Vorbereitung, Entwicklung von peripheren olfaktorische Gewebe für Molekulare und immunhistochemische Analysen in Drosophila

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Bühne und sezieren, olfaktorische Gewebe von Drosophila -Arten zu entwickeln. Das sezierte Gewebe kann später für Molekulare Analysen, wie quantitative RT-PCR (Reverse Transkription-Polymerase Chain Reaction) oder RNA Sequenzierung (RNAseq), sowie in-Vivo -Analysen wie Immunohistochemistry oder in Situ verwendet werden Hybridisierung.

Abstract

Das olfaktorische System von Drosophila ist ein weit verbreitetes System in Entwicklungsneurobiologie, Systeme Neurowissenschaften sowie Neurophysiologie, Verhalten und Verhaltensstörungen Evolution. Drosophila olfaktorische Gewebe beherbergen die olfaktorischen Rezeptor Neuronen (ORNs), die flüchtigen chemischen Signale neben Hydro und Thermo-sensorischen Neuronen zu erkennen. In diesem Protokoll beschreiben wir die Zerlegung des peripheren olfaktorische Gewebe von Erwachsenen Drosophila -Arten zu entwickeln. Wir beschreiben zuerst zu inszenieren und Drosophila Larven, gefolgt von der Dissektion der riechzentrum Scheibe aus frühen pupal Stadien, gefolgt von der Dissektion der Antennen ab Mitte pupal Stadien und Erwachsene Alter. Wir zeigen auch Methoden wo Vorbereitungen können Molekulare Techniken, wie die RNA-Extraktion für qRT-PCR, RNAseq oder Immunhistochemie eingesetzt werden. Diese Methoden können auch auf andere Drosophila -Arten angewendet werden, nachdem artspezifische pupal Entwicklungszeiten bestimmt sind und jeweiligen Etappen sind für entsprechende Aging berechnet.

Introduction

Das olfaktorische System der Drosophila ist verbreitetes System in Entwicklungsneurobiologie, Systeme Neurowissenschaften sowie Neurophysiologie Verhalten Studien und Verhaltensstörungen Evolution^{1,2,3, 4}. Drosophila olfaktorische Gewebe beherbergen die olfaktorischen Rezeptor Neuronen (ORNs), die flüchtigen chemischen Signale neben Hydro und Thermo-sensorischen Neuronen^1,5,6zu erkennen. Das übergeordnete Ziel dieser Handschrift s....

Protocol

Das folgende Protokoll steht im Einklang mit der Ethikrichtlinien von der Duke University Research Ethikkommission.

(1) Gewebe Vorbereitung und Entwicklungsstörungen Inszenierung von Drosophila Melanogaster Puppe

1. Zunächst ermitteln Sie, wie viele fliegen die Dissektion erforderlich ist. Für RT-PCR und RNAseq sammeln Sie 100-200 riechzentrum Scheiben und Antennen von Einzelpersonen, die auf prepupal, 8 h APF, 40 h APF, und Erwachsenen Phasen notwendig sind. Immunohistochemistry sind 10 bis 20 einzelnen zu sezieren.
2. Reinigen Sie alle Materialien, einschließlich Dissektion Pads und Zangen, mit Tüchern mit 70 % EtOH....

Results

Die sezierte entwickelnde olfaktorische Gewebe kann für die RNA-Extraktion, gefolgt von RT-PCR verwendet werden, um die Genexpression zu beurteilen oder kann durch Immunohistochemistry Protokolle zu bestimmen, die Muster des Ausdrucks und der subzellulären Lokalisierung der Gene eingenommen werden Interesse. In diesem Abschnitt präsentieren wir Ihnen repräsentative Ergebnisse aus beiden Protokoll. Abbildung 1 ist der Vertreter quantitative RT-PCR die Transkri.......

Discussion

Dieses Protokoll ist eine nützliche Ressource für Labs interessiert bei der Identifizierung der genetischen und transkriptionelle Programme bei der Entwicklung von Drosophila olfaktorische Gewebe sowie eine vergleichende Analyse dieser Programme in Drosophila Spezies. Es ist besonders nützlich, wenn Systemebene transcriptional Profile aus verschiedenen Entwicklungsstadien als Grundierung für zukünftige Studien erforderlich sind. Das hier beschriebene Protokoll veranschaulicht zu inszenieren und zu isoli.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Gibco	70011-044	Verdünnung auf 1X in RNasefreiem Wasser
CO2 tank	Air Gas	CD R200
Zwei scharfe Pinzetten (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Trizol	Invitrogen	15596-026	RNA-Isolationslösungen
Präpariermikroskop
Kleiner Eimer mit Eis
P20 und P200 Mikropipetten und Spitzen
1,7 mL Microfuge-Röhrchen			Nukleasefrei kaufen, um beste Ergebnisse zu erzielen
0,2 mL PCR-Röhrchen
Paraformaldehyd Pulver	Polysciences	380
10% Triton X-100	Teknova	T1105	Verdünnen auf 0,2 % v/v in 1X PBS
2" Petrischalen
55 mm Filterpapier	Whatman	1001-055	Wasser befeuchten und in eine Petrischale legen, um die Puppen feucht zu halten
25 C Inkubator
deionisiertes H2O			Kaufen Sie nukleasefrei oder behandeln Sie es mit DEPC
Sylgard 184 Silikonelastomer Kit	Dow Corning		zur Herstellung von Sezierpads aus Terizaki-Plattenabdeckungen.
MicroWell Mini Trays mit Deckel	Nunc	438733	Deckel können zur Herstellung von Silikon-Dissektionskissen verwendet werden
Kaninchen-Anti-GFP-Antikörper	MBL internationaler Korporon	PM005	Primärantikörper
Maus Anti-RAT CD2	AbD seroTec	MCA154RHDL	Primärantikörper
ADL195 (Anti-Lamin, Maus)	Entwicklung untersucht Hydom-Ban	ADL195-s	Primärantikörper
Alexa Fluor® 488 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)	invitrogen	A11008	Sekundärantikörper
Cy3-Ziege Anti-Maus-IgG	Jackson ImmunoResearch	115-166-003	Sekundärer Antikörper
Triton X-100, Detergens in Proteinqualität, 10%ige Lösung, sterilgefiltertes	CALBIOCHEM-648463-Reinigungsmittel
Laborrotator	Thermowissenschaftlicher		Rotator
Nukleasefreies Wasser	Growcells.com	NUPW-0125	Wasser
Leichte Gewebewischer	VWR	82003-822	Zum Reinigen von Dissektionszubehör
Superscript II	Invitrogen	18064014	Reverse Transkriptase
QIAshredder (50)	RNA-Extraktion	QIAGEN	79654
Oligo(dT)12-18 Primer	RT	life technologies
18418012 RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)	RNA-Extraktion	QIAGEN	74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)	qPCR	Roche	04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER	qPCR	Roche	06402712001
LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96	qPCR	Roche	04729692001
NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix	qPCR	NEB	M0541S