Licht-Blatt-Mikroskopie zur dreidimensionalen Visualisierung der menschlichen Immunzellen

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll um Immunzellen, eingebettet in eine dreidimensionale (3D) Kollagen-Matrix mit Licht-Blatt Mikroskopie zu visualisieren. Dieses Protokoll arbeitet auch wie Zellwanderung in 3D zu verfolgen. Dieses Protokoll kann für andere Arten von Aussetzung Zellen in der 3D Matrix eingesetzt werden.

Abstract

In Vivo, Aktivierung, Verbreitung und Funktion von Immunzellen, die alle auftreten in einer dreidimensionalen (3D) Umgebung, z. B. in Lymphknoten oder Gewebe. Up to Date verlassen sich die meisten in-vitro- Systeme auf zweidimensionale (2D) Oberflächen, wie z. B. Zellkultur Platten oder Deckgläsern. Um optimal mimischen physiologischen Bedingungen in Vitroverwenden wir eine einfache 3D Kollagen-Matrix. Kollagen gehört zu den wichtigsten Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) und wurde häufig verwendet, um 3D Matrizen darstellen. Für 3D-Bildgebung, wird die neu entwickelte Licht-Blatt-Mikroskopie-Technik (auch bezeichnet als einziges Flugzeug Beleuchtung Mikroskopie) mit hoher Geschwindigkeit, große Eindringtiefe, geringe Bleichen und Photozytotoxizität gekennzeichnet. Darüber hinaus ist Licht-Blatt Mikroskopie besonders vorteilhaft für Langzeitmessungen. Hier beschreiben wir einer optimierten Protokoll zum Einrichten und Verarbeiten von menschlichen Immunzellen, z.B. primären menschlichen zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) und natürlichen Killer (NK) Zellen in der 3D Kollagenmatrix für die Verwendung mit der Licht-Blatt-Mikroskopie für live Cell Imaging und feste Proben. Das Verfahren zur Bildaufnahme und Analyse der Zellwanderung werden vorgestellt. Ein besonderer Schwerpunkt ist gegeben, markieren Sie wichtige Schritte und Faktoren für die Probenvorbereitung und Analyse der Daten. Dieses Protokoll kann für andere Arten von Aussetzung Zellen in einer 3D Kollagenmatrix eingesetzt werden und beschränkt sich nicht auf Immunzellen.

Introduction

Die meisten wissen über Migration Zellen stammt aus 2D Experimente^1,2,3, die sind in der Regel in einem Glas oder Kunststoff-Oberfläche der Kultur/Bildgebung durchgeführt Gericht. Eine physiologische Szenario erfordert jedoch in den meisten Fällen eine 3D Mikroumgebung, in denen die extrazelluläre Matrix (ECM) eine entscheidende Rolle spielt. ECM bietet die 3D-Struktur ätherischen um richtige Zellmorphologie beizubehalten nicht nur, sondern bietet auch überleben Signale oder direktionale Hinweise für eine optimale Funktion von vielen Zellen^4,

Protocol

Für diese Studie mit Menschenmaterial (Leukozyten Reduktion System Kammern von menschlichen Blutspendern) durchgeführten Forschungsarbeiten ist berechtigt, von der lokalen Ethikkommission (Erklärung von 16.4.2015 (84/15; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) und folgt den entsprechenden Richtlinien.

1. Vorbereitung des neutralisierten Kollagen Lösung (500 µL)

1. Übertragen Sie 400 µL der Stammlösung gekühlte Kollagen (10,4 mg/mL) auf eine sterile 1,5 mL-Tube unter der Haube Zelle Kultur. Fügen Sie langsam 50 µL 10 X PBS (pH-Wert 7,0-7,3) zu 400 µL der Stammlösung gekühlte Kollagen gekühlt. Mischen Sie die Lösung durch sanft das Rohr mit Ziegeln....

Results

Protrusion Formation während der T-Zell-Migration ist ein sehr dynamischer Prozess, der Aktin angewiesen ist. Um Vorsprung Bildung der primären menschlichen CTL zu visualisieren, transfizierten wir vorübergehend ein mEGFP verschmolzen Protein Aktin-Zytoskeletts in CTL wie beschrieben vor¹¹beschriften. Einen Tag nach Transfektion, wurden die Zellen in der Kollagenmatrix eingebettet. Bild-Stacks erworben wurden alle 40 s mit einer Schrittweite von 1 µm bei 37 ° C mit.......

Discussion

Die meisten in-vitro- Tests sind auf einer 2D Oberfläche, zum Beispiel in Petrischalen Zellkultur Platten oder auf Deckgläsern, durchgeführt, während in Vivo Zellen, vor allem Immunzellen, vor allem eine 3D Mikroumgebung erleben. Anzeichen dafür zeigt, dass Migrationsmuster von Immunzellen zwischen 2D und 3D Szenarien¹⁷unterscheiden. Die expressionsprofile von Tumorzellen unterscheiden sich darüber hinaus auch in 2D und 3D kultiviert Gewebe^18,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibricol, Rinderkollagenlösung	Fortschrittliche Biomatrix	#5133-20ML	Kollagenmatrix
0,5 M NaOH-Lösung	Merck	1091381000	zur Neutralisierung von Fibricol-Lösung
Ultra-niedrigschmelzende Agarose	Affymetrix	32821-10GM	Probenvorbereitung in niedrigem c[Col]
Dynabeads Unberührtes humanes CD8-T-Zellen Kit	Thermo Fisher	11348D	Isolierung von primären humanen CD8+ T-Zellen aus PBMC
Dynabeads Humaner T-Aktivator CD3/CD28 für die Expansion und Aktivierung von T-Zellen	Thermo Fisher	11132D	Aktivierung von CTL-Populationen
Humanes rekombinantes Interleukin-2	Thermo Fisher	PHC0023	Stimulation von kultiviertem CTL
P3 Primärlösungskit	Lonza	V4XP-30XX	Transfektion
α-PFN1 Antikörper, Kaninchen, IgG	Abcam	ab124904	IF
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Thermo Fisher	A22284	IF
CellMask Orange Plasmamembran Stain	Thermo Fisher	C10045	Fluoreszierende Zellmarkierung
Tween 20	Sigma	P1379-250mL	IF
Triton X-100	Eurobio	018774	IF
DPBS Dulbecco's Phopsphat gepufferte Kochsalzlösung	Thermo Fisher	14190250	IF
Rinderserum Albumin	Sigma	A9418-100G	IF
Ziege & Alpha; Kaninchen 568, IgG, Kaninchen	Thermo Fisher	A-11011	IF
Lightsheet Z.1 (Lichtblattmikroskopie)	Zeiss	N.A.
Zellkulturhaube	Thermo Fisher	HeraSafe KS
Zellkultur-Inkubator HERACell 150i	Thermo Fisher	N.A.
Zentrifuge 5418 und 5452	Eppendorf	N.A.
Pippetten	Eppendorf	3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippettenspitzen	VWR	89079-444, 89079-436, 89079-452
15 mL Röhrchen	Sarstedt	62.554.002
Kapillaren 50 & Mikro; L	VWR (Marke)	613-3373	Zeiss LSFM Probenvorbereitung
Kolben für Kapillaren	VWR (Marke)	BRND701934	"Stempel mit Teflonspitze" LSFM Probenvorbereitung
MColorPhast pH-Stempel	Merck	1095430001	zum Testen des pH-Werts von neutralisiertem Fibricol
BD Plastipak 1mL Spritzen	BD	Z230723  ALDRICH	Alternative Probenvorbereitung
Modelliermasse (Hasbro Play-Doh A5417EU7)	Play-Doh	N.A.
Imaris Dateikonverter	Bitplane	verfügbar unter http://www.bitplane.com	Konvertieren Sie Imaging-Dateien in das Imaris-Dateiformat
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)	Bitplane	verfügbar unter http://www.bitplane.com	Analyse von 3D- und 4D-Bildgebungsdaten