Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

Zusammenfassung

Wir präsentieren Ihnen eine automatisierte Methode zur dreidimensionalen Rekonstruktion der Keimbahn Caenorhabditis Elegans . Unsere Methode bestimmt die Anzahl und Position der jeder Kern in die Keimbahn und Analysen Keimbahn PROTEINVERTEILUNG und Zytoskeletts Struktur.

Zusammenfassung

Die Keimbahn Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) wird verwendet, um mehrere biologisch wichtigen Prozesse einschließlich Stammzell-Entwicklung, Apoptose und Chromosom Dynamik zu studieren. Während die Keimbahn ein ausgezeichnetes Modell ist, ist die Analyse oft zweidimensional aufgrund der Zeit- und Arbeitsaufwand für die dreidimensionale Analyse. Wichtige Messwerte in solchen Studien werden die Anzahl/Position der Kerne und PROTEINVERTEILUNG in die Keimbahn. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur automatisierten Analyse der Keimbahn mit konfokalen Mikroskopie und rechnerische Ansätze um zu bestimmen, die Anzahl und Position der Kerne in den einzelnen Regionen der Keimbahn durchführen. Unsere Methode analysiert auch die Keimbahn PROTEINVERTEILUNG, die es die dreidimensionale Untersuchung von Protein-Expression in verschiedene genetische Hintergründe ermöglicht. Unsere Studie zeigt weiter, Variationen im Zellskelett Architektur in unterschiedlichen Regionen der Keimbahn, die räumliche Entwicklung Anforderungen aufnehmen kann. Unsere Methode ermöglicht schließlich automatisierte Zählung der Spermien in die samentasche des einzelnen Keimbahn. Zusammen genommen, ermöglicht unsere Methode schnelle und reproduzierbare phänotypische Analyse von C. Elegans Keimbahn.

Einleitung

Die Erhaltung der Signalwege bei Säugetieren macht C. Elegans ein hervorragendes Modell mehrere biologische Prozesse^1,2zu studieren. In unserem Labor verwenden wir die Keimbahn C. Elegans Stammzellen Entwicklung, Apoptose und Genexpression zu studieren. Während die Keimbahn eine dreidimensionale Struktur ist, sind viele Studien zweidimensional aufgrund der Zeit- und arbeitsintensiven dreidimensionale Analyse. Es ist sehr wahrscheinlich, dass zweidimensionale Analyse in Vivo -Events in die Keimbahn verfälschen kann. Das C. Elegans adult Zwitter hat zwei Keimbahn Arme, von die jeder eine somatische distale Spitze Zelle (DTC) beherbergt, die distale Keimzellen in einem undifferenzierten Zustand^3,4unterhält. Diese Keimzellen beginnen zu unterscheiden, wie sie bewegen sich weg von der DTC, seinen Einfluss zu entkommen und werden Eizellen und Spermien, wie sie das proximale Ende der Keimbahn erreichen. Während dieses Prozesses durchlaufen Keim Zellkerne Mitose, vor dem Übergang zur Meiose^5,6. Larvenstadium 4 (L4) von der Entwicklung nach dem Eizellen, während das Erwachsenenalter produziert werden Spermienproduktion komplettiert. Die Spermien werden in der samentasche gespeichert wo sie, Eizellen befruchten, Embryonen zu erzeugen.

Es gibt mehrere genetische Faktoren und Umweltfaktoren, die Keimbahn Entwicklung in C. Elegans , was zu Veränderungen in der Anzahl der Kerne, Anzahl der Apoptotic Veranstaltungen, Chromosom Dynamik und Protein-Expression bzw. Lokalisierung^{7 beeinflussen können ,8,9,10,11}. Die Analyse dieser Ereignisse erfordert die Ermittlung der einzelnen Phasen der Differenzierung, die anhand der nuklearen Morphologie und Verteilung. Um diese Parameter manuell mit einer großen Stichprobe-Größe genau zu analysieren ist arbeitsintensiv und zeitaufwändig. Um diese Nachteile zu umgehen und die Konsistenz der Analyse zu ermöglichen, entwickelten wir eine automatisierte Methode zur dreidimensionalen Prüfung von C. Elegans Keimbahn für Kerne zählen, Kerne Verteilung, Protein-Expression und Zytoskeletts Struktur. Durch die Kombination von konfokalen Mikroskopie mit dreidimensionale Darstellung, erzielten wir Größe und Form Parameter für die Identifizierung der einzelnen Phasen der Keimzelle Differenzierung. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode zählen der Keim Zellkerne und Sperma plus scoring der Chromosomenzahl in jeder Eizelle.

Eine wichtige Struktur in die Keimbahn ist das Zellskelett, das Stabilität in der Keimbahn Fach, Aids zytoplasmatischen streaming und Schutz für Keimbahn Kerne¹²bietet. Rechnerische Darstellung verwenden, wir Dreidimensionale Rekonstruktion des Zytoskeletts Keimbahn durchgeführt und identifiziert verschiedene Zellskelett Features in die Keimbahn. Hier beschreiben wir Schritt für Schritt-Protokoll zur Veranschaulichung wie computergestützte Analyse kombiniert konfokale Bildgebung ermöglicht umfassende Analyse der Keimbahn C. Elegans .

Wir schlagen eine schnelle Methode für die dreidimensionale Analyse von C. Elegans Keimbahn (Abbildung 1). Dreidimensionale Analyse verwenden, ist es möglich, die dreidimensionale Verteilung der Keimbahn Kerne (Abbildung 2 und Abbildung 3), automatische Zählung der Zellen (Abbildung 2), Rekonstruktion des Zytoskeletts Keimbahn ( zu studieren Abbildung 3), Verteilung von Proteinen (Abbildung 4), und zählen die Anzahl der Spermien in die samentasche und Chromosomen in Eizellen (Abbildung 5). Die Methode ermöglicht einfache und genaue Quantifizierung der Keimbahn nicht nur, sondern physiologisch relevante Phänotypen identifiziert.

Protokoll

1. Vorbereitung und Wurm Tierhaltung

Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien für alle Produktinformationen.

1. OP50 Escherichia coli Kultur: Kultur OP50 Bakterien in Lysogeny Brühe (LB) (1 % Tryptone, 0,5 % Hefe, 0,5 % NaCl, pH 7,0) über Nacht bei 37 ° C ohne Antibiotika.
2. Samen Sie 400 µL OP50 Bakterien, Nematoden Wachstumsfugen Medien (NGM) (1,5 g NaCl, 8,5 g Agar, 1,25 g Pepton, 1 mL 1 M CaCl₂, 5 mg/mL Cholesterin in Ethanol, 1 mL 1 M MgSO₄ 1 mL und 25 mL 1 M KPO₄ Puffer) und die Bakterien für 48 h der Luft trocknen lassen.
3. Wählen Sie Würmer auf gesetzte NGM Platten und inkubieren Sie bei 15 ° C oder 20 ° C.
   1. Wählen Sie für die Analyse der Erwachsenen Zwitter Keimbahn wohlgenährt L4-Würmer auf den bakteriellen Rasen und Inkubation über Nacht bei 20 ° C.
   2. Inkubieren Sie für die Wertung Spermienzahl in Hermaphroditen L4 Würmer bei 20 ° C für 12 h bis die Würmer die L4/Erwachsene Häutung erreichen. Um die Würmer zu L4-Stadium zu synchronisieren, bereiten Sie Eiern durch Abnehmen der erwachsenen Würmer mit einer Menge von Eiern in Bleichmittel-Lösung (1 M NaOH und Bleichmittel im Verhältnis 1:1). Lassen Sie die Eiern schlüpfen und L4 Tiere für das Experiment.
4. Bereiten Sie Teflon-Objektträger durch 25 µL Poly-L-Lysin-Lösung auf der Folie platzieren und verbreiten die Lösung gut, mit einer PIPETTENSPITZE vor. Nach dem Entfernen der überschüssigen Poly-L-Lysin mit Küchenpapier trockentupfen, ermöglichen Sie die Folien an der Luft trocknen und die Folien bei 65 ° C für 15-20 min inkubieren.

2. Keimbahn Präparation und Färbung^6,13

1. 10 µL 0,01 % Tetramisole (Narkose) auf einem 22 mm × 22 mm deckgläschen vor Ort und wählen Sie 1 - Tage alten Erwachsenen Würmer hinein.
2. Den Wurm am Heck zu sezieren, wie es sediert wird mit einer Spritze (5 mL) und einer Nadel (24 "x 1"), und damit die Keimbahn nicht beschädigt wird.
   Hinweis: Die Zerlegung muss erfolgen, bevor der Wurm vollständig gelähmt wird, so dass der Unterdruck in der Wurm und Wurm-Bewegung unterstützen das Auswerfen der Keimbahn. Zur Bewertung von Spermien, müssen Vorkehrungen getroffen werden, nicht zu beschädigen die samentasche durch die Nadel während der Präparation. Berühren Sie nicht die Keimbahn mit der Nadel mit Ausnahme der Dissektion Punkt nach der samentasche. Wenn es in die Keimbahn-Fach zu brechen oder eine Entlassung aus der Keimbahn beobachtet, sollte die Keimbahn nicht für die Analyse verwendet werden.
3. Ort der invertierten Deckglas auf einer Poly-L-Lysin beschichtete Folie, die sezierte Keimbahn auf der Folie.
4. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit unter dem Deckglas, indem man einen Papier-Turm an einer Ecke des Deckglases, dann legen Sie die Folie in flüssigem Stickstoff für 1 min. schnell das Deckglas mit Hilfe einer Nadel mit der Germlines auf der Folie zu entfernen.
5. Übertragen Sie die Folien in Methanol-20 ° C für 30-60 s in einer Kammer, dann 30 min in frisch zubereitete festlegunglösung (1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 0,08 M HEPES pH 6,9, 1,6 mM MgSO₄, 0,8 mM Ethylenglykol-Bis(beta-aminoethyl inkubieren Äther)-N, N, N', N'-Tetraacetic Säure (EGTA) und 3,7 % Paraformaldehyd) bei Raumtemperatur.
6. Die Folien zu waschen, indem man in eine Kammer mit 1 X PBS, pH 7.4 mit 0,1 % Tween-20 für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
7. Blockieren der Germlines mit 30 µL Lösung zu blockieren (30 % der ziegenserum vorbereitet, indem man 900 µL ziegenserum in 1700 µL destilliertes H₂O und 300 µL 10 X PBS) in eine Feuchte Kammer, indem man feuchten Papiertuch in einer Plastikbox bei Zimmertemperatur 30 Minuten vorbereitet.
8. Fügen Sie 50 µL der REC-8 Antikörperlösung in 30 % ziegenserum in einem Verhältnis 1: 300, jede Probe vorbereitet. Über Nacht bei 4° c inkubieren
9. Waschen Sie die Folien indem man in eine Kammer mit 1 X PBS mit 0,1 % Tween-20 für 10 min. Wiederholen Sie den Schritt einmal und überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, indem Sie ein Papiertuch auf die Ecke der Folie.
10. Bereiten Sie Sekundärantikörper Lösung durch Verdünnung grüne Fluorophore (488 nm Emissionswellenlänge) konjugierten Sekundärantikörper (1: 1000), Phalloidin (Aktin Fleck, 1:4000) und DAPI (DNA-Fleck, 1:4000) in 30 % normalem ziegenserum vor.
11. 50 µL Sekundärantikörper Lösung zur Folie hinzufügen.
12. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
13. Die Objektträger waschen zweimal, indem man in eine Kammer mit 1 X PBS mit 0,1 % Tween-20 für 10 Minuten wischen Sie überschüssige Flüssigkeit.
14. Fügen Sie 30 µL Reagenz auf der Folie zu fixieren hinzu und legen Sie ein 12 mm² x 1,5 µm Deckglas darauf und trocknen Sie die Folien bei 4 ° C über Nacht.

(3) konfokalen Mikroskopie

1. Schalten Sie die confocal Mikroskop, Laser, Resonanz-Scanner und confocal Mikroskop Software. Legen Sie die Folien mit gefärbten Germlines auf den Diahalter oben 63 X Objektiv.
2. Suchen Sie eine Keimbahn, Fokus auf der Oberseite der Keimbahn und markieren Sie ihn mit confocal Mikroskop-Software. Ebenso konzentrieren Sie sich auf der Unterseite der Keimbahn und markieren Sie ihn um die totale Keimbahn Dicke herzustellen.
3. Bild der gesamten Keimbahn definieren die Dicke der einzelnen Segmente bis zu 0.5 µm. Markieren Sie den vollständigen Erwerb der Keimbahn und Start. Jede Scheibe 8 Mal zu scannen und die Durchschnittswerte um die Bildqualität zu verbessern. Die resonante Scanner erlauben schnellen Scannen, um zu vermeiden, während der Bildgebung bleichen. Wenn das Mikroskop keinen resonanten-Scanner haben, reduzieren Sie die Anzahl der Scans auf vier bleichen zu vermeiden.

4. Post bildgebende Analyse der Kerne Anzahl und Verteilung

Hinweis: Siehe ergänzende Abbildung1 für Screenshots der Software-Tools und Tasten verwendet.

1. Importieren Sie das Bild Imaris 8.4.1 oder spätere Versionen der Software.
2. Definieren Sie mitotische Region, Übergangszone, meiotische Region, Eizelle Region und samentasche der Keimbahn durch die Identifizierung der nuklearen Morphologie in jeder region
3. Verwenden Sie die Oberfläche Funktionstaste (ergänzende Abbildung 1A) der Software, wählen Sie die Region von Interesse.
4. Brechen Sie automatische DGM-Erstellungsassistenten ab und manuell zeichnen Sie die Region von Interesse auf das erste und letzte Segment des Bildes aus dem dreidimensionalen Stapel.
5. Klicken Sie auf Create Oberfläche.
   Hinweis: Die Software wird automatisch die Stapel zwischen ersten und letzten Stapel entwickeln.
6. Maskieren Sie alle Kanäle außer DAPI Maskenkanal Schaltfläche (Ergänzende Abbildung 1 b-C).
7. Definieren Sie Kerngröße Parameter mit Hilfe der spot Funktionstaste (ergänzende Abbildung 1A). Definieren Sie für die mitotische Region einen XY-Durchmesser von 2 µm wobei Z Durchmesser nicht definiert. Definieren Sie für die Übergangszone eine XY-Durchmesser von 2 µm und Z als 1,5 µm. (ergänzende Abbildung 1).
   Hinweis: Beheben Sie die Durchmesser entsprechend der Vergrößerung und Spezifikationen des Mikroskops. Für das aktuelle Protokoll das Ziel verwendet wurde 63 X und Aufpreis 1,70 fache Vergrößerung während der Bildgebung. Ändert sich das Ziel, zum Beispiel 40 X, sollte der Durchmesser entsprechend geändert werden. Fehlerbehebung durchzuführen mit Wildtyp-Germlines, die richtigen Parameter zu etablieren. Die mitotische Region ein Wildtyp Keimbahn Arm hat ca. 250 Kerne. Der Durchmesser sollte geändert werden, um diesen Wert zu erreichen. Verwenden Sie mindestens 15 Germlines, um den optimalen Wert für den Durchmesser zu ermitteln. Ein ähnlicher Ansatz sollte verwendet werden, für die Kalibrierung der Übergangszone (150-170-Kerne) und meiotischen Region (600-700 Kerne).
8. Begrenzen Sie die Erkennung von Flecken durch die Festlegung der Untergrenze (ergänzende Abbildung 1E). Verwendung DAPI gefärbt Wildtyp Germlines um minimale Schwelle zu etablieren, durch die Erhöhung der minimalen dreidimensionale Darstellung Schwellenwerts, bis die erste Ort außerhalb der Keimbahn erscheint.
9. Speichern Sie das Bild und erhalten Sie die Anzahl der Kerne aus der Tabelle generiert automatisch von der Software. Exportieren Sie die Bilder als TIF-Dateien.

5. buchen Sie Imaging-Analyse zur Bewertung von Sperma und Chromosomenzahl

1. Führen Sie dreidimensionale Darstellung durch die Auswahl der samentasche als die Region von Interesse. Jedes Sperma zu erkennen, definieren den spot Durchmesser zwischen 0,75 - 1,0 µm für X und Y-Achse, während Z Durchmesser undefiniert bleibt. Verwenden Sie die Funktionstaste Flecken, wie ergänzende Abbildung1 gezeigt.
2. Subtrahieren Sie den Hintergrund durch Ankreuzen Hintergrund subtrahieren Box und mit Hintergrund Korrekturwerten berechnet, indem die Software (ergänzende Abbildung 1).
   Hinweis: Imaris Software wählt hoher Intensität Punkte zuerst, also die Wirkung der Herkunft ist minimal, solange gibt es wesentliche Unterschiede zwischen der Region von Interesse und den Hintergrund. Eine zweite Methode ist die Hintergrundkorrektur manuell definieren, wo geeignete Werte für den Hintergrund gegeben werden kann. Manuelle Untergrundkorrektur werden angebracht, wenn die Intensität der unabhängige Stichproben Vergleich braucht.
3. Passen Sie die dreidimensionale Darstellung Schwellenwert um alle DAPI gefärbt Spermien in der samentasche (ergänzende Abbildung 1E) zu erkennen.
4. Zum zählen von Chromosom definieren die Spotdurchmesser < 0,75 µm für X und Y-Achse vor der Entwicklung von dreidimensionaler Models.
5. Das Bild speichern und als TIF-Datei exportieren.

6. post Imaging-Analyse für Zellskelett Rekonstruktion der Keimbahn

1. Identifizieren des Interessenbereichs in die Keimbahn und Maske alle Kanäle außer Phalloidin Schaltfläche Kanäle zu maskieren .
2. Definieren Sie eine Oberflächendetails von 0,25 µm mithilfe der Oberfläche Funktionstaste (ergänzende Abbildung1).
   Hinweis: Dies bedeutet, dass jede 0,25 µm in dreidimensionale Modelle dargestellt werden soll. Oberflächendetails kann für jede Region der Keimbahn konstant sein, wo ein dreidimensionales Oberflächenmodell für jeden 0,25 µm erstellt wird. Jedoch für die Eizelle Region Oberflächendetails auf 0,35 - erhöht werden kann 0,5 µm durch das Vorhandensein von genau definierten Aktin Fasern in dieser Region.
3. Subtrahieren Sie den Hintergrund durch Ankreuzen Hintergrund subtrahieren Box und mit Hintergrund Korrekturwerten berechnet, indem die Software (ergänzende Abbildung 1).
4. Stellen Sie dreidimensionale Darstellung Schwelle je nach Struktur Analyse (ergänzende Abbildung 1E) erfordern.
5. Das entwickelte dreidimensionale Bild speichern und als TIF-Datei exportieren.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt den Zeitaufwand für die dreidimensionale Keimbahn-Analyse. L4 Hermaphroditen bei 20 ° C inkubiert wurden seziert, um Germlines zu isolieren und mit DAPI, Phalloidin und Antikörper gegen Proteine der Keimbahn befleckt. Germlines sind abgebildet mit der konfokalen Mikroskopie. Färbung und konfokalen Mikroskopie erfordert ca. 24 Std. computergestützte Analyse für die komplette Keimbahn 10-15 min erfordert, zählen Sie die Anzahl und Position der...

Diskussion

Das Ziel dieses Protokolls ist es, verbessern die Genauigkeit und reduzieren den Zeitaufwand für die Keimbahn-Analyse. Nach standard Vorbereitung der seziert Germlines ist ein dreidimensionales Modell der Keimbahn Kerne durch rechnerische Rendering vorbereitet. Und ermöglicht die Beobachtung der Keimbahn Kerne Verteilung im Raum, berechnet dreidimensionale Darstellung die Anzahl der Kerne auf bestimmte Regionen der Keimbahn. Der kritische Aspekt unserer Methode ist präzise Definition der Größe und Form der Zellkerne. Die...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
C. elegans Stämme: Wildtyp (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?( q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
OP50 Escherichia coli Bakterien	Hausgemachte
polyklonales Kaninchen Anti-REC-8	SDIX	29470002
Alexa 488 konjugierter Antikörper, gezüchtet in Ziege	Thermofisher Scientific	A-21236
Zytoskelett-Farbstoff Phalloidin	Thermofisher Scientific	A-12380
DAPI	Thermofisher Wissenschaftlich	62248
Poly-L-Lysin	Sigma Aldrich	P5899
Tetramisol	Sigma Aldrich	P5899
MgSO4	Sigma Aldrich	M7506
1M HEPES-Puffer, pH 7,4	Sigma Aldrich	G0887
10X PBS pH 7,4	Thermofisher	Scientific AM9625
Tween-20	Sigma Aldrich	P1389
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
37% Paraformaldehyd-Lösung	Merck Millipore	1040031000
Normales Ziegenserum	Sigma Aldrich	G9023
Fluoroshield Fixierreagenz	Sigma Aldrich	F6182
Ethanol	Millipore
Methanol	Sigma Aldrich	34860
20° C & 25°; CInbspator	jeder Marke
	jeder Marke
	Jede Marke (Leica, Zeiss)
Computer mit Imaris Anzug 8.4.1 oder später, volle Lizenz zur Nutzung der Software und der Matlab-Software.	Bitplane
Phospho gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4	Selbstgemachte
Teflon-Objektträger	Tekdon	Tel.: 941-322-8288