Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila

Orgel, Orgel-Kommunikation ist eine evolutionär konservierte Strategie für die Aufrechterhaltung der Homöostase um Veränderungen der Umwelt gerecht zu werden. Bei Menschen, eine Vielzahl von Hormonen Arereleased von den endokrinen Drüsen in den Blutkreislauf. Viele dieser Hormone gezielt im Hypothalamus des Gehirns, die Stoffwechselprozesse und grundlegende Verhaltensweisen wie Fütterung^1,2regelt. Viele Hormone sind mit Säugetieren Modelle entdeckt worden. Die Mechanismen ihres Handelns, vor allem die interorgan Netzwerke, an denen sie teilnehmen, bleiben jedoch weitgehend unklar.

Drosophila Melanogaster hat ein nützliches Modell für das Studium der Orgel, Orgel-Kommunikation entwickelt. Bei Insekten sind viele physiologische Prozesse durch Hormone gesteuert. Frühe Studien mit Schwerpunkt auf Wachstum und Metamorphose verwendet große Insekten. In diesen Studien vorhergesagt die Entfernung oder die Transplantation von bestimmten Organen die Existenz von Inter Orgel Signalmoleküle; später wurden Juvenilhormon (JH), Prothoracicotropic Hormon (PTTH) und Ecdyson biochemisch gereinigten^3,4,5. Eine große Familie von interzellulären Signalisierung Peptide wird gedacht, um während der Insekten Lebenszyklus^6,7in verschiedenen physiologischen Ereignisse einbezogen werden. Die meisten dieser Peptide wirken auf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), obwohl die spezifische GPCRs zunächst schwer zu identifizieren, mit herkömmlichen Ansätzen waren. Die Veröffentlichung der Drosophila ganze Genom-Sequenz⁸ war der Durchbruch, der die Identifizierung von Drosophila bioaktiven Peptiden basierend auf ihre Homologie mit denen in anderen Insekten aktiviert. Darüber hinaus wurden die Rezeptoren für verschiedene Peptide von GPCRs vorhergesagt im Genom mit Kultur-zellbasierte GPCR-Ligand verbindliche Tests identifiziert. Als nächstes vorhergesagt Expressionsanalysen die Orgel, Orgel-Wege ausgelöst durch diese Peptide und Rezeptoren. Insbesondere werden viele der vermeintlichen Peptid-Rezeptoren ausgedrückt im Gehirn, was darauf hindeutet, dass das Gehirn ein wichtiges Ziel von Peptid-Hormone-⁹. Darüber hinaus haben die genetische Sonderwerkzeuge in Drosophila zur Identifizierung der physiologischen Rollen von Peptid-GPCR Kombinationen beigetragen. Zum Beispiel ermöglichen die GAL4 und LexA binäre transkriptionelle basierenden gen-Knockdown oder Überexpression räumlich und zeitlich kontrolliert. GAL4, einen Transkriptionsfaktor identifiziert in Hefe, bindet an eine bestimmte Cis-regulatorische Sequenz genannt Upstream Aktivierung Sequenz (FH). In das GAL4/UAS-System die Treiber Line bietet gewebespezifischen oder Bühne-spezifische GAL4 Ausdruck und die Responder-Linie trägt UAS stromaufwärts des Gens von Interesse oder das Konstrukt Laufwerk ShRNA Ausdruck. LexA/LexAop System basiert auf einem ähnlichen Mechanismus. Phänotypische Analysen der gewebespezifischen Peptid-Zuschlag und gewebespezifische GPCR-Zuschlag Tiere können Informationen über die Peptid-GPCR Signalisierung Modus und Ort des Geschehens zeigen. Allerdings beschränken sich die Schlussfolgerungen, die allein durch genetische Daten erreicht werden können. Auf der anderen Seite sobald das vermeintliche Ziel ein bestimmtes Peptidhormon zu einem Gewebe oder Zellen Typ eingegrenzt, ex Vivo Kalzium imaging in Orgel Explantaten lässt sich die Orgel, Orgel-Kommunikation vermittelt durch Peptid-GPCR Signalisierung zu erhellen. Nach der Aktivierung eine Gq gekoppelt GPCR wird die intrazelluläre Ca^{2 +} Konzentration durch die Freisetzung von Ca^{2 +} aus dem ER¹⁰erhöht. Im Gehirn erhebt neuronalen Aktivierung auch die intrazellulären Ca^{2 +} Ebenen. Diese Ca^{2 +} Erhöhungen können durch eine Kalzium-Sensor, GCaMP, erkannt werden die Konformationsänderungen im Beisein von Ca^{2 +} was Fluoreszenz Emission¹¹erfährt.

In diesem Artikel wird ein Kalzium, die bildgebendes Verfahren mit Drosophila Gehirn explants beschrieben. Um die Fähigkeit eines Peptids, spezifische Neuronen aktivieren zu testen, wird eine Test-Peptid auf GCaMP exprimierenden Gehirn Explant angewendet und Fluoreszenz-Änderungen werden von konfokalen Mikroskopie überwacht. Die Einbeziehung der GPCR ist dann bestätigt, indem Sie den gleichen Test mit einem mutierten Gehirn fehlt der GPCR durchführen. Diese Kombination von Bildgebung und Genetik liefert präzise Informationen über die Orgel, Orgel-Kommunikation durch Peptide-GPCRs. möglich Änderungen und Anwendungen dieses Protokolls werden ebenfalls behandelt.

1. Vorbereitung des larvalen Gehirn Explantaten

1. Machen Sie eine bildgebende Kammer.
   Hinweis: Stabile Aufnahme erfordert, dass die Gehirn Explantaten angebunden werden. Hier ist eine günstige, handgefertigte bildgebende Kammer in die Ca^{2 +} imaging-System verwendet.
   1. Mit Pinzette, kratzen Sie unten in der Mitte von einem Kunststoff Kulturschale (35 mm x 10 mm) erstelle ich eine delle für die ventralen Ganglion des larvalen Gehirns machen Montage einfacher (Schritt 1.3, Abbildung 1).
   2. Platzieren Sie mit einem Zahnstocher einen kleinen Tropfen Sekundenkleber auf beiden Seiten der delle und legen Sie einen Wolfram-Stab (0,125 mm Durchmesser, 6 bis 7 mm Länge) auf den Leim.
   3. Verwenden ein kleines Stück wiederverwendbare Kitt-wie Kleber, machen eine Ringmauer (10 mm im Durchmesser und 3 mm hoch) rund um die delle (Abbildung 1).
      Hinweis: Der Raum im Inneren der Wand wird später gefüllt werden mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS; 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M PO₄^3-, pH-Wert 7,4 ± 0,05 bei 25 ° C).
2. Tierische Vorbereitung
   Hinweis: Für das Kalzium Imaging, wird ein Indikator für Kalzium, GCaMP6s, in der Zelle Art von Interesse, ausgedrückt, häufig mit Kombinationen von gewebespezifischen GAL4 und FH-GCaMP6serreicht ist. Um sicherzustellen, dass das Signal durch den Kandidaten-Rezeptor vermittelt wird, drückt sich GCaMP6s auch in einen mutierten Rezeptor defekt.
   1. Wenn experimentelle Vergleiche für verschiedene Genotypen wie Wildtyp und Mutanten erforderlich sind, Altern Sie Spiel Test Larven zur Vermeidung von GCaMP6 Ausdruck Ebene Variationen und physiologischen Unterschiede aufgrund der Entwicklungsphasen.
   2. Halten Sie Eltern fliegen (30 fliegen für jedes Geschlecht) in einem kulturfläschchen mit standard fliegen Essen für 8 h zur Eiablage auf die Oberfläche der Lebensmittel ermöglichen. Kultur-Larven in der Masse unter einen 12-h-Hell-Dunkel-Zyklus bei 25 ° C und 60-70 % relativer Luftfeuchtigkeit.
3. Dissektion des larvalen Gehirns
   1. Bei 90-120 h nach der Eiablage (AEL) sammeln Sie Larven und waschen Sie sie mindestens 3 Mal mit destilliertem Wasser, anhaftende Speisereste zu entfernen.
   2. Ort eine Larve auf einem quadratischen 1,5-Zoll-Uhrglas gefüllt mit Eis kaltem PBS.
      Hinweis: Die nächsten beiden Schritte werden in diesem Uhrglas unter dem sezierenden Mikroskop durchgeführt.
   3. Verwenden Sie Zange, sanft den Mittelteil der Larve greifen. Verwenden Sie eine andere Zange zu greifen die Mund-Haken und ziehen die Mund Haken vorsichtig, um den vorderen Teil der Larve, enthält das Gehirn vom Rest des Körpers zu trennen.
      Hinweis: Alternativ können chirurgische Scheren verwendet werden.
   4. Halten Sie die vordere Spitze von Pinzetten und umkrempeln Sie die Larve. Entfernen Sie überflüssige Gewebe des Gehirns, z. B. Ring Drüse imaginalen Festplatten und Fett Körper befestigt. Trennen Sie vorsichtig das Gehirn aus der Mundwerkzeuge.
   5. Das Innere der Ring aus der Kitt-ähnliche wiederverwendbaren Klebstoff in der bildgebenden Kammer zuweisen Sie 200 µL PBS. Saugen Sie sezierten Gehirns mit PBS in einer Pasteurpipette sanft zu, und übertragen Sie es dann in die bildgebenden Kammer.
4. Einstellung des Gehirns in der bildgebenden Kammer
   1. Verwenden Sie die Zange, um Muskelfasern erstreckt sich von der ventralen Ganglien zu greifen. Legen Sie das Gehirn sanft in die delle unterhalb der wolframdraht.
   2. Eine andere Zange, ziehen den wolframdraht leicht bis zu platzieren das Gehirn an der richtigen Stelle für imaging (Abbildung 1).

2. Erwerb von Ca^{2 +} Fluoreszenzbilder

Hinweis: Gehirn Explantaten inmitten der PBS sind abgebildet mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einer 20 X Eintauchen in Wasser Objektiv ausgestattet (N.V. = 0,5). PBS wird nicht Zellen im Gehirn aktiviert. Wenn z-Bilder benötigt werden, ist das Objektiv mit einem Piezo-aktivierte Objektiv Mover montiert. Eine drehende Scheibe konfokale Kopf wird verwendet, um die zeitliche Auflösung zu verbessern. Für Low-Light-Bildgebung ist ein Elektron Multiplikation – Coupled Ladegerät Kamera am Mikroskop montiert. Die Darstellung der GCaMP6s Fluoreszenz (Anregung/Emission: 488/509 nm) erfordert einen 488 nm Laser Erregung mit ein dichroitischer Strahlteiler und eine Emission Filter (zB., 528 ± 38 nm Band Bandpass-Filter).

1. Ort der bildgebenden Kammer, die das Gehirn Explant unter die Lupe genommen.
2. Senken Sie das Objektiv bis zum Anschlag der PBS. Positionieren Sie unter Hellfeld Beleuchtung das Gehirn und in den Vordergrund zu bringen. Wechseln Sie zu fluoreszierendes Licht und stellen Sie den Fokus auf die GCaMP6s-markierten Zellen.
   Hinweis: Die basalen grüne Fluoreszenz der GCaMP6s sollte sichtbar sein.
3. Beginnen bei 250 ms/Rahmen bei einer Auflösung von 512 × 512 Pixel in wassergekühlten Modus mithilfe der entsprechenden Datenerfassungs-Software (zB., µManager). Passen Sie die Belichtungszeit um Fluoreszenz-Werte innerhalb des dynamischen Bereichs der CCD Kamera erhalten, aber nicht weniger als 1000 (willkürliche Einheiten), mit 16-Bit-Bilder (Dynamikumfang 0-65.535).
   Hinweis: Eine geringe Belichtungszeit sollte verwendet werden, um Foto-Bleichen von den GCaMP6s zu minimieren. Belichtungszeit sollte in jedem Experiment optimiert werden, da sie von den Ausdruck GCaMP6 und die Empfindlichkeit des Detection System abhängt. Es war 100 ms in unserem Experiment mit dilp2 > GCaMP6s. Wenn Z-Profile für eine bestimmte bildgebende Tiefe erforderlich sind, können mehrere Z-Abschnitt Bilder je nach der Belichtung Zeit und Frame Abständen erworben werden. Falls die Kamera genügend räumlichen Auflösung verfügt, sollte binning Größe (Anzahl der Register auf dem Chip, der in einem digitalen Pixel klassifiziert wird) erhöht werden, um die Belichtungszeit zu reduzieren.
4. Nachdem bildgebende Parameter ermittelt wurden, nehmen Sie Bilder für 1 min vor der Verabreichung von Peptid, Grundlinie Signalintensitäten (F₀) zu erkennen.
5. Gelten Sie das Test-Peptid; Hierzu auflösen 100 µL peptidlösung mit PBS-Puffer und pipette es direkt in die Larven Wanne um eine optimale Konzentration zu erzielen.
   Hinweis: Sollte die peptidlösung langsam injiziert werden (z.B. Flow Rate 20 µL/s) in die Badewanne-Lösung mit einer Pipette. Unabhängigen synthetischen Peptid, aufgelöst in PBS dient als Negativkontrolle.
6. Die Emission von GCaMP6s für ein paar Minuten aufzeichnen.

(3) Datenanalyse

Hinweis: Imaging-Daten werden mit der ImageJ offline analysiert. Während die Zeitraffer-Bildgebung verursacht pipettieren der Larven Gehirn zu bewegen. Positionelle Aberrationen der seriellen Bilder sollten daher vor der Analyse korrigiert werden. Die Korrektur kann mit einem ImageJ-Plug-in, TurboReg wie folgt durchgeführt werden.

1. Öffnen Sie die Analysesoftware und verwenden Sie den ersten Frame (vor Peptid Anwendung) als ein Referenzbild.
2. Wählen Sie Plugins | Anmeldung | TurboReg.
3. Wählen Sie die serielle Image-Datei als Quelle und die Referenz-Bild als Ziel.
4. Überprüfen Sie Rigid Body (Parallelverschiebung und Drehung der Bilder) und präzise ("Schnell" ist grob aber schnelle Analyse stattdessen) bzw. für die Verarbeitung und Qualität.
5. Klicken Sie auf die Batch um die Bildbearbeitung zu starten.
6. Wählen Sie mehrere Regionen von Interesse (ROIs) mittels Analyse | Werkzeuge | ROI-Manager in ImageJ.
7. Die Pixel-Intensität zu messen, indem Sie mehr auf | Multi-Maßnahme | OK im ROI-Manager-Fenster.
8. Berechnen Sie ΔF/F₀ = (F - F₀) / f₀, F ist die ROI-Intensität zum Zeitpunkt des Reizes, wobei F₀ ist die Intensität auf ein Zeitfenster unmittelbar vor einem bestimmten experimentellen Ereignis (z. B. 30 frames vor dem Stimulus Onset).
9. Wiederhole das Experiment mit mehreren Gehirn Proben, Durchführung von statistischen Verarbeitung um den Mittelwert und den Standardfehler des Mittelwertes (SEM) zu jedem Zeitpunkt zu erhalten.

Unter Verwendung dieses Protokolls, wurde die Aktivierung des Gehirns Insulin-produzierenden Zellen (IPCs) durch das Peptidhormon, CCHa2, untersucht. IPCs des Wildtyp Gehirns wurden mit GCaMP6s beschriftet mit einer Kombination aus dilp2 -GAL412 (ein Geschenk von Dr. Rulifson) und FH-GCaMP6s13 (ein Geschenk von Dr. Kim). Larval Gehirn Explantaten mit einem synthetischen CCHa2 Peptid behandelt wurden, und die Fluoreszenz von GCaMP6s in Echtzeit aufgezeichnet wurde. In diesem Experiment wurden Bilder von einem einzigen Fokalebene erhalten. Jeder IPC-Cluster enthält rund 14 Zellen14und Signale von 3 bis 6 Zellen erkannt wurden. Die Signalintensität GCaMP6s wurde auf der CCHa2-Verwaltung (Abbildung 2A, Film 1) dramatisch zugenommen. Die Wildtyp Gehirne zeigte keine offensichtliche Antwort auf Ghrelin oder Nociceptin (Film 2 und 3, beziehungsweise), Säugetier-peptidhormone ohne eine Drosophila -Homolog sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die beobachteten Aktivierung des IPCs durch CCHa2 eine konkrete Antwort auf CCHa2. Um zu klären, ob CCHa2 durch CCHa2-R handelt, wurde die gleiche Analyse mit CCHa2-R mutierte Gehirne durchgeführt. Keine solche Zunahme der Signalintensität wurde nach CCHa2 Verwaltung in den mutierten Gehirnen (Movie 4) beobachtet. Statistische Analyse ergab, dass der Unterschied Signalintensität zwischen Wildtyp und CCHa2-R mutierte Gehirne innerhalb von 2 min. nach CCHa2 Anwendung wurde und wurde für mindestens 7 min (Abbildung 2B) gehalten. Diese Ergebnisse zeigen, dass IPCs speziell aktiviert werden, durch CCHa2 durch CCHa2-R. Alle Peptide, die in dieser Studie verwendet wurden durch PBS, eine Endkonzentration von 10-9 M Ausbeute verdünnt.

Abbildung 1 . Bildgebung Kammer
(A) Kultur Gericht (35 mm x 10 mm) mit eine kleine Delle und tethering Rod. (B) ringförmige Mauer aus Kitt-ähnliche wiederverwendbaren Klebstoffe. (C) A larval Gehirn Explant eingefügt in der bildgebenden Kammer. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 . Kalzium-Bildgebung der Larven Gehirn Explant
Wildtyp (dilp2-Gal4/UAS-GCaMP6s) Gehirn war CCHa2, Ghrelin und Nociceptin ausgesetzt. CCHa2-R Mutant (dilp2-Gal4, CCHa2-RTAL-34/FH-GCaMP6s, CCHa2-RTAL-34) Gehirn CCHa2 ausgesetzt war. GCaMP6s Signale in IPCs wurden durch konfokale Mikroskopie bei 250 ms/Frame erkannt. Noch sind Bilder von ausgewählten Zeitpunkten in (A) angezeigt. Die Bilder waren pseudocolored, unterschiedliche Signalintensitäten besser zu visualisieren. ΔF/F0 zu jedem Zeitpunkt wurde in (B) aufgetragen. ΔF/F0 wurde von 5 auf 10 verschiedenen Zubereitungen berechnet. ROIs wurden in Zellkörpern gesetzt, die in einer gleichen Brennebene detektiert wurden. Die durchgezogenen Linien zeigen den Mittelwert von 5 bis 10 Proben, und die gestrichelten Linien markieren Sie Ober- und Untergrenzen der Standardfehler des Mittelwerts. Die schraffierten Flächen zeigen die Variation der Signale in den Experimenten. Maßstabsleiste zeigt 50 µm. Die Figur ist aus Sano Et Al. angepasst 15. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Film 1. Wildtyp IPCs ausgesetzt CCHa215 Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Film 2. Wildtyp IPCs Ghrelin ausgesetzt15 Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Film 3. Wildtyp IPCs ausgesetzt Nociceptin15 Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Film 4. CCHa2-R Mutant IPCs ausgesetzt CCHa2 15 Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)

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