Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Charakterisierung der aquatischen Biofilme mit Durchflusszytometrie

9K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/57655

⸱

6. Juni 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental Toxicology, Eawag - Swiss Federal Institute for Aquatic Science and Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Durchflusszytometrie in Kombination mit visuellen clustering bietet eine einfach zu bedienende und schnelle Methode zur Untersuchung von aquatischer Biofilms. Biofilm-Charakterisierung, Erkennung von Veränderungen in der Struktur der Biofilm-Gemeinschaft und die Detektion von abiotischen Partikeln eingebettet im Biofilm einsetzbar.

Zusammenfassung

Biofilme sind dynamische Konsortien von Mikroorganismen, die eine Schlüsselrolle in Süßwasser-Ökosystemen spielen. Durch die Veränderung ihrer Gemeinschaftsstruktur, Biofilmen schnell auf Veränderungen der Umwelt reagieren und können somit als Indikatoren für die Qualität des Wassers verwendet werden. Derzeit basiert Biofilm Bewertung meist auf integrative und funktionalen Endpunkte wie photosynthetische oder Atemwege Tätigkeit, die keine Informationen über die Struktur der Biofilm-Gemeinschaft bieten. Durchflusszytometrie und computergestützte Visualisierung bieten eine alternative, sensibel und leicht zu bedienende Methode zur Beurteilung der Gemeinschaft Zusammensetzung, insbesondere von den photoautotrophen Teil von Süßwasser Biofilmen. Es erfordert nur grundlegende Probenvorbereitung, nach deren Ablauf die gesamte Probe durch das Durchflusszytometer ausgeführt ist. Die einzelligen optische und fluoreszierende Informationen wird für computergestützte Visualisierung und biologischen Interpretation verwendet. Die wichtigsten Vorteile gegenüber anderen Methoden sind die Geschwindigkeit der Analyse und der hohe Informationsgehalt Natur. Durchflusszytometrie liefert Informationen über verschiedene Zell- und Biofilm Eigenschaften in einer einzigen Messung: Partikelgröße, Dichte, Pigmentanteil, abiotische Inhalte in den Biofilm und groben taxonomische Informationen. Jedoch bietet es keine Informationen über Zusammensetzung der Biofilm auf Artniveau. Wir sehen hohes Potential bei der Verwendung der Methode für die Umweltüberwachung aquatischer Ökosysteme und als erste Biofilm Evaluation Schritt, die stromabwärts informiert detaillierte Untersuchungen durch ergänzende und genauere Methoden.

Einleitung

Biofilme sind dynamische Konsortien von Mikroorganismen, die eine in Süßwasser-Ökosystemen, Primärproduktion Schlüsselrolle, nährstoffkreisläufe und Wasseraufbereitung bis hin zu beeinflussen die Verteilung der Mikroorganismen und ihrer Artenvielfalt des Ökosystems 1. wenn Biofilme an sich verändernde Umweltbedingungen oder Stressoren, wie Chemikalien, ausgesetzt sind rückt die Gemeinschaftsstruktur schnell toleranter Arten2,3. Ihre hohe Empfindlichkeit verwandelt sich Biofilme in attraktive Modellsysteme für ökologische Überwachung4, jedoch keine der aktuellen Methoden perfekt geeignet ist, um die Dynamik einer Biofilm-Gemeinschaft tatsächlich in eine schnelle und einfache Weise zu verfolgen.

Die häufig verwendete Satz von Methoden zur Charakterisierung von Biofilmen besteht aus der Messung der funktionellen und strukturellen Endpunkte. Auf der Ebene der gesamten Gemeinschaft enthält Photosynthese und Atmung sowie die Aktivität extrazellulärer Enzyme Informationen über den Funktionszustand der Biofilm5,6,7,8 ,9. Biomasse-Abgrenzung dient als Indikator für Gesamtwachstum Biofilm. Strukturelle Veränderungen sind derzeit entweder mit traditionellen speziesidentifizierung mit Lichtmikroskopie oder Nukleotid-basierte Techniken (z.B.Denaturierenden Gradienten Gelelektrophorese (DGGE), automatisierte ribosomale intergenetischer Distanzstück gemessen. Analyse (ARISA), Metagenomik)10,11,12. Diese Methoden informieren, sondern sind zeitaufwendig, durchzuführen, oder erfordern spezielle Kenntnisse oder sind noch in der Entwicklungsphase. Schließlich neue Methoden zur Bewertung der extrazelluläre Polymere Substanzen (EPS)13,14 und der Biofilm Architektur1, während der empfindlichen, sind niedrig-Durchsatz und noch nicht in Richtung entwickelt worden Überwachungszwecke.

Es ist offensichtlich, dass für eine vollständige Charakterisierung von Süßwasser Biofilmen, es notwendig ist, verschiedene Methoden, die Einblick in die Biofilm-Funktion, die Zusammensetzung und die Architektur zu kombinieren. Für die Umweltüberwachung, auf der anderen Seite ist eine schnelle und empfindliche Methode, die ist erkennen Veränderungen im Biofilm und ermöglichen grundlegende biologische Deutung der Verschiebungen auf die funktionellen und strukturellen Ebene, erforderlich.

Wir haben eine neue Methode zur Charakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaft der phototrophe Komponente von Stream Biofilmen (Periphyton), entwickelt, ist schnell genug für Überwachungszwecke und gleichzeitig ausreichend informiert über den Biofilm-Gemeinschaft Struktur, biologische Deutung15zu ermöglichen. Es basiert auf einzellige Durchflusszytometrie (FC) der Biofilm Proben und gepaart mit computergestützten Visualisierung und bietet Informationen über optische und fluoreszierende Eigenschaften des Biofilms auf der Ebene der einzelnen Zelle.

Der Workflow nach der Probenahme Biofilm besteht der Probenvorbereitung in Form von Beschallung, Fixierung und Größe-basierte Filterung der Proben, gefolgt von der Beurteilung der Probenmaterials durch Durchflusszytometrie. Die erfassten Daten geben Auskunft über mehrere zellulären Eigenschaften in einer einzigen Messung: Partikelgröße, Dichte, Pigmentanteil, abiotische Inhalte (z. B. mikroplastik) im Biofilm. Dieser Satz von Daten ist als über computergestützte Visualisierung mit visuellen stochastische Nachbar einbetten (ViSNE)16, ermöglicht schnelle und einfache Interpretation der Daten analysiert. Obwohl ein paar Wochen erforderlich sind, um einrichten und optimieren die Methode einmal eingerichtet, es dauert nur wenige Stunden von den Biofilm Probenahmen zur Interpretation der Ergebnisse.

Die wichtigsten Vorteile der vorgestellten Methode gegenüber anderen sind die Geschwindigkeit der Analyse und hohen Informationsgehalt. Darüber hinaus können die Proben für mehrere Wochen nach der Entnahme ohne Verlust von ihren optischen und Fluoreszenzeigenschaften gespeichert werden. Dies kann sehr nützlich sein bei der Charakterisierung von einer großen Anzahl von Proben ist erforderlich, wie z. B. große Stichproben Studien oder Biomonitoring-Programme, sondern bieten auch eine beträchtliche Menge an Informationen in kleinere explorative Studien.

Die vorgestellte Protokoll basiert auf Fluss-durchflusszytometrischen Analyse von phototrophe Biofilmen (Periphyton) von verschiedenen Standorten eines Baches gesammelt. Viele Schritte des Protokolls, z. B. die Auswahl der Standorte für Überwachungszwecke, die Ziele der Forschung abhängig und daher können nicht verordnet werden. Andere weniger Freiheit ermöglichen und erfordern, dass das Protokoll aufmerksam verfolgt, wird in das ausführliche Protokoll unten deutlich.

Das Protokoll beginnt mit der Auswahl der Standorte für Biofilm-basiertes Umweltmonitoring. Der nächste Schritt ist Setup Durchflusszytometer (FC), so dass seine Messungen Diskriminierung zwischen verschiedenen phototrophe Organismen in Biofilmen in der überwachten Umgebung ermöglichen. Dies erfolgt durch das Sammeln von Biofilm-Proben von den Sites, identifizieren die fluoreszierenden Eigenschaften der verschiedenen Arten in den Biofilm und Einrichten der Durchflusszytometer mit Laser und Filter, die Messung an den entsprechenden optischen aktivieren Wellenlängen. Nachdem die FC Aufbau wurde, können Biofilme werden gesammelt von den Seiten in regelmäßigen Abständen die optischen und fluoreszierenden Eigenschaften der einzelnen Partikel in den Biofilm-Durchflusszytometrie gemessen und die Daten analysiert durch visuelle clustering. Für bessere Interpretation der Ergebnisse ist es möglich, eine FC-Referenzdatenbank von lokalen Biofilm-Lebewesen und ihre Phänotypen zu bauen und die Datenbank verwenden, um verschiedene Taxonomien in den FC-Daten zu identifizieren. Die Validierung ist möglich durch Fluoreszenz basierende Sortierung der identifizierten Cluster von Einzelzellen mit FACS und Mikroskopie-basierte taxonomische Identifizierung der vorliegenden Art. Eine schematische Darstellung des Protokolls ist in Abbildung 1aufgeführt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

(1) Ökosystem Auswahl und Biofilm-Sampling

  1. Wählen Sie eine aquatische Ökosystem von Interesse und finden Sie Probenahmestellen wo Biofilme wachsen zu. Flache Teile eines Baches mit langsam zum Medium Wasser fließen und einen steinigen Flussbett zur Befestigung der Biofilm sind geeignete17,18.
  2. Optional: Wenn die Website nicht genügend Flächen zur Befestigung der Biofilm zu verringern und einen die Biofilme Variabilität innerhalb einer Website haben, setzen Sie künstlichen Substraten für Biofilm-Anlage (z.B. Glas-Objektträger, keramische Fliesen) Ortsbild, gleichzeitig aber dafür sorgen, dass Sie befinden sich in der gleichen Richtung in Bezug auf den Wasserfluss und ähnliche Tiefe und Intensität des Lichts19.
  3. Um festzustellen, die Umweltbedingungen der Probenahme-Website, verwenden tragbare Messgeräte zur Messung der Lichtintensität, ist Temperatur, Leitfähigkeit, Sauerstoff und pH-Wert direkt über der Oberfläche Biofilm, entnommen werden. Im Laufe der Probenahme Maßnahmen Sie wiederholt (3 – 5) um Mittelwerte zu berechnen.
  4. Optional: Nehmen Wasserproben Ermittlung relevanter Wasser Chemie Parameter (gelösten organischen Kohlenstoffs (DOC), K+, Na+, Ca2 +, Mg2 +, Cl–, F-, SO42 -, PO42- , Keine32-, SiO44-).
  5. Mit Schutzhandschuhen, sammeln Sie vergleichbare Steinen (Größe, Form und Art) von jeder Seite (oder künstlichen Substraten). Die Stones sollten ähnliche Flow und Lichtverhältnissen18ausgesetzt werden.
  6. Filtern Sie genug Strom Wasser von der Website durch 0,22-μm-Filter, so dass es für alle gesammelten Proben (z. B. 15 mL pro Probe) bereit ist.
  7. Verwenden Sie eine weiche Zahnbürste zum Entfernen des Biofilms vom Substrat in einer Flasche (Bürste, bis alle Biofilm entfernt wird) mit 15 mL gefiltertem Strom Wasser20.
  8. Befestigen Sie die Proben in 0,01 % Paraformaldehyd und 0,1 % Glutaraldehyd21.

2. Bestimmung der optimalen Durchfluss-durchflusszytometrischen (FC) Parameter

  1. Teilproben auf einem Lichtmikroskop übertragen (mit einem 40 X / 0,75 Ziel; verwenden Sie ggf. ein 100 × 1,3-Öl-Ziel) und identifizieren die Artenvielfalt in den Proben22,23.
  2. Bestellung identifiziert einzelne Spezies aus entsprechende Kultur Sammlungen (z.B. experimentelle Phykologie und Kultur Sammlung von Algen an der Universität Göttingen [EPSAG] oder Kultur Sammlung von Algen an der Universität zu Köln [CCAC] Wenn die Überwachung in den zentralen europäischen Ökosystemen erfolgt).
  3. Wachsen Sie die einzige Art in ähnlicher Umweltbedingungen (z. B. Licht, Temperatur, pH-Wert) kontinuierlich an die Umgebung, die, der die Biofilm Proben entnommen wurden. Innerhalb von 1 ° C und 0,5 pH-Punkt aus der Umweltproben empfiehlt.
  4. Zum lösen/Dispergieren der Zellen, 15 mL der einzelnen Arten Proben in Zentrifuge Röhren und legen Sie die Rohre in der Mitte von einem Wasserbad und Tauchen Sie, so dass die flüssige Oberfläche der Probe auf dem gleichen Niveau wie die Oberfläche des Bades ist. Beschallen Sie die Proben 1 min 45 kHz24,25.
  5. Notieren Sie die Absorption und Fluoreszenz Spektren der einzelnen Arten mit einem Teller-Reader. Entnehmen Sie bitte Platte Leser Wahl für Anweisungen. In diesem Beispiel 96-Well Flachboden transparenten Polystyrol-Platten wurden mit 200 µL Probenvolumen geladen und Extinktion gemessen. (Einstellungen verwendet: (a) Fluoreszenz-Scan-Modus; Emission Wellenlänge Schritt Größe 10 nm, Emission Scan Nummer 30, Bandbreite 20 nm, gewinnen 100, 25 Blitze, 20 US Scan Zeit oder (b) Absorption Integrationsmodus; 25 Blitze, Bandbreite 9 nm).
  6. Richten Sie das Durchflusszytometer mit Laser, dichroitischen Splitter und Filter, die in Kombination diese fluoreszierende Bereiche abdecken, in denen verschiedene Arten bestimmte Eigenschaften haben. Für zentrale europäische Ströme, ein 405 nm, 488 nm und 638 nm Laser brauchbare Ergebnisse produzieren.
  7. Passen Sie die Spannungseinstellung von den Photomultipliern (gilt nicht für alle fließen Cytometers) und das Leistungsspektrum der gemessenen Ausblühungen um mehr als 99 % aller Ereignisse der Proben erweitert.
  8. Alternativ, wenn Kenntnisse über Artenvielfalt in den Biofilmen verfügbar ist, beginnen Sie mit Schritt 2.2. Wenn fluoreszierende Eigenschaften bekannt sind, beginnen Sie mit Schritt 2.6.

3. optional: Vorbereitung einer Flow-durchflusszytometrischen Referenzdatenbank

Hinweis: FC erlaubt keine taxonomische Identifizierung der Zellen in den Biofilm. Eine Referenzdatenbank FC Messungen einzelner Arten bekannt, vorhanden in den Biofilmen, unter ähnlichen Bedingungen wie die Biofilme gewachsen sein helfen bei der Interpretation der Daten.

  1. Hinweis: einzelne Spezies
    1. Mit den optimierten Parametern FC 2,5 – 7 einrichten, die optischen und fluoreszierenden Eigenschaften der einzelnen Arten (in Paraformaldehyd und Glutaraldehyd fixiert und durch Filter von geeigneter Größe für das Durchflusszytometer gefiltert) zu messen.
    2. Normalisieren Sie die Daten von einzelnen Arten in der gleichen Weise wie die Daten aus den Biofilmen (siehe Schritt 6.1.2).
  2. Referenz: beschädigte und zerfallende Zellen
    Einer der wichtigsten Indikatoren der Biofilm-Gesundheit ist der Anteil der beschädigt/sterben Zellen im Biofilm vorhanden. Zur Quantifizierung dieser Zellen kann ein Verweis der verfallenden Zellen hergestellt werden.
    1. Nehmen Sie 1 mL Teilproben von verdünnten Biofilmen und Zentrifugieren sie bei Raumtemperatur bei 8.000 X g für 10 Minuten in einer Tischplatte Zentrifuge. Das resultierende Pellet in 1 mL 90 % Ethanol auszusetzen und die Suspension über Nacht bei 4 ° c Lagern Am nächsten Tag wiederholen.
    2. Mit der optimierten FC-Einstellungen, Messen Sie die optischen und fluoreszierenden Eigenschaften der beschädigten und zerfallenden Zellen (fixiert und gefiltert).
  3. Referenz: mikroplastik
    Hinweis: bei Interesse bei der Überwachung der Microplastic Partikel in den Biofilmen, prüfen Sie, ob sie genug unterscheiden sich von biotischen Partikel in der optischen und Fluoreszenzeigenschaften zur Identifikation.
    1. Auszusetzen Sie die Microplastic Partikel gemäß den Anweisungen des Herstellers mikroplastik und Messen Sie ihre optischen und fluoreszierenden Eigenschaften (mit FC-Parameter von 2,7).
    2. Der Biofilm-Probe die Microplastic Partikel hinzu und lassen Sie über Nacht bei 4 ° C.
    3. Filtern Sie die Federung und Messen mit der gleichen FC-Parametern wie oben.

4. Probieren Sie Zubereitung und Lagerung

  1. Nachdem die FC eingerichtet wurde und die FC-Referenz-Datenbank bereit ist, kann man mit der Auswertung der frischen Biofilm Proben entsprechend Schritte 1.1 – 7 Vorgehen. Zum lösen/Dispergieren der Biofilm, übertragen Sie 15 mL der Proben aus den Kolben (siehe Schritt 1,7) in Zentrifuge Rohre.
  2. Setzen Sie jedes Rohr in der Mitte von einem Wasserbad und Tauchen Sie, so dass die flüssige Oberfläche der Probe auf dem gleichen Niveau wie die Oberfläche des Bades ist. Beschallen Sie die Proben 1 min bei 45 kHz.
  3. Befestigen Sie die Proben in 0,01 % Paraformaldehyd und 0,1 % Glutaraldehyd (bestand im Nanopure Wasser). Lagerung bei 4 ° C bis zur Analyse bereit.
  4. Wichtig: Verwenden Sie die Hälfte der Proben für die Durchflusszytometrie Analyse und halten Sie die Hälfte im Speicher für Sicherheit und optional Validierung mit Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung und/oder Lichtmikroskopie (siehe Abschnitt 6).
    Beachten Sie: gespeichert in den Kühlschrank stellen, sollten die festen Biofilm Proben ihrer optischen und fluoreszierenden Eigenschaften für bis zu drei Wochen halten.

5. Ausführen des Beispiels durch den FC

  1. Wenn die Proben im Kühlschrank aufbewahrt wurden, Beschallen sie schnell oder pipette mehrmals, um die Partikel zu trennen. Filtern Sie die Teilproben mit 50 μm-Filter (Filtergröße hängt die Breite der FC Kapillare) vor der Messung.
  2. Laden Sie die einzelnen Samples (1 – 2 mL, dies hängt von der Durchflusszytometer verwendet) in das Durchflusszytometer und die optischen und fluoreszierenden Eigenschaften jedes Teilchens zu messen. Wiederholen Sie die Messung dreimal pro jedes biologische replizieren (drei technische Wiederholungen).
  3. Exportieren Sie die Daten aus der FC im CSV-Format.

6. die Datenaufbereitung und Korrelationsanalyse

FC kann mehrere Parameter (z.B.Signalbereich, Höhe, Breite) für jeden gemessenen optischen Eigenschaften und Fluoreszenz-Bereich analysieren. Führen Sie eine Korrelationsanalyse auf den Messgrößen und halten Sie nur die Messungen, die nicht stark korreliert sind. Dadurch entfällt in der Regel alle, aber ein FC-Parameter (z.B. Signalbereich) und können auch entfernen stark korreliert fluoreszierende Messungen (in der Regel die aus dem gleichen Laser und benachbarten Filter).

  1. CYT als eine Toolbox in Matlab ausführen:
    1. Der reduzierten FC Importdaten im CSV-Format aus den Proben, die analysiert werden, in die CYT Software16, einschließlich aller technischen und biologischen repliziert. (Klicken Sie auf + Datei *.CSV zu filtern, wählen Sie Dateien für den Import).
    2. Die fluoreszierende Kanäle aller Proben, die Verwendung der hyperbolischen ARCSIN Transformation zu verwandeln. Der Wert der Cofaktor muss ausgewählt werden; für bestimmte Versuchsaufbauten und heterotrophen Biofilme werden 150 Werke für die meisten phototrophe Biofilme und fließen Cytometers sondern Optimierung. (Right-Click/Transform/geben Sie Cofaktor 150)
    3. Für die Qualitätskontrolle visuell zu vergleichen (im CYT) die Histogramme der einzelnen Proben und optische und fluoreszierende Einzelkanäle um sicherzustellen, dass die technischen und biologischen Ebene der Replikation gibt es keine Ausreißer. Ausreißer werden in deutlich verschobenen Leuchtstoff/optische Verteilungen zwischen den Wiederholungen manifestieren. (Daten auswählen, wählen Sie Kanal, Plot)
      1. Alternative: laufen Sie eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) auf die mittlere Werte der fluoreszierenden Distributionen und stellen Sie sicher, dass technische und biologische Wiederholungen zusammen gruppieren.
    4. Zusammenführung der technischen in jedem biologischen Replikation repliziert und Teilstichprobe der biologischen repliziert, so dass jeweils die gleiche Anzahl von Teilchen (Zellen, Zelle Fragment und abiotischen Partikeln) vertreten ist und damit die Gesamtzahl der Partikel durch analysiert Barnes-Hütte stochastische Nachbar einbetten (bh-SNE) ist rund 150.000 (für beste Visualisierung Ergebnisse26). (Wählen Sie Daten, Rechte Maustaste, Merge/Teilstichprobe)
    5. Für den Vergleich zwischen Proben ist es wichtig, nur diese Proben auswählen, die verglichen werden sollen. Wählen Sie die Proben und führen Sie bh-SNE27. Sobald der Algorithmus beendet, neue Kanäle ist, erscheinen benannte bh-SNE1 und bh-SNE2. Dies sind die SNE-Koordinaten aller analysierten Partikel, die verwendet werden können, um die Daten in einem Streudiagramm (ViSNE Karte) zu visualisieren. (Daten auswählen, wählen Sie Kanäle, Rechte Maustaste, bh-SNE, ja normalisierten Daten)
    6. Partikel sind in der Karte ViSNE nach Ähnlichkeit positioniert und in optisch trennbar Cluster gruppiert. Überprüfen Sie den optische/fluoreszierende Eigenschaften der Cluster und Mark und Namen sind gut getrennt und haben verschiedene optische/Fluoreszenzeigenschaften von mit den Zeichenwerkzeugen in CYT erhältlich. (Wählen Sie Kanal bh-SNE1, bh-SNE2)
    7. Optional: Wenn eine Referenzdatenbank von mikrobiellen Spezies (gemessen mit der gleichen Durchflusszytometrie Einstellung und unter ähnlichen Bedingungen gewachsen!) zur Verfügung steht, ViSNE Karten in Matlab exportieren und die Karten die Referenzdatenbank projizieren. Auf diese Weise können bestimmte Cluster an bestimmten Arten/taxonomischen Gruppen (Skripte zum Download unter https://github.com/anzezupanic/FC_analysis) angeschlossen werden. (Sitzung/speichern)
    8. Problembehandlung: Wenn die bh-ans-Analyse nicht optisch trennbar Cluster, sondern eine einzige große zurück, zu viele Partikel in der bh-ans dienten. Wiederholen Sie den Vorgang mit weniger Partikel pro Probe. Wenn es keine Cluster, aber eher spärlich Einzelpunkte gibt, erhöhen Sie die Anzahl der Teilchen verwendet.
  2. Optional: Anstatt auf bh-SNE für das clustering, andere clustering Methoden (z.B.hierarchische, Schwerpunkt-basierte oder Dichte basierend clustering) verwendet werden können auf die normalisierten Daten und dann überlagert die ViSNE Karte (https://github.com/ Anzezupanic/FC_analysis).
  3. Sobald der Cluster identifiziert wurden, die Anzahl der Teilchen pro Cluster gehören zu jedem biologischen replizieren in jeder Probe. Bewerten Sie Unterschiede zwischen den Proben mit ANOVA und Tukey Test mit entsprechenden (z. B.Holmes) Korrektur für mehrere Vergleich.

7. optional: Validierung von Cluster-Interpretation mit Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung

  1. Sobald der Cluster identifiziert haben, verwenden Sie Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS), um sie aus den Proben, wenn gewünscht, zu sortieren, sofern die FACS (identische oder ähnliche) Konfiguration von Lasern und fluoreszierenden Filter hat.
  2. Für jeden identifizierten Cluster bietet CYT optische und fluoreszierende Tore, die den Cluster zu definieren. Verwenden Sie diese Tore zu sortieren, die Partikel in jedem Cluster mit dem FACS und dann die sortierten Zellen mittels Lichtmikroskopie zu identifizieren.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Mit dem Verfahren hier vorgestellten (Abbildung 1), wurden Proben aus mehreren Standorten von einem lokalen Strom in der Schweiz analysiert. An jedem Standort drei ähnliche große Steinen (10 – 12 cm) entstanden und Biofilmen waren die Stones abgebürstet. Die Proben wurden dann beschallt, fixiert, gefiltert und später durch Durchflusszytometrie analysiert. Das Setup der Durchflusszytometer und Referenz-Datenbank verwendet, waren die gleichen wie in einem frühe...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Das oben beschriebene Protokoll ist relativ einfach zu implementieren. Während die vorgestellten Standardeinstellungen für alle phototrophe Biofilm getestet bisher geeignet gezeigt wurden, ist jedoch Optimierung (wie im Protokoll beschrieben) notwendig, die Informationen aus der Methode zu maximieren. In der Tat, die optischen und fluoreszierenden Eigenschaften von Biofilmen können variieren, abhängig von den Umgebungsbedingungen (Jahreszeit, Temperatur, chemische Zusammensetzung des Wassers)1. Da...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die vorgestellte Arbeit wurde von einem SNF Ambizione Fellowship (PZ00P2_142533) und ein Velux-Forschungsstipendium (Amplebig) unterstützt. Wir möchten Bettina Wagner für Hilfe bei der experimentellen Arbeit zu danken.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MultimeterWTWMultiLine 3620 IDSZur Messung von Temperatur, pH-Wert, gelöstem Sauerstoff
UltraschallreinigerVWR International97043-986Tankabmessungen: 15*14*10 cm
DurchflusszytometerBeckman CoulterGallios Laser: 405, 488 und 638 nm. Filtert die Bänder in der ergänzenden Tabelle 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. 
PlattenleserTecanInfinite M200zur Auswahl der geeigneten Einstellung des FC-Zellsortierers
Beckman CoulterMoFlo AstriosEinstellungen in der ergänzenden Tabelle 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. 
FluoreszenzmikroskopZeissAxiovert 135Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0,75 Objektiv
SOFTWARE
MatlabMathWorksR2013aSoftware für numerisches Rechnen
CYT Dana Pe'er LabVersion 1.1kostenloses interaktives Visualisierungstool zur Analyse von Zytometriedaten

Referenzen

  1. Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (4), 251-263 (2016).
  2. Rotter, S., Heilmeier, H., Altenburger, R., Schmitt-Jansen, M. Multiple stressors in periphyton - comparison of observed and predicted tolerance responses to high ionic loads and herbicide exposure. J Appl Ecol. 50 (6), 1459-1468 (2013).
  3. Tlili, A., et al. Pollution-induced community tolerance (PICT): towards an ecologically relevant risk assessment of chemicals in aquatic systems. Freshw Biol. 61 (12), 2141-2151 (2016).
  4. Lavoie, I., Lavoie, M., Fortin, C. A mine of information: Benthic algal communities as biomonitors of metal contamination from abandoned tailings. Science of the Total Environment. 425, 231-241 (2012).
  5. Tlili, A., Montuelle, B., Berard, A., Bouchez, A. Impact of chronic and acute pesticide exposures on periphyton communities. Sci Total Environ. 409 (11), 2102-2113 (2011).
  6. Dorigo, U., et al. Lotic biofilm community structure and pesticide tolerance along a contamination gradient in a vineyard area. Aquat Microb Ecol. 50 (1), 91-102 (2007).
  7. Pesce, S., et al. Evaluation of single and joint toxic effects of diuron and its main metabolites on natural phototrophic biofilms using a pollution-induced community tolerance (PICT) approach. Aquat Toxicol. 99 (4), 492-499 (2010).
  8. Ricart, M., et al. Effects of low concentrations of the phenylurea herbicide diuron on biofilm algae and bacteria. Chemosphere. 76 (10), 1392-1401 (2009).
  9. Martinez, A., Kominoski, J. S., Larranaga, A. Leaf-litter leachate concentration promotes heterotrophy in freshwater biofilms: Understanding consequences of water scarcity. Sci Total Environ. , 1677-1684 (2017).
  10. Corcoll, N., et al. Comparison of four DNA extraction methods for comprehensive assessment of 16S rRNA bacterial diversity in marine biofilms using high-throughput sequencing. Fems Microbiol Lett. 364 (14), (2017).
  11. Welsh, A. K., McLean, R. J. Characterization of bacteria in mixed biofilm communities using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1, Unit 1E 1 (2007).
  12. Ranjard, L., et al. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: Biological and methodological variability. Appl Environm Microbiol. 67 (10), 4479-4487 (2001).
  13. Stewart, T. J., Traber, J., Kroll, A., Behra, R., Sigg, L. Characterization of extracellular polymeric substances (EPS) from periphyton using liquid chromatography-organic carbon detection-organic nitrogen detection (LC-OCD-OND). Environ Sci Pollut R. 20 (5), 3214-3223 (2013).
  14. Kroll, A., et al. Mixed messages from benthic microbial communities exposed to nanoparticulate and ionic silver: 3D structure picks up nano-specific effects, while EPS and traditional endpoints indicate a concentration-dependent impact of silver ions. Environ Sci Pollut R. 23 (5), 4218-4234 (2016).
  15. Sgier, L., Freimann, R., Zupanic, A., Kroll, A. Flow cytometry combined with viSNE for the analysis of microbial biofilms and detection of microplastics. Nat Commun. 7, 11587(2016).
  16. Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31 (6), 545-552 (2013).
  17. Mora-Gomez, J., Freixa, A., Perujo, N., Barral-Fraga, L. Limits of the biofilm concept and types of aquatic biofilms. Aquatic Biofilms: Ecology, Water Quality and Wastewater Treatment. , 3-27 (2016).
  18. Matthaei, C. D., Guggelberger, C., Huber, H. Local disturbance history affects patchiness of benthic river algae. Freshw Biol. 48 (9), 1514-1526 (2003).
  19. Tlili, A., Hollender, J., Kienle, C., Behra, R. Micropollutant-induced tolerance of in situ periphyton: Establishing causality in wastewater-impacted streams. Water Res. 111, 185-194 (2017).
  20. Robinson, C. T., Rushforth, S. R. Effects of physical disturbance and canopy cover on attached diatom community structure in an idaho stream. Hydrobiologia. 154, 49-59 (1987).
  21. Pomati, F., Nizzetto, L. Assessing triclosan-induced ecological and trans-generational effects in natural phytoplankton communities: A trait-based field method. Ecotoxicology. 22 (5), 779-794 (2013).
  22. Hulliger, J. Methoden zur Untersuchung und Beurteilung der Fliessgewässer. , Vol. Umwelt-Vollzug Nr. 0740, Bundesamt für Umwelt, Bern (2007).
  23. Tlili, A., et al. In situ spatio-temporal changes in pollution-induced community tolerance to zinc in autotrophic and heterotrophic biofilm communities. Ecotoxicology. 20 (8), 1823-1839 (2011).
  24. Foladori, P., Laura, B., Gianni, A., Giuliano, Z. Effects of sonication on bacteria viability in wastewater treatment plants evaluated by flow cytometry - Fecal indicators, wastewater and activated sludge. Water Res. 41 (1), 235-243 (2007).
  25. Buesing, N., Gessner, M. O. Comparison of detachment procedures for direct counts of bacteria associated with sediment particles, plant litter and epiphytic biofilms. Aquat Microb Ecol. 27 (1), 29-36 (2002).
  26. van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. J Mach Learn Res. 9, 2579-2605 (2008).
  27. van der Maaten, L. Accelerating t-SNE using Tree-Based Algorithms. J Mach Learn Res. 15, 3221-3245 (2014).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

GemeinschaftszusammensetzungPartikelanalyseFluoreszenzeigenschaftenoptische EigenschaftenviSNE AnalyseProbenvorbereitungUmwelt berwachungWasserqualit t
Charakterisierung der aquatischen Biofilme mit Durchflusszytometrie
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.