Split-grün fluoreszierendes Protein System Effektoren geliefert von Bakterien während der Infektion zu visualisieren

Summary

Fluoreszierende Protein-basierte Ansätze, Effektoren abgesondert von Bakterien in Wirtszellen zu überwachen sind anspruchsvoll. Dies ist aufgrund der Inkompatibilität zwischen fluoreszierende Proteine und die Typ-III-Sekretion-System. Hier wird eine optimierte Split Superfolder GLP-System zur Visualisierung von Effektoren abgesondert von Bakterien in die Wirtszelle Pflanze verwendet.

Abstract

Bakterien, eines der wichtigsten Erreger von verschiedenen Pflanzenkrankheiten, absondern, eine Reihe von Effektor-Proteine in die Wirtszelle Pflanze, die Pflanze Immunsystem zu untergraben. Während der Infektion werden zytoplasmatischen Effektoren Host Zytosol über einen Typ III-Sekretion System (T3SS) geliefert. Nach der Anlieferung in die Pflanzenzelle zielt auf die Effector(s) der spezifischen Kompartiments um Zelle Hostprozesse für Überleben und Replikation des Erregers zu modulieren. Zwar gab es einige der Forschung auf die subzelluläre Lokalisation der Effektor-Proteine in den Wirtszellen, ihre Funktion in der Pathogenität zu verstehen, durch die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen, Untersuchung der Dynamik von Effektoren direkt aus Bakterien injiziert ist aufgrund der Inkompatibilität zwischen der T3SS und fluoreszierende Proteine eine Herausforderung gewesen.

Hier beschreiben wir unsere jüngsten Methode eines optimierten Split Superfolder grün fluoreszierendes Protein Systems (SfGFP^OPT), die Lokalisierung von Effektoren geliefert über die bakterielle T3SS in der Wirtszelle zu visualisieren. Die sfGFP11 (11^th β-Aktionsbereich des SfGFP)-tagged Effektor abgesondert durch die T3SS kann mit einem bestimmten Organell, die gezielte sfGFP1-10^OPT (1-10^th β-Aktionsbereich des SfGFP) führenden zur Fluoreszenzemission am Standort montiert werden. Dieses Protokoll enthält eine Prozedur zum rekonstituierten SfGFP Fluoreszenzsignal mit einem Effektor-Protein von Pseudomonas Syringae in einem bestimmten Organell in Arabidopsis und Nicotiana Benthamiana Pflanzen zu visualisieren.

Introduction

Pflanzen sind festsitzende Organismen, die zahlreiche eindringende Krankheitserreger wie Bakterien, Pilze, Viren, Insekten und Nematoden während ihres gesamten Lebenszyklus zu begegnen. Unter den phytopathogene Gramnegative bakterielle Krankheitserreger wie Pseudomonas spp. und Ralstonia spp., infizieren ihre Wirtspflanzen durch Eingabe durch Wunden oder natürliche Öffnungen, z. B. die Spaltöffnungen und Hydathode¹. Um erfolgreich Wirtspflanzen besiedeln, haben bakterielle Krankheitserreger entwickelt, um eine Vielzahl von Virulenz Faktoren²entwickeln. Wenn Bakterien eine Wirtspflanze eindringen, sie in....

Protocol

Hinweis: Alle Schritte sind bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.

1. Vorbereitung von pflanzlichen Stoffen (4 Wochen)

1. Vorbereitung auf die N. Benthamiana Pflanzen
   1. 2 säen von N. Benthamiana auf der Bodenoberfläche von jedem Pot, das Fach mit einer Plastikhaube abdecken und lassen Samen zum Keimen in einem 25 ° C, 60 % Luftfeuchtigkeit Wachstum Kammer mit einem 16/8-h hell/dunkel Photoperiode Zyklus.
   2. Nach zwei Wochen herausgreifen und verwerfen die kleinste Sämling in jeden Topf und weiterhin wachsen Pflanzen unter den gleichen Bedingungen wie für die Keimung im Schritt ....

Results

Die β-Fass-Struktur der GFP besteht aus elf β-Stränge und kann in zwei Fragmente, die 1-10^th Strand (GFP1-10^OPT) und die 11^th (GFP11) Strand unterteilt werden. Obwohl weder selbst fluoreszierende zwei Fragmente, kann selbst-zusammengebauten SfGFP die Fluoreszenz ausstrahlen, wenn die beiden Fragmente in der Nähe (Abbildung 1A) vorhanden sind. In diesem System, sfGFP1-10^OPT- Arabidopsis oder N. Benthamia.......

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll dient zur Überwachung der genauen Lokalisierung der Effektor-Proteine der Wirtszelle Pflanze bei Infektion durch die bakterielle T3SS injiziert. Zuvor, Split-GFP-System diente als ein Werkzeug zur Untersuchung der subzellulären Lokalisierung von Säugetieren Proteine^23,36, Salmonellen T3E Lokalisierung und Agrobacterium VirE2 Lieferung durch das T4SS in der Pflanzenzellen³⁷. Um dieses System.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arabidopsis transgene Linien			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Raum-zeitliche Überwachung von Pseudomonas syringae-Effektoren durch Typ-III-Sekretion unter Verwendung von gespaltenen fluoreszierenden Proteinfragmenten. Pflanzenzelle. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	ABRC	CS69831
NU-sfGFP1-10	ABRC	CS69832
PT-sfGFP1-10	ABRC	CS69833
MT-sfGFP1-10	ABRC	CS69834
PX-sfGFP1-10	ABRC	CS69835
ER-sfGFP1-10	ABRC	CS69836
GO-sfGFP1-10	ABRC	CS69837
PM-sfGFP1-10	ABRC	CS69838
Organellen-targeted sfGFP1-10OPT Plasmid			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Raum-zeitliche Überwachung von Pseudomonas syringae-Effektoren durch Typ-III-Sekretion unter Verwendung von gespaltenen fluoreszierenden Proteinfragmenten. Pflanzenzelle. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	Addgen	97387
NU-sfGFP1-10	Addgen	97388
PT-sfGFP1-10	Addgen	97389
MT-sfGFP1-10	Addgen	97390
PX-sfGFP1-10	Addgen	97391
ER-sfGFP1-10	Addgen	97392
GO-sfGFP1-10	Addgene	97393
PM-sfGFP1-10	Addgene	97394
ER-sfCherry1-10	Addgene	97403
ER-sfYFP1-10	Addgene	97404
CYTO-sfCFP1-10	Addgene	97405
sfGFP11-tagged Gateway-kompatibler Vektor für T3SS-basiertes Effektor-Verabreichungssystem	Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Raum-zeitliche Überwachung von Pseudomonas syringae-Effektoren durch Typ-III-Sekretion unter Verwendung von gespaltenen fluoreszierenden Proteinfragmenten. Pflanzenzelle. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2	Addgene	98250	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Beständig gegen Kanamycin (25 μg/ml)
pBK-GW-1-4	Addgene	98251	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Beständig gegen Kanamycin (25 μg/ml)
pBK-GW-2-2	Addgene	98252	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistent gegen Kanamycin (25 μg/ml)
pBK-GW-2-4	Addgene	98253	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistent gegen Kanamycin (25 μg/ml)
pBG-GW-1-2	Addgene	98254	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Beständig gegen Gentamycin (25 μg/ml)
pBG-GW-1-4	Addgene	98255	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Beständig gegen Gentamycin (25 μg/ml)
pBG-GW-2-2	Addgene	98256	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Beständig gegen Gentamycin (25 μg/ml)
pBG-GW-2-4	Addgene	98257	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistent gegen Gentamycin (25 μg/ml)
Bakterienstämme
Agrobacterium tumefaciens GV3101			Csaba Koncz und Jeff Schell, Der Promotor des TL-DNA-Gens 5 steuert die gewebespezifische Expression von chimären Genen, die von einem neuartigen binären Agrobacterium-Vektor getragen werden. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistent gegen Gentamycin (50 μg/ml) und Rifampicin (50 μg/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomate CUCPB5500			Kvitko, B. H. et al. Deletionen im Repertoire von Pseudomonas syringae pv. Tomato DC3000 Typ III Sekretionseffektor-Genen zeigen funktionelle Überlappungen zwischen den Effektoren. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Beständig gegen Rifampicin (100 μg/ml)
Medienkomponenten
Keimmedium für Pflanzen			Add 2.165g/L Murashige & Skoog Pulver, 10 g/L Saccharose in Wasser. Auf pH 5,8 einstellen und 2,2 g/L Phytagel hinzufügen. Automatisch kalben.
Murashige & Skoog Medium einschließlich Vitamine	Duchefa Biochemie	M0222	Bei 4 & Grad C lagern.
Saccharose	Duchefa Biochemie	S0809
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169<
strong>LB media			10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 10 g/L NaCl in Wasser geben. Für feste Medien 15 g/L Mikro-Agar hinzufügen. Autoklav.  Lassen Sie die Lösung auf 55 Grad abkühlen; C und fügen Sie bei Bedarf ein Antibiotikum hinzu.
Trypton	BD Bioscience	211705
Hefeextrakt	BD Bioscience	212750
NaCl	Duchefa Biochemie	S0520
Mikro-Agar	Duchefa Biochemie	M1002
King's B media			10 g/l Protease Pepton #2, 1,5 g/l wasserfreies K2HPO4, 15 g/l Agar in Wasser. Autoklav. Abkühlen auf 55 Grad; C und geben Sie sterile 15 ml/L Glycerin, 5 ml/L MgSO4 in das Medium. Füge bei Bedarf Antibiotika hinzu.
Proteose Pepton	BD Bioscience	212120
Wasserfreies K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128 USP
Glycerin	Duchefa Biochemie	G1345
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Bacto Agar	BD Bioscience	214010
Mannitol-Glutamat (MG) flüssige Medien			Sie 10 g/l Mannitol, 2 g/l L-Glutaminsäure, 0,5 g/l KH2PO4, 0,2 g/l NaCl und 0,2 g/l MgSO4 dem Wasser. Anpassen an pH 7
Mannitol	Duchefa Biochemie	M0803
L-Glutaminsäure	Duchefa Biochemie	G0707
KH2PO4	Sigma-Aldrich	NIST200B
Infiltrationspuffer			10 mM MES (2-(N-Morpholin)-Ethansulfonsäure), 10 mM MgCl2, 150 µ M Acetosyringon. pH-Wert 5,6; Bereiten Sie vor Gebrauch einen frischen Puffer vor.
MES	Duchefa Biochemie	M1503	Bereiten Sie 100 mM (pH 5,6) Brühe in Wasser auf. Filter sterilisieren.
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	100 mM Brühe in Wasser vorbereiten. Autoklav.
Acetosyringon	Sigma-Aldrich	D134406	Bereiten Sie 150 mM Vorrat in DMSO vor.
Konfokalmikroskop Ausrüstung/Materialien
710 konfokales Laserscanning-System	Carl Zeiss
Axio Observer Z1 inverses Mikroskop	Carl Zeiss
Propidiumiodid	ThermoFisher	P1304MP