Summary
这项工作的目的是描述一个协议, 创建一个实用的脂肪水幻影, 可以定制, 以产生不同的脂肪百分比和体积的幽灵。
Abstract
随着新技术的发展, 图像脂肪组织, 验证这种协议的方法变得越来越重要。幽灵, 实验复制品的组织或器官的利益, 提供一个低成本, 灵活的解决方案。然而, 如果没有昂贵和专门的设备, 构建一个高脂肪组分的稳定幽灵(例如, > 50% 脂肪分数水平, 如棕色脂肪组织中看到的), 可能会因为脂质的疏水性而难以使用。这项工作提出了一个详细的, 低成本的协议, 以创建 5x 100 mL 幽灵与脂肪分数的 0%, 25%, 50%, 75% 和100% 使用基本实验室用品 ( 热板, 烧杯等) 和容易接近的成分 (蒸馏水, 琼脂, 水溶性表面活性剂, 苯甲酸钠, 钆-diethylenetriaminepentacetate (DTPA) 对比剂, 花生油, 油溶性表面活性剂)。该议定书的设计是灵活的;它可以用来创建不同的脂肪分数和广泛的体积的幽灵。在可行性研究中评估了用这种技术创建的幽灵, 将脂肪-水磁共振成像的脂肪分数值与构造的幽灵中的目标值进行了比较。本研究取得了 0.998 (95% 置信区间: 0.972-1. 00) 的和谐相关系数。总之, 这些研究表明, 脂肪幽灵的效用, 以验证脂肪组织成像技术在一系列临床相关组织和器官。
Introduction
使用成像方式 (如磁共振成像) 对脂肪组织和甘油三酯含量进行定量的兴趣扩展到许多领域。研究领域包括调查白色和褐色脂肪组织库和异位储存的脂质在器官和组织, 如肝脏1, 胰腺2, 骨骼肌肉3。随着这些新的脂肪定量技术的发展, 需要方法来证实成像参数对研究和临床应用是有效的。
幽灵, 一个组织或器官的实验复制品, 提供一个低成本, 灵活, 和控制的工具, 以开发和验证成像技术4。具体地说, 幽灵可以被构造成由脂肪和水组成的体积比或脂肪分数 (FF) 可比的组织的临床兴趣。临床上, 在组织和器官中的 ff 值可能会有很大变化: 在褐色脂肪组织中的 ff 介于29.7% 和 93.9%5之间;脂肪变性患者平均肝 FF 为 18.1, 9.0%6;成人的胰腺 FF 在2型糖尿病风险范围在1.6% 和 22.2%7之间;在一些晚期疾病的情况下, 杜氏肌营养不良症患者的 FF 价值在某些肌肉中的 90%,8。
由于非极性分子, 如脂质在溶液中不能溶解, 如水等极性分子, 创建稳定的幽灵与高目标 FF 仍然是挑战。对于 FF 高达 50%, 许多现有的方法可以用来创建脂肪水幽灵9,10,11,12。其他实现更高 FFs 的方法通常需要昂贵的设备, 如均质机或超声波细胞干扰器13,14。尽管这些技术为高 FF 幽灵提供了路线图, 设备限制和不同数量的实验细节限制了创造可重现和健壮的脂肪水幽灵的努力。
在这些以前的技术基础上, 我们开发了一种在可定制的 FF 值范围内构建经济高效、稳定的脂肪水幽灵的方法。此协议详细说明了使用单个热板使 5x 100 毫升的 fat 幻影具有0%、25%、50%、75% 和100% 的 FF 值所需的步骤。它可以很容易地调整, 以创建各种体积 (10 至200毫升) 和脂肪百分比 (0 到 100%)。在比较脂肪-水 MRI FF 值与构造幽灵的目标 FF 值的可行性研究中, 对幻像技术的有效性进行了评价。
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Protocol
1. 准备工作站和材料
- 遵守所有实验室安全规则。戴上眼睛保护手套。阅读每个使用的试剂的材料安全数据表, 并采取适当的预防措施。审查材料和设备清单, 化学处理程序和玻璃器皿的预防措施。
注意: 此协议要求在高温下使用热板。在与热容器进行交互时, 请小心佩戴耐热手套, 不要接触加热板表面。 - 清除工作区并用消毒剂清洁表面。洗你的手, 戴上手套。
- 消毒所有的仪器和所有的玻璃罐子里面, 以减少潜在的污染风险, 并增加幻影的寿命。
注: 如果幻影将使用超过两天, 定期清洁表面的完整的幻影与乙醇, 以防止细菌生长。
2. 准备水溶液
- 为水溶液准备工作区。将下列材料和设备放置在工作台上: 毕业气缸, 400 毫升烧杯, 搅拌杆, 鳞片, 2x 重量船, 刮刀, 2x 1.0 毫升注射器用针, 蒸馏水, 钆-diethylenetriaminepentacetate (DTPA) 造影剂,水溶性表面活性剂, 琼脂, 苯甲酸钠。
注: 注射器可用于或不使用针头。然而, 使用针头将提高测量的准确性, 并有助于防止飞溅时, 内容是添加到水或油溶液。 - 将搅拌杆放入400毫升烧杯中。使用100或200毫升的刻度筒来测量300毫升蒸馏水并将水倒入烧杯中。将烧杯放在热板上, 并设置在90°c, 搅拌率为 100 rpm。
注意: 在本协议中使用高温来实现快速的结果。由于溶液不留在热板上很长一段时间, 加热板的设定点温度并不反映溶液的温度。 - 使用校准的刻度来测量0.30 克苯甲酸钠成一条重船。在水溶液中加入苯甲酸钠。
- 用注射器测量水溶性表面活性剂的0.6 毫升。确保没有气泡。将针放在溶液中心几毫米, 慢慢释放水溶性表面活性剂, 避免溅在烧杯壁上。
- 使用干净的注射器, 测量0.24 毫升的钆-DTPA 造影剂。使用与步骤2.4 相同的技术, 将其添加到烧杯中。
注: DTPA 用于调节幻像的 MRI 松弛特性, 以匹配感兴趣的组织。读者可以调整添加的 DTPA 的体积, 以更好地匹配的松弛性质的组织的兴趣。 - 测量9.0 克琼脂成一条重船。用铲子慢慢把琼脂舀进烧杯里。
- 一旦把所有的东西都添加到水溶液中, 增加热板温度到350°c 和搅拌棒速度到 1100 rpm 5-10 分钟融化琼脂。
- 要检查琼脂是否熔化, 请简单地从热板中取出水溶液, 停止搅拌, 并检查溶液的颜色。熔化的琼脂应该是清楚的 (没有彩带或团簇) 和黄色或琥珀色。
- 一旦琼脂完全熔化, 使用注射器或倒约3.5 毫升的水溶液成一个小瓶子。如果测试解决方案没有设置或分离后5-10 分钟, 琼脂没有融化。将热板温度提高回350摄氏度, 并继续加热溶液。
- 重复步骤 2.8, 直到测试瓶中的水溶液正确设置。
- 把水溶液放在热板上50摄氏度和 100 rpm。清洁工作空间, 准备油溶液。
- 从工作台中取出以下材料: 鳞片, 2x 重量船, 铲, 2x 1.0 毫升注射器用针 (使用), 蒸馏水, 钆 DTPA 对比剂, 水溶性表面活性剂, 琼脂, 苯甲酸钠。
- 将下列材料和设备放置在工作台上: 400 毫升烧杯 (清洁), 搅拌棒 (清洁), 2.0 毫升注射器与针, 花生油, 油溶性表面活性剂。
3. 油溶液
- 将一个新的搅拌条放入一个干净的400毫升烧杯。使用一个毕业的气缸来测量300毫升的花生油和倒入烧杯。除去含有水溶液的烧杯, 将油溶液烧杯放在热板上。设置为90°c, 搅拌率为 100 rpm 1 分钟。
注: 花生油的使用, 因为它有一个类似的核磁共振谱比甘油三酯在人体脂肪组织15。- 不要把油放在热板上无人看管。如果油太热, 开始冒烟, 把它从热板上取出, 在将油送到加热板之前降低温度。
- 用干净的注射器测量3.0 毫升的油溶性表面活性剂。使用步骤2.4 中描述的相同技术, 将油溶性表面活性剂添加到烧杯中。将热板设置为150°c 和 1100 rpm 5 分钟, 完全混合油溶液。
- 从热板上取油液, 清洁工作区, 准备创建幻影。
- 从工作台中取出以下材料: 2.0 毫升注射器 (用针)、花生油和油溶性表面活性剂。
- 将下列材料和设备放置在工作台上: 250 毫升锥形瓶、搅拌棒 (清洁)、容积吸管、容积式吸管架和 5x 120 毫升玻璃罐。
4. 创建幻像乳液
- 准备水和油溶液的容积吸管。吸管应仅与各自的解决方案一起使用, 以防止交叉污染。
- 将吸管的大小与协议中使用的卷相匹配。例如, 使用 2x 50 毫升容积吸管 (50 毫升水溶液 + 50 毫升油溶液) 创建一个100毫升幻影与目标 FF 50% 脂肪。
- 将水溶液放在热板上, 并将热板设置为300°c 和 1100 rpm。4-5 分钟后, 把搅拌器关掉。
- 使用容积式吸管, 检查水溶液是否可以通过部分填充溶液的小量 (5-10 毫升) 的吸管, 并释放回烧杯中来提取。如果水溶液可以很容易地去除和释放, 而不过量残留在吸管, 移动到下一步, 否则, 留在热板和检查再次在2-3 分钟。
注: 水溶液的成分更容易设置和分离, 所以最好保持水溶液搅拌和/或温暖尽可能经常。如果水溶液在转移前没有被加热和搅拌, 那么在冷却时, 由于琼脂对凝结的倾向, 就很难测量出准确的体积。 - 小心地添加一个干净的搅拌条到250毫升锥形瓶。从热板上取水溶液, 测量适当的容积 (表 2), 并将其转移到锥形烧瓶中。
- 将油溶液放在热板上, 并设置在90°c 和 1100 rpm, 以确保解决方案是均匀的。1-2 分钟后, 从热板中取出油溶液, 用锥形瓶替换。
- 测量适量的油溶液 (表 2), 并慢慢地添加到水溶液中的锥形瓶。
- 一旦添加了所有的油溶液, 将温度提高到300摄氏度, 并保持 1100 rpm 的搅拌。搅拌混合溶液4-5 分钟 (应该有漩涡从搅拌杆)。乳液应该是白色的, 有奶油质地。
- 使用磁性搅拌条猎犬移除搅拌条。
注: 搅拌棒猎犬应用于去除所有未来乳液的搅拌条。在每次使用之间彻底清洗。 - 使用耐热手套小心倒入锥形瓶中的混合物成一个干净的120毫升玻璃罐子。慢慢地将混合物倒在玻璃罐的一侧, 以防混合物中的气泡冷却。
- 清洁锥形瓶和搅拌棒, 然后重复步骤 4.2-4.8, 调整水和油溶液的数量, 直到所有的幽灵被创造。
注意: 清洁前要确保玻璃冷却。
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Representative Results
如果正确地准备了水溶液, 少量的溶液应该凝结快速地在一个测试瓶中 (图 1,左)。如果解决方案分离 (图 1,右), 则应再次准备解决方案 (按照协议步骤3.8 中的指示)。如果乳液分离 (图 2中的例子,左和右), 幻影是不可行的, 应该被丢弃。当这种情况发生时, 通常是因为乳液没有达到足够高的温度。
成功的幽灵将凝结形成一个均匀的混合物, 可以通过核磁共振成像和测量。(图 3)。一个高一致性相关系数 (0.998; 95% 置信区间: 0.972-1. 00), 在回归线95% 置信带内包含标识线, 表明了平均 MRI 观察到的脂肪信号分数 (FSF) 值。图像中感兴趣的区域与 fat 水幽灵中已知的 FF 值没有显著差异 (图 4)。
图1。凝结 (左) 和分离 (右) 水溶液试验瓶的例证.应该取样一个小的试验瓶来评估水溶液的可行性。如果水溶液凝 (左), 继续下一步的幻影建设协议。如果水溶液分离 (由右小瓶上的两个箭头表示), 水溶液需要重新准备, 然后才能用于形成幻影乳液。
图2。不成功的幻影乳液的例子.在浇注后目视检查幻影大约10分钟, 以确定乳液是否会正确设置。如果幽灵开始分离 (左) 或出现不均匀 (右), 幽灵需要被重塑。
图3。一系列幽灵的示意图和各自的磁共振成像 (MRI) 结果.图片显示在构造的幽灵 (0%, 25%, 50%, 75% 和 100%; 顶部) 轻微的颜色差异。质子密度脂肪-信号-分数 (fsf) 图显示了同目标脂肪含量 (中间) 类似的稳定的 FSF 测量。由于玻璃容器的成像特性, 不同的边缘效应在每个 FSF 地图的边界上都是明显的。
图4。散点图显示测量的 FSF 值作为已知 FF 值的函数 (蓝色点).黑色实心线表示标识。蓝色虚线指示最佳匹配线。阴影区域表示估计值的95% 置信区间。请单击此处查看此图的较大版本.
图5。示意图, 说明协议的高级别概述.图的左上角显示了用于准备水溶液的配料、材料和热板设置, 图的右上角显示了准备油溶液的配料、材料和热板设置。底部显示了结合油和水溶液形成乳液的热板设置。请单击此处查看此图的较大版本.
| 数量 | 设备/材料 | ||
| 300毫升 | 蒸馏水 | ||
| 9.0 克 | 琼脂 | ||
| 0.6 毫升 | 水溶性表面活性剂 | ||
| 0.24 毫升 | 钆-DTPA 造影剂 | ||
| 0.3 克 | 苯甲酸钠 | ||
| 300毫升 | 花生油 | ||
| 2.0 毫升 | 油溶 Surfacant | ||
| 1 * | 搅拌器 | ||
| 3 | 搅拌杆 | ||
| 2 | 400毫升烧杯 | ||
| 1 | 250毫升锥形瓶 | ||
| 2 | 25毫升容积吸管 | ||
| 1 | 3.0 毫升注射器 | ||
| 2 | 1.0 毫升注射器 | ||
| 3 | 注射器针 | ||
| 1 | 铲 | ||
| 1 | 规模 | ||
| 2 | 重量船 | ||
| 5 | 120毫升玻璃罐 | ||
| 1 | 耐热手套 (双) | ||
| 1 | 1-3 dram 瓶 | ||
| 2 | 50毫升容积吸管 | ||
| 2 | 75毫升容积吸管 | ||
表1。 5x 100 mL 幽灵 (0%、25%、50%、75% 和 100%)所需的材料和设备数量。
| 幻影水/油测量 | ||
| 脂肪百分比 | 水溶液 | 油溶液 |
| 0% | 100毫升 | 0毫升 |
| 25% | 75毫升 | 25毫升 |
| 50% | 50毫升 | 50毫升 |
| 75% | 25毫升 | 75毫升 |
| 100% | 0毫升 | 100毫升 |
表2。测量油和水的解决方案, 以创建 5x 100 mL 幽灵 (0%, 25%, 50%, 75%, 和 100%)。
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Discussion
我们描述了一种健壮的方法来创建脂肪水幽灵, 适合验证的医学成像技术, 用于量化脂肪组织和甘油三酯含量的体内。通过创建两个水库 (一个用于石油解决方案, 一个用于水溶液), 在不需要昂贵设备的情况下建造了各种 FF 值 (包括超过50% 的值) 的稳定幽灵。高 ff 幽灵 (> 50%) 提供的效用, 以确保脂肪定量成像技术是有效的组织或器官的高 FF 值, 如褐色脂肪组织5。对 FSF 的 MRI 估计与已知 FF 值有很好的相关性。
当只有一个热板可用 (如本协议所述), 在每个解决方案中保持热量的物流是一个首要的问题。没有加热或搅拌, 水溶液可能冷却, 开始凝结。为了避免这种情况, 只要可能的话, 将水溶液放在热板上 (< 100 °c, ~ 100 rpm), 并且总是在混合幽灵之间。重要的是, 在提取每个溶液以创建幻影时, 油和水溶液都应该混合得很好。在提取解决方案之前, 请始终将各自的解决方案放在热板上至少三十年代 (< 100 °c, ~ 100 rpm)。在理想情况下, 应将分离的烤盘用于水溶液、油溶液和幻像乳液。按照上面描述的步骤创建每个解决方案。一旦完全混合, 设置两个烤盘到50°c 和 100 rpm, 以防止凝和解决。在从烧杯中提取溶液之前, 把搅拌器关掉, 等待搅拌棒完全停止移动。
虽然乳化液中油与水比的精确度和准确度是至关重要的, 但在油和水溶液中的每个组分的测量都允许更大的灵活性。在其基础上, MRI 观察到的 FSF 是衡量 "脂肪" 和 "非脂肪" 信号在总容量;因此, "非脂肪" 可以是任何化合物, 有助于图像信号强度 (水, 琼脂, 表面活性剂等). 我们仍然建议尽可能准确地测量水和油溶液的成分, 因为这些比例被发现创造最稳定和可重复的幽灵。然而, 在水溶液中琼脂量的小偏差 (例如, 8.9 而不是9.0 克), 不应影响乳液的总 FF, 如果保持油的水溶液比。由于热膨胀对各组分体积的影响, 测量室温以上的水和油溶液的体积也可能导致小的误差。考虑到水和油的体积温度膨胀系数, 如其密度16、17和温度相对较小的变化, 我们估计由于热而导致的整体 FF 误差。膨胀小于0.5%。我们还注意到, relaxivity DTPA 水和血脂的可能性可能不同。如果是这样, 并且根据脉冲序列参数, MRI FSF 测量的定量准确性可以减少。MRI 观察的 FSF 也可能与用于分析数据的频谱模型不同。
虽然这里描述的方法只用于使幽灵在10毫升和200毫升之间, 该技术可以用来产生较小或更大的体积幽灵。值得注意的是, 由于溶液的粘度, 很难从储层中提取 < 10 毫升的体积。因此, 小体积的幽灵需要多余的乳液来绘制所需的体积, 以保持最终幻影的 FF 精度。例如, 一个10毫升幻影与10% 目标 FF 需要10毫升提取从100毫升乳液。当制造大幽灵 (> 100 毫升), 搅拌杆和玻璃器皿的大小必须一起放大 (和溶液的比例, 玻璃器皿的能力), 以创造一个漩涡在解决方案时, 搅拌器设置为 > 500 rpm。如果没有涡流, 乳液就不可能达到均匀性。
鉴于创建高 FF 幽灵的复杂性, 小偏离协议可能会对最终幻影的稳定性和质量产生深远的影响。环境条件, 如室温、高度和湿度, 可能会以不一致的方式改变幻影的制备过程, 并对最终产品产生不利影响。对水溶液的中间检查提供了发现和减轻这些可能影响的机会。但是, 即使在对协议细节的严格关注下, 最终的幻影也可能会分离, 并且需要重复这个过程。
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Disclosures
提交人声明, 这项研究是在没有任何商业或金融关系的情况下进行的, 这可能被理解为潜在的利益冲突。
Acknowledgments
为这项研究提供资金支持的国家卫生研究院 (NIH) 和国立糖尿病和消化和肾脏疾病研究所 (NIDDK)/NIH R01-DK-105371。我们感谢 Houchun 博士 (哈利) 胡提出关于脂肪水幻影创造的建议和建议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled Water | Amazon | B000P9BY38 | Base of water solution |
| Agar | Sigma Aldrich Incorporated | A1296-100G | Gelling agent |
| Water-Soluble Surfactant | Sigma Aldrich Incorporated | P1379-500ML | Surfactant/emulsifying agent |
| Gadolinium-DTPA Contrast Agent | Bayer Healthcare | 50419-0188-01 | Magnetic Resonance Imaging Contrast Agent. |
| Sodium Benzoate | Sigma Aldrich Incorporated | 71300-250G | Preservative |
| Peanut Oil | Amazon | 54782-LOU | Base of oil solution |
| Oil-Soluble Surfactant | Sigma Aldrich Incorporated | S6760-250ML | Surfactant/emulsifying agent |
| Hotplate w/ Stirrer | Fisher Scientific | 07-770-152 | |
| Stir bars (Egg-Shaped) | Sigma Aldrich Incorporated | Z127116-1EA | |
| 400 mL Beaker | Sigma Aldrich Incorporated | CLS1003400-48EA | |
| 250 mL Erlenmeyer Flask | Sigma Aldrich Incorporated | CLS4450250-6EA | |
| 25 mL Glass Volumetric Pipette | Fisher Scientific | 13-650-2P | Quantity = 2 |
| 50 mL Glass Volumetric Pipette | Fisher Scientific | 13-650-2S | Quantity = 2 |
| 75 mL Glass Volumetric Pipette | Fisher Scientific | 13-650-2T | Quantity = 2 |
| 3.0 mL Syringe | Sigma Aldrich Incorporated | Z248002-1PAK | |
| 1.0 mL Syringe | Sigma Aldrich Incorporated | Z230723-1PAK | |
| Spatula | Sigma Aldrich Incorporated | S3897-1EA | |
| Scale (100g X 0.01g Resolution) | Amazon | AWS-100-BLK | |
| Weigh Boats | Sigma Aldrich Incorporated | Z740499-500EA | |
| 120 mL Glass Jars | McMaster Carr Supply Co | 3801T73 | |
| Heat Resistant Gloves (pair) | Amazon | B075GX43MN | |
| Syringe Needles | Sigma Aldrich Incorporated | Z192341-100EA | |
| 18" stir bar retriver | Fisher Scientific | 14-513-70 | |
| 1 Dram Clear Glass Vial | Fisher Scientific | 03-339-25B |
References
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