifft die Wirksamkeit von immunstimulierenden Agenten. Ein immunstimulierenden Nanopartikel (INP) bestehend aus DNA ist eine neu entwickelte Nano-immun adjuvante selbst durch Microphase Trennung aufgrund der AMPHIPHILE Struktur der Lipid-DNA¹montiert. Daher, Protokolle für INP mit Verwaltung des materiellen¹ in Vivo über verschiedene Routen und drei Verfahren für die Ernte geeignete Gewebe wie die inguinalen Lymphknoten (iLN), Mediastinale LN (mLN) und Milz, beschrieben. Schließlich wurden diese Gewebe für die Aktivierung von dendritischen Zellen (DC), der mächtigsten Antigen-präsentierenden Zellen im Immunsystem analysiert. Dieses Protokoll kann auch angewendet werden, für die Bewertung der Antigene, Antikörper oder andere immun Adjuvantien-².

Wir testeten die INP-Formulierung, weil es ein Mittel ist, das großes Versprechen gezeigt hat. INP ist ein Toll-Like-Rezeptor 9 (TLR9) adjuvante Material, die Nukleinsäuren, für die Beurteilung der Immunstimulierung Wirksamkeit erforderlich enthält ist, um verschiedene Einspritzung Methoden³zu testen. In diesem Zusammenhang ist die Stimulation des DCs einen potenten Endpunkt für in Vivo Evaluation. Nachdem Antigen oder immunstimulierenden Moleküle von DCs im peripheren Gewebe oder Blut phagozytiertes sind, Wandern diese Zellen in lymphatischen Organen wie Milz und LNs^4,5. So wurde DC-Aktivierung in der Milz, iLN und mLN der injizierten Tiere analysiert. Richtig ernten dieser Gewebe ist daher auch entscheidend für die Beurteilung der Immunantwort auf eine neuartige adjuvante oder Krankheitserreger⁵. Solche Gewebe Ernte ist auch wichtig für die Entwicklung einer neuartigen immunologischen Methodik als Krebstherapie. Darüber hinaus kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Effizienz von anderen Drogen, wie z. B. Anti-Human Immunodeficiency Virus Therapeutika⁶zu überprüfen.

Protocol

Alle experimentelle Verfahren einschließlich tierischen Handling, Opfer und Orgel Isolierung wurden unter strikter Einhaltung der Regeln des internationalen Animal Care und Use Committee auf Shanghai Public Health Klinikum und Asan Medical Center durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde genehmigt durch die zuständigen Gremien auf die Ethik von Tierversuchen Shanghai Public Health Klinikum (Maus-Protokoll-Nummer: SYXK-2010-0098) und Asan Medical Center (2016-02-168).

1. Vorbereitung des Materials

Hinweis: Ein Nano-adjuvante, INP, bestehend aus einem selbst-zusammengebauten Lipid-DNA-Träger, nämlich U4T und CpG-Motiv mit Oligonukleotid, eCpG, wurde in der aktuellen Studie eingesetzt, um die entsprechende Injektion Route für Immuntherapie und Impfung bei Mäusen^{2 testen} . Wichtig ist, andere mögliche therapeutische Moleküle wie Antigene, Antikörper und adjuvante Agenten für INP ersetzt werden können und getestet, mit der gleichen Methode beschrieben.

1. INP Formulierung^2,4,7
   1. Tempern U4T (160 µM, Träger) mit eCpG (80 µM, mit einer TLR9-Agonist-Sequenz) im Beisein von 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) und MgCl₂ (2 mM). Das Standardvolumen für Glühen ist zwischen 50 und 110 µL in einem PCR-Röhrchen. Erhitzen Sie die Mischung auf 95 ° C für 10 min und dann kühlen Sie langsam ab (1 ° C/16 min.) bis 25 ° C mit einem Thermocycler. Das Glühen Protokoll erfordert ca. 2 h.
      Achtung: Die U4T-haltige Flüssigkeit ist sehr schaumig und muss sorgfältig behandelt werden.
   2. 50 µL-Aliquots der INP-Vorbereitung zu machen; Verwenden Sie 50 µL des Materials für jede Injektion.
      Hinweis: Im Falle von 100 µL pro Injektion, wiederholen Sie Schritt 1.1 mit richtigen Berechnung der Zutaten.

2. allgemeine Tier Verfahren

Hinweis: Alternative Methoden für den Umgang mit der Mäusen können je nach Labor Anforderungen und zugelassene tierische Protokolle⁸verwendet werden. Der Typ von Mäusen verwendet ist 6 Wochen alten C57BL/6 und weiblichen Mäusen.

1. Liste der Materialien
   1. Bereiten Sie flüssige Narkosemittel (Isofluran), Narkose Maschine, Kohlendioxid (CO₂) Inhalation Kammer, steriler Gaze, Zange, Maus Restrainer, Handschuhe, gebogenen Pinzette, sezierenden Schere 1-Zoll, 2 Zoll sezierenden Schere, Alkohol für Sterilisation und Insulin Spritzen.
2. Inhalat Anästhesie
   Hinweis: Anästhesie ist obligatorisch für intranasale, subkutane, Straßenräuber und intravenöse Injektionen von Mäusen⁹. Eine Induktion-Kammer mit einem Vaporizer-Maschine und Sauerstoff-Tank angeschlossen ist für dieses Verfahren verwendet.
   1. Legen Sie das Tier in der Induktion Kammer und achten Sie darauf, den Deckel wieder fest verschließen.
   2. Fließen den Sauerstoff bei 1 L/min und die Vaporizer festlegen auf ein Niveau der Induktion von 4 % Isofluran.
   3. Variieren Sie die Belichtungszeit von Tieren in der Kammer je nach Tier Gewicht; jedoch mehr als 10 s von Exposition und alle 5 min. Überwachung ist notwendig für Anästhesie¹⁰.
      Hinweis: Kein Pedal Reflex zeigt erfolgreiche Narkose.
   4. Schalten Sie den Isofluran-Induktor und fließen Sie 1 L/min Sauerstoff zur Vermeidung der Exposition von Personal zu Isofluran Gas.
3. Opfer
   1. Bereiten Sie eine Kammer für CO₂ Inhalation Opfer entsprechend der NIH "Richtlinien für die Sterbehilfe von Nagetiere verwenden Kohlendioxid"¹¹.
4. Testantwort Knebel zu bestätigen, dass das Tier vollständig geopfert wird.
   1. Stellen Sie sicher, dass die Maus richtig geopfert wird, Kneifen die Fußspitze und keine Knebel Antwort bestätigen. Wenn es eine Antwort, wiederholen Sie Schritt 2.2.
5. Desinfektion
   1. Desinfizieren Sie alle Flächen, die für Injektionen oder Dissektionen mit Alkohol Spray und steriler Gaze verwendet.
6. Orgel-Lagerung
   1. Verwenden Sie Pinzetten, um alle Fett und Blut rund um die geernteten Organe zu entfernen. Speichern Sie diese geernteten Gewebe individuell in einer Petrischale gefüllt mit 3 mL PBS. Der Container und Medien können je nach Bedarf weitere Vorgehensweise abweichen.

3. Injektion Routen

1. Mithilfe der sechs Injektionsmethoden Injektion-abhängige Immunreaktionen untersuchen: oral, intranasale, subkutane, Straßenräuber, intraperitoneal, und intravenöse^8,12,13.

4. Isolierung von Lymphknoten und Milz

Hinweis: Verwenden Sie jung und gesund schlanke Mäuse (6 Wochen alt) für diese Verfahren, da die Fette, die in der Regel rund um die Lymphknoten bei älteren Mäusen aufbauen sind schwer zu entfernen und Visualisierung des Organs verhindern kann.

1. Pre-Ernte Schritte
   Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt die nach der Injektion Ernte der iLN, Milz und mLN von Mäusen für die Analyse der Immunstimulation. Beziehen sich auf Schritte 2,3 bis 2,5 für Opfer, gag Reaktion und Desinfektionsverfahren.
   1. Heften Sie die Glieder der Maus auf die chirurgische Dämmplatte und Sterilisieren der ventralen Seite der Maus mit 70 % Ethanol.
   2. Wählen Sie einen Standort 2 cm über den Genitalbereich und Gebrauch süchtig Zange, ziehen Sie die Abdeckung der Außenhaut wie ein Zelt. Machen Sie einen ca. 1 cm Schnitt an dieser Stelle und schieben Sie die Schere (2 Zoll) unter der Haut, Dissektion Kürzungen weiter.
   3. Für das Integument senkrecht durchschneiden Sie die Außenhaut mit beiden Armen die Schere (2 Zoll). Setzen Sie die inneren Organe mit Bauchfell überzogen.
   4. Heften Sie die äußere Schicht der Haut.
2. Isolierung von den inguinalen Lymphknoten (iLN)
   1. Suchen Sie die iLN auf der linken Seite des Beines nach der Konjunktion des Blutgefäßes hinunter das linke Bein, das als einen geneigten Buchstaben "Y" angezeigt wird.
      Hinweis: Wählen Sie für subkutan injizierten Mäusen eine iLN auf der gleichen Seite des Standortes Injektion.
   2. Entdecken Sie die Schicht mit zwei Pinzetten zu zerreißen die überdachte Lipidschicht und ernten die blasse gelbe iLN (Bohnen-Form, 2 mm). Für eine nachträgliche Bearbeitung und Lagerung des Gewebes siehe Punkt 2.6.
3. Isolation der Milz ¹⁴
   1. Machen Sie ein Zelt in der Mitte des Peritoneums mittels süchtig Zange in der Hand und verwenden kleine dünne Schere (1 Zoll) in der anderen Hand das Peritoneum zu schneiden.
   2. Verwendung süchtig Zange in der linken Hand zu greifen den Darm und drehen Sie sie um, um die rote Bohne-wie Milz (Länge ca. 14 mm) an der linken oberen Seite des Bauches Maus angeschlossen zu finden.
   3. Ziehen Sie die Milz mit einem anderen Satz von Zangen in der rechten Hand vorsichtig während andere Organe mit der gebogenen Pinzette abnehmen. Folgen Sie den Schritten 2.6, die Milz zu speichern.
      Hinweis: Vorsicht ist beim Ernten der Milz, da es eine leicht beschädigte weiches Organ ist.
4. Isolierung der mediastinalen Lymphknoten (Mio.)
   Hinweis: Ist die mLN befindet sich ca. 1 cm unterhalb der Rippen und wird durch andere Organe wie Herz und Lunge. Wegen seiner Lage und der geringen Größe ist es wichtig, sorgfältig die Umgebung mit Zange und Schere (1 Zoll) aussetzen.
   1. Schneiden Sie die Membran und von den Rippen lösen. Halten Sie den Körper der Rippen mit der Pinzette und schneiden Sie die linken und rechten Seite der Rippen mit einer Schere (1 Zoll). Heften Sie die cutoff Rippen über die Maus Schulter auf der rechten Seite, das Herz und die Lunge verfügbar zu machen.
      Hinweis: Achten Sie darauf nicht schneiden Sie die Blutgefäße rund um das Herz und die Lunge, wie austretendes Blut es sehr schwierig macht, die winzige durchscheinende mLN zu finden. Wenn Blutgefäße geschnitten sind, absorbieren Sie sanft das Blut in der Gegend mit Gaze.
   2. Mit gebogenen Pinzette in der rechten Hand, Herz und Lunge sanft nach rechts drehen Sie bis das Rückgrat zu sehen ist. Verwenden Sie ein paar regelmäßige Zange in der linken Hand um iLN mit gebogenen Pinzette in der rechten Hand gerne bei dieser Ernte zu entfernen.
   3. Schnappen Sie sich die Lunge und flip sie bis das Rückgrat häufig ausgesetzt ist. MLN (eine transluzente bohnenförmige Struktur von etwa 2 mm Größe) befindet sich zwischen der Lunge und der Wirbelsäule.
   4. Nutzen Sie die Haken Zange, die Gegend um die mLN verfügbar zu machen und die anderen Zange um das Gewebe zu extrahieren.
      Hinweis: Die mLN ist umgeben von zahlreichen anderen Geweben die sorgfältig mit der Pinzette vor der Ernte entfernt werden müssen.
   5. Siehe Schritt 2.7 für Anweisungen für die Lagerung von den geernteten mLN.

5. Vorbereitung der Proben für die Durchflusszytometrie

Hinweis: Um die Aktivierung des DCs in der geernteten iLN, Milz und mLN assay, sind einzellige Suspensionen dieser Gewebe mit Fluoreszenz-konjugierten Antikörpern als DC-spezifische Marker, co-stimulatory Moleküle und großen Histocompatibility komplexe gebeizt Moleküle und durch Durchflusszytometrie analysiert.

1. Vorbereitung von einzelligen Suspensionen: Milz
   1. Fügen Sie 5 mL frisches Kulturmedium (CM hinzu) in 6 mm Kulturschale und die Proben auf Eis.
   2. Entfernen Sie umgebenden Blut und Fett Gewebe zu und das Gewebe in den Deckel der Kulturschale.
   3. Schneiden Sie das Gewebe in kleine Fragmente (< 1 mm) mit einer gebogenen Schere. Hängen Sie die Fragmente in PBS gefolgt von Spinnen das Gewebe mit Hilfe einer Zentrifuge bei 646 × g für 5 min und das Entfernen des Überstands nach unten.
   4. Die Proben wieder in 3 mL CM und verdauen Sie die Fragmente mit 200 µL Lösung 2 % fetalen bovine Serum (FBS) ergänzt mit Kollagenase IV für 20 min.
   5. Schütteln und die Probe bei 37 ° C inkubieren Sie für 1 h filtern die verdaute Gewebe durch Nylon-Netzgewebe (100 nm) und drehen Sie sie nach unten. Die Einzelzellen in 5 mL PBS waschen und Entfernen des Überstands durch Zentrifugation.
   6. Wieder aussetzen Sie, die Zellen in 5 mL Zelle Lösung zu isolieren. Neu laden Sie eine weitere Schicht von 5 mL Lösung klar Zelle Isolierung um eine wässrige Schicht für Schicht-Stapel zu bilden.
   7. Zentrifugieren Sie die Zelle Vorbereitung 2012 × g für 10 min. erhalten der Überstand, die die leichter Dichte Bruchteil (< 1,077 g/cm³), für spätere Flow Cytometry-Analyse.
   8. Die Anzahl der Zellen mit einem Hemocytometer.
2. Vorbereitung von einzelligen Suspensionen: Lymphknoten
   1. Folgen Sie Schritt 5.1.1-5.1.2.
   2. Zugeben Sie 5 mL CM mit einer 10 mL pipettieren aussetzen der Zellen durch pipettieren 3-4 mal. Nach gründlich Aussetzung der Zellen, die Zellen für die Sammlung in einem 15 mL konische Röhrchen Filtern verwenden Sie sterile Nylon-Netzgewebe.
   3. Drehen Sie die Zellen nach unten bei 646 ×g für 7 min bei 4 ° C und entfernen Sie den überstand zu.
   4. Fügen Sie eine zusätzliche 5 mL CM in 10 mL pipettieren, besser die Zellen durch pipettieren auszusetzen.
   5. Mit PBS waschen und die Anzahl der Zellen.
3. Flow-zytometrie-Analyse
   1. Aliquoten 0,5-1 × 10⁶ Zellen in jedem Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) Rohr.
   2. Bei 646 × g bei 4 ° C für 5 min zentrifugieren und den überstand abgesaugt.
   3. Fügen Sie 5 µL der einzelnen verdünnt Fluoreszenz-konjugierten Antikörpern Vorbereitung auf die Zellen, die Zelle Pellet und Wirbel wieder auszusetzen.
      Hinweis: Es ist wichtig, die Zelle Pellet aus Licht Exposition so weit wie möglich zu schützen, weil eindringmittel beschriftete Antikörper lichtempfindlich sind. Einen Antikörper-master-Mix zu generieren und immer Fc-Block hinzufügen.
   4. Bereiten Sie FACS-Puffer mit 100 µL PBS, 1 % der Hitze-inaktivierten regelmäßige FBS und 0,1 % Natriumazid vor.
   5. Legen Sie die Probe in der Röhre bei 4 ° C für 30 min. Spülen die Zellen mit 2-4 mL FACS Puffern und Zentrifugieren der Probe bei 1700 u/min für 7 min bei 4 ° C.
   6. Wieder aussetzen Sie, die Zellen in 500 µL FACS-Puffer in der Dunkelheit. Analysieren Sie die Zellen, indem Sie Durchflusszytometrie.

Results

Um entsprechende Injektion Routen von INP für die Aktivierung des lymphatischen Gewebes DC zu bewerten, die DC-Bevölkerung als Linie wurde definiert als ^–CD11c⁺ Zellen in der Milz, iLN und mLN und analysiert den Ausdruck Niveaus von co-stimulatory Molekülen. Behandlung von INP durch subkutane (s.c.) und intravenös (i.v.) Injektion gefördert erhebliche Erhöhungen der CD40, CD80 und CD86 Ausdruck in der Milz und iLN DCs (Abb. 2 b<...

Discussion

Viele Fortschritte in der Nanotechnologie und Immunologie wurden durch therapeutische Forschung Drug-Delivery und Immunstimulierung erzielt. Sorgfältige Auswahl der Injektion Methode ist bekanntermaßen wichtig für Immunstimulierung, die lag der Schwerpunkt der vorliegenden Studie.

Verschiedenen Injektion Routen wurden ausgewertet, für ein natürlich ungiftig und biologisch abbaubar DNA-basierte Material, INP (immunstimulierenden Nanopartikel), um festzustellen, welchen Weg das beste Ergebnis er...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Phosphatpuffer Kochsalzlösung	Corning	21-040-CVR	Waschorgane
(PBS, pH 7,4)
Isofluranlösung	Aesica Queenborough limited	26675-46-7	Anästhesieprozess
Tuberkulin 1 ml Spritze -	Junglim	N/A	Injektion
50 mL konischer Schlauch	S.P.L	50050	Anästhesieprozess
1 ml Insulinspritze	(BD Ultra-FineTM­II)_short Nadel	324826	Intramuskuläre Injektion
DMEM Hyklon mit hohem Glukosegehalt		SH30081.01	Lagerung von Organen
Histopaque	Sigma-Aldrich	10771	FACS-Analyse
Ethylalkohol wasserfrei 99,5 %	Daejung	4022-4110	Desinfektionsmittel
Ausrüstungen
FineCycler C100 (Thermocycler)	Ssufin-Anealing
Zentrifuge			Zentrifuge
FACS Röhrchen	FALCON	2052	FACS-Analyse
Automatisiertes Hochleistungs-Durchflusszytometer	BD (USA), FACSVerse-FACS-Analyse