Homochronic Transplantation von Interneuron Vorstufen in frühen postnatalen Mäusegehirnen

Kortikale Funktion erfordert ein Gleichgewicht zwischen erregenden Projektion Neuronen und inhibitorischen Gabaergen Interneuronen, einer extrem heterogenen Bevölkerung mit verschiedenen Morphologien, elektrophysiologischen Eigenschaften, Konnektivität und neurochemischen Marker. Abnorme Entwicklung und Funktion von Interneuronen (und spezifische Interneuron Untergruppen) hat in Verbindung gebracht worden, der Pathobiologie der psychiatrischen Erkrankungen wie Schizophrenie, Autismus und Epilepsie^1,2,3. Darüber hinaus sind viele Gene, die an diesen Erkrankungen des Gehirns beteiligt in jungen Interneurone⁴stark angereichert. Daher ist ein größeres Verständnis für die Mechanismen, die Interneuron Schicksal Entschlossenheit und Reifung regulieren erforderlich, um die normale Entwicklung und mögliche Ursachen von zahlreichen Erkrankungen des Gehirns zu verstehen.

Vorderhirn Interneuronen entstehen in erster Linie aus zwei transient embryonale Strukturen, die medialen und kaudalen ganglionic Eminenzen (MGE und CGE, beziehungsweise). Diese postmitotischen Zellen (Interneuron Vorstufen) dann durchlaufen einen langwierigen tangential Migrationsphase während das Telencephalon zu zerstreuen, wo sie in einer Vielzahl von Schaltungen zu integrieren. MGE-abgeleitete Interneuronen bestehen aus drei weitgehend nicht überlappende, neurochemisch definierten Untergruppen: schnell Spick Parvalbumin (PV⁺) Interneurone, Spick Somatostatin (SST⁺) Interneurone, schnelle und spät Spick neuronale Stickstoffmonoxid Stickoxid-Synthase (Nngoo⁺) Interneuronen, die hippocampale Neurogliaform und Efeu Zellen darstellen. Zahlreiche Labors haben mehrere Mechanismen innerhalb der MGE identifiziert, die erste Schicksal Entscheidungen in PV⁺ oder SST + Interneuronen, einschließlich räumlichen Gradienten Morphogens, Geburtsdatum Interneuron Grundstoffe und den Modus der neurogenen Division zu regulieren ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10}. es wurde vorgeschlagen, dass Interneuronen zunächst in "Kardinal Klassen" zu unterscheiden und dann schrittweise in "endgültigen Klassen", Reifen wie sie mit ihrer Umwelt^{11 interagieren}. Den letzten deutet darauf hin, dass einige Reife Interneuron Subtypen genetisch veranlagt sein können, wie diese Zellen werden in die ganglionic Eminenzen postmitotischen darauf hinweist, dass frühe definierten intrinsischen genetische Programme eine größere Rolle als bisher spielen kann Geschätzte^12,13. Die entscheidende Frage der Interaktion der intrinsischen genetische Programme mit Umwelt-Signale zu Laufwerk Differenzierung in unterschiedliche Interneuron Subtypen bleibt jedoch weitgehend unerforscht.

Zahlreiche Studien haben MGE Embryonalzellen direkt in eine Vielzahl von Hirnregionen, mit den Ergebnissen der Konsens verpflanzt, die verpflanzten Zellen Reifen und GABA um in der Regel die lokale endogene Schaltung^{14,15hemmen, 16,17,18,19}. Diese vielversprechenden Beobachtungen haben großes Interesse im Umgang mit menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hIPSC) erzeugt-Interneurone zur Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen des Gehirns abgeleitet. Hält jedoch sehr wenige von diesen Studien beurteilen, ob diese transplantierten Zellen zu der erwarteten Typen von Reifen Interneuronen heranreifen, eine kritische Komponente, wenn man über translationale Ansätze.

Um zu beheben wie Umwelt Interneuron Differenzierung und Reifung beeinflusst, wurde eine Strategie entwickelt, um verpflanzen Interneuron unreife Vorstufen in neue Gehirn Umgebungen um zu prüfen, ob veredelte Interneuronen Funktionen des Hosts übernehmen Umwelt oder Funktionen aus dem Spender Umwelt²⁰zu behalten. MGE-Transplantationen sind nicht geeignet, diese Frage ansprechen, denn die MGE enthält eine Mischpopulation Interneuron und Gabaergen Projektion Zellen, die in zahlreichen Gehirn Regionen²¹zu zerstreuen. Ohne zu wissen, wo diese Zellen MGE migriert haben würde, kann man nicht umfassend beurteilen, wie diese Transplantationen von Gehirn Umwelt betroffen sind. Durch das Ernten von Interneuron Vorläufer an frühen postnatalen Zeitpunkten, wird dieses Problem umgangen, indem unreifen Zellen, die ihre Migration abgeschlossen und ihr Ziel erreicht haben erhalten Region des Gehirns, sondern haben nur minimale Interaktion mit der Umwelt. Durch die Fokussierung auf Besonderheiten der Interneurone, die zwischen den unterschiedlichen Gehirnregionen differentiell exprimiert werden, kann man dann feststellen, wie die Host-Umgebung Interneuron Eigenschaften ändert. Der allgemeine Ansatz in diesem Protokoll sollten auf jeder Ermittler anwendbar sein, dass will untersuchen, wie die jungen Neuronen wann Verhalten in einer neuen Umgebung in Frage gestellt.

Alle experimentelle Verfahren wurden im Einklang mit der Leitlinien des National Institutes of Health und wurden durch die NICHD Animal Care and Verwendung Ausschuss (ACUC) genehmigt. Die nachfolgend beschriebene Protokoll nutzt Nkx2.1-Cre^{C / +}; Ai9^{+ /} Welpen um MGE abgeleitet Interneuron Vorstufen zu ernten, sondern auf jede gewünschte fluoreszierende Reporter mauslinie durchgeführt werden kann. Sowohl weibliche als auch männliche frühen postnatalen Mäuse (P0-P2) wurden wahllos für Spender und Host Gewebe verwendet.

1. Vorbereitung der Lösung

1. Vorbereiten von Saccharose künstliche Liquor cerebrospinalis (sACSF) nach dem folgenden Rezept (Einheit in mM): 87 NaCl, 26 Nahco3₃, 2.5 KCl, 1,25 NaH₂PO₄, 0,5 CaCl₂, 7 MgCl₂, 10 Glukose, 75 Saccharose gesättigt mit 95 % O ₂, 5 % CO₂ bei pH = 7.4.
2. Füllen Sie ein Becher mit 350 mL reines DdH₂O auf der gewünschten Endvolumen basierend (500 mL sACSF sollte ausreichen für 1-2 Würfe), fügen Sie eine magnetische Stir Bar und stellen Sie den Becher auf dem Teller rühren.
3. Gewicht alle Salze (NaCl, Nahco3₃, KCl, NaH₂PO₄, Glucose, Saccharose), ein zu der Zeit und das Wasser entsprechend der folgenden Tabelle hinzufügen. Beträge können je nach der gewünschten Endvolumen eingestellt werden.

   Reagenz	Molekulargewicht	Konzentration (mM)	Gramm/500 mL
   Natrium-Chlorid	58.44	87	2,54
   Natriumbicarbonat	84.01	26	1.09
   Kaliumchlorid	74.55	2.5	0,09
   Natriumphosphat monobasic	119,98	1.25	0,08
   Glukose	180.16	10	0,9
   Saccharose	342.3	75	12.84

4. Bubble-die Lösung mit 95 % O₂, 5 % CO₂ (Carboxygen) für mindestens 20-30 Minuten bevor Sie die entsprechende Menge an CaCl₂ (0,25 mL von einer 1 M Lösung für 500 mL sACSF) hinzufügen und MgCl₂ (3,5 mL von einer 1 M Lösung für 500 mL-sACSF) .
5. Überprüfen Sie den pH-Wert mit einem standard-pH-Meter. Wenn richtig vorbereitet, muss die Lösung pH = 7.4.
6. Bringen Sie die Lösung zu Endvolumen von 500 mL mit reinen DdH₂O in einem Messzylinder.
7. sACSF kann bis zu 1-2 Tage im Voraus vorbereitet. Vor Gebrauch auf Eis legen und Blase mit Carboxygen für mindestens 15 Minuten vor Beginn der Dissektion, und halten Sie die Flasche des sACSF sprudelt während der Präparation.

2. Präparation Vorbereitung

1. Die folgenden Tools sollten sterilisiert/autoklaviert werden: mindestens eine kleine feine scharfe Schere, 2 feine Pinzette (Style #5), gebogene feine Pinzette, Gehirn Matrice Schimmel und mehrere Rasierklingen-Schnitt. Einem kleinen Spatel, das Gehirn aus dem Schädel zu entfernen ist optional.
2. Richten Sie den Arbeitsplatz in der Nähe von Dissektion Mikroskope mit Petrischalen (9 cm und 4 cm Durchmesser), 50 mL konische Kunststoffrohre, die isolierte Hirnregionen zu sammeln und große Bohrung Kunststoff Transfer Pipetten, alles auf Eis gehalten. Bereiten Sie mehrere 50 mL Röhrchen voll von Carboxygenated sACSF auf Eis. Wenn mehr als eine Region des Gehirns zu sezieren, stellen Sie sicher, korrekt und eindeutig zu kennzeichnen Sie, die Röhrchen und der Transfer Pipetten zur Vermeidung von Kontaminationen.
3. Haben Sie eine zusätzliche Eiskübel für Eis Anästhesie des Welpen durch Unterkühlung und eine ordnungsgemäße Sondermüll-Tasche, Kadaver zu entsorgen.
4. Gewebe-Verreibung feuerpolierte Glas Pasteur Pipetten vorbereiten. Verwenden Sie einen Bunsenbrenner zu sterilisieren und die Spitze der Pipette zu gestalten. Bereiten Sie mehrere Pipetten mit unterschiedlichen Bohrung Öffnungen: groß (~ 600 µm), mittlere (~ 300 µm) und kleine (~ 100 µm). Testen Sie durch Tipps mit Wasser, um verschiedene Verreibung Geschwindigkeiten sorgen fließen. Mindestens eine Pipette jeder Art für jedes einzelne Hirnregion benötigt wird, aber mit einigen extra für jede Größe wird empfohlen, im Falle einer Verstopfung oder Tipps zu brechen.

(3) Transplantation Vorbereitung

1. Verwenden Sie eine Elektrode Puller, um feine Spitze Glas Mikropipetten vorzubereiten. Brechen oder Abschrägung die Spitze zu einer scharfen abgewinkelte Spitze, mit der Spitze mit einem Durchmesser von ~ 20-40 µm. Überprüfen Sie die Spitzen mit einem Mikroskop um sicherzustellen, dass kein Staub oder passives Glaspartikel behindern die Blende.
2. Mit einer feinen Nadel Spritze, komplett Glas Mikropipette Mineral Öl einfüllen. Legen Sie die Mikropipette in den Nanoject-Apparat (oder ein anderes Gerät Mikroinjektion). Für die Nanoject III, richten Sie das folgende Programm: Volumen = 60 nL, Rate = 30 Zyklen = 25, Delay = 1 s.
3. Sichern Sie die Nanoject für den Manipulator, der einen Magnetfuß zugeordnet ist, und den Manipulator so einstellen, dass die Nanoject gerade nach unten gerichtet ist nicht gekippt werden, entlang der x- oder y Achse.
4. Fügen Sie einige selbstklebende Kitt (~ 1-2 cm für P0-P2 Welpen) auf der Oberseite des Deckels einer Petrischale Erstellen einer erhöhten Fläche um die Pup Kopfstütze auf.
5. Schnitt ca. 6-8 cm lange Streifen von Lab kleben und machen eine rautenförmige Loch in der Mitte. Das Band wird um den Kopf des Welpen während des Verfahrens zu stabilisieren, aber auch die Dehnung der Haut und ermöglicht einfache Visualisierung der Sehenswürdigkeiten und der gezielten Region verwendet werden.
6. Bereiten Sie ein Heizkissen neben der Injektion-Station, und schalten Sie auf "Low" Einstellung vor Beginn der Injektionen. Decken Sie das Pad mit einige Papiertücher oder eine Windel-Pad.
7. Wenn mehrere Transplantation Bedingungen durchführen einer kleinen Schere einsatzbereit haben Welpen Zehe/Tail Clipping-Tag erhaltende verschiedene Injektionen.

4. Entfernung von P0-P2 Mäusegehirn

1. Direkt vor Beginn des Verfahrens, füllen Sie mehrere Petrischalen mit gekühltem, Carboxygenated sACSF. Auch füllen Sie die Sammlung Tube(n) mit ~ 25 mL sACSF.
2. Wickeln Sie P0-P2 Pup in einigen Parafilm oder einem Handschuh und Ort, wo es gut abgedeckt unter dem Eis. Stellen Sie einen Timer auf 5 Minuten und starten Sie ihn. Nach dieser Zeit Entfernen der Pup und überprüfen Sie, ob es nicht Einklemmen der der Hindpaw reagiert.
3. Der Welpe zu enthaupten und den Kopf in eine Petrischale gefüllt mit sACSF zu sammeln. Schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie des Schädels aussetzen.
4. Suchen Sie die Öffnung im Schädel an das Hinterhirn/Rückenmark und stecken Sie ein Ende der Zange entlang der dorsalen Teil des Schädels. Vorsichtig erfassen Sie den Schädel an der Mittellinie zu und "schälen Sie" entfernt Teile seitlich, um das Gehirn, das Gehirn beschädigen Sie nicht aussetzen.
5. Verwenden Sie nach dem Entfernen der dorsalen und lateralen Teile des Schädels der Zange oder dem Spatel, um das Gehirn aus dem Schädel entfernen Sie vorsichtig durch Aushöhlungen unter der ventralen Oberfläche des Gehirns, versuchen, nicht zu irgendeinem Bereich beschädigen. Legen Sie das Gehirn in einen anderen Petrischale gefüllt mit Carboxygenated sACSF.
    
   Hinweis: Wir stellen Ihnen zwei unterschiedliche Strategien für Sezieren, Hippocampus, Striatum und Kortex. Die erste Strategie (Schritte 5.1-5.10) eignet sich für jede mauslinie, während die zweite Strategie (Schritte 6.1-6.7) eine fluoreszierende Reporter Maus müsste, Striatum von Globus Pallidus und andere Hirnstrukturen sauber zu trennen. Wenn Striatum nicht gewünscht ist, dann ignorieren Sie das Striatum-spezifische Teile der beiden Techniken

Abbildung 1 : Schaltplan und Bilder für Gehirn Dissektion, Technik #1
Dissektion Technik in Schritten 5.1-5.10 beschrieben. Nach Wunsch striatalen Gewebe legen Sie P1 Gehirn im Gehirn Matrizen Bauchseite nach oben. Platzieren Sie Rasierklingen in Matrice Schlitze durch vorderen Gehirn koronalen Abschnitte durch Striatum zu erhalten. Entfernen Sie striatalen Stücke aus beiden Hemisphären, wiederholen Sie für alle Abschnitte mit Striatum anterior Hippocampus. Wenn striatalen Gewebe nicht gewünscht ist, einfach das Gehirn Hemisect stellen die Hemisphären mediale Seite nach oben in die Schüssel und Entfernen der Ventral-Medial Hirnstrukturen (Thalamus, Basalganglien, etc.) um den Hippocampus verfügbar zu machen. Benutzen Sie eine Pinzette zu kneifen des Hippocampus, dann Hemisphäre umzudrehen und benutzen Sie eine Pinzette, um ein Stück der kortikalen Gewebe zu zergliedern. Die vertikale schwarzen Linien durch die schematische Hemisphären, wo die Kürzungen sein würde, um die striatalen Abschnitte zu entfernen. Maßstabsleiste = 500μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

5. Ernte Striatum, Hippocampus und Cortex, Technik #1

1. Legen Sie ganzes Gehirn auf Matrice Schimmel, Bauchseite oben schneiden. Platz 1 Rasierklinge durch die am vorderen Teil des Gehirns (durch vorderen Riechbahn).
2. Einsetzen Sie einer anderen Rasierklinge einfach posterior zum ersten um eine 0,5 mm Scheibe zu generieren, und eine zusätzliche Rasierklinge posterior zu diesein.
3. Diese Scheiben auf einer Petrischale mit Carboxygenated sACSF und den Rest des Gehirns auf einen separaten Teller mit sACSF. Übertragen der striatalen Scheiben auf einen sezierenden Bereich Striatum zu visualisieren. Diese Scheiben sollten enthalten große Teile der vorderen Striatum und Hippocampus fehlt. Verwenden Sie eine fluoreszierende sezieren Rahmen mit Nkx2.1-Cre^{+ /}; Ai9^{+ /-} Scheiben, die schwachen striatalen TdTomato unterscheiden signal aus dem starken TdTomato Signal des Globus Pallidus.
4. Ziehen Sie mit oder ohne Fluoreszenz das Striatum von beiden Hemisphären auf allen Abschnitten und Transfer striatalen Brocken, ordnungsgemäß beschrifteten 50 mL-Tube mit sACSF, speichern auf Eis.
5. Hemisect das Gehirn entlang der Mittellinie mit Zange oder einer Rasierklinge und die Hemisphäre zu legen, so dass die mediale Fläche nach oben zeigt.
6. Entfernen Sie die ventralen Hirngewebe (Thalamus, Basalganglien, etc.) durch Kneifen aus diesem Gewebe mit einer Pinzette. Wenn abgeschlossen, des Hippocampus (eine Wurst geformt Struktur überspannt die Anteroposterior Achse entlang der dorsalen Cortex) und ventrikulären Seite des Kortex sollte deutlich sichtbar sein.
7. Um den Hippocampus zu entfernen, legen Sie die Spitzen der Zange vor der anterioren Hippocampus und trennen Sie sanft Hippocampus von Kortex durch die Zange nach hinten verschieben und Kneifen entlang der hippocampalen kortikalen Grenze. Isolierte Hippocampus auf ordnungsgemäß beschrifteten 50 mL-Tube mit sACSF übertragen, speichern auf Eis.
8. Um die Rinde zu sezieren, legen Sie die Hemisected Kortex medialen Seite nach unten. Dann die Zange verwenden, um die meisten dorsale kneifen, ventralen, vorderen und hinteren Teile des Cortex lassen Sie einen quadratischen Teil der medialen somatosensorischen Kortex, ~ 2 mm x 2 mm. Flip der Hirnrinde, also medialen Seite oben und frei von jeder überschüssige nicht kortikalen Gewebe (thalamus Basalganglien, etc..) auf der medialen Fläche bei Bedarf. Kortex Chunk auf ordnungsgemäß beschrifteten 50 mL-Tube mit sACSF übertragen, speichern auf Eis.
9. Wiederholen Sie den Vorgang mit der anderen Hemisphäre hippokampi und Kortex sammeln Regionen.
10. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Welpen, und achten Sie auf ersetzen die sACSF in den Petrischalen zwischen den Welpen, damit die sACSF kalt und frisch bleibt.

Abbildung 2 : Schaltplan und Bilder für Gehirn Dissektion, Technik #2
Dissektion Technik in Schritten 6.1-6.7 beschrieben. Pin-up Gehirn auf einen sezierenden Gericht Rückenseite. Nach dem Schälen der Rinde nach vorne, dem Hippocampus und dem Striatum sind sichtbar und können entfernt werden, dann ein Teil der Rinde entfernt werden kann, wie im vorherigen Technik beschrieben. Je nach transgene mauslinie kann Striatum bereinigt, um Globus Pallidus und andere Gewebe zu entfernen. In Nkx2.1Cre; Ai9 mauslinie, Globus Pallidus hat eine deutlich höhere Dichte von Tomaten + Zellen im Vergleich zum Striatum. Maßstabsleiste = 500 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

6. Ernte Striatum, Hippocampus und Cortex, Technik #2

1. Legen Sie das Gehirn Bauchseite nach unten in einer Sylgard-beschichtete Petrischale mit sACSF und durch das Kleinhirn und anterioren Cortex oder olfaktorischen Birnen festzunageln.
2. Ausgehend von einer Hemisphäre, gebogenen Pinzette sanft die hinteren Kortex von zugrunde liegenden Hippocampus und andere Gewebe trennen verwenden. Legen Sie die geschälte Rinde vorsichtig flach auf Petrischale. Wiederholen Sie für andere Hemisphäre. Hippokampi und Striatum sollten in exponierten Gehirn deutlich sichtbar sein.
3. Können Sie Zange kneifen ein Hippocampus an der Mittellinie und schälen Hippocampus seitlich zu entfernen. Im Sammelbehälter auf Eis legen und mit anderen Hippocampus wiederholen.
4. Kratzen Sie für Striatum vorsichtig an den Rändern des striatums um ihn aus dem umgebenden Gewebe zu lösen. Dann entfernen Sie das Striatum durch Kneifen es weg von unter und sammelröhrchen auf Eis hinzufügen. Wiederholen Sie für andere Striatum.
5. Kortikale Abschnitte können geerntet werden, wie in Schritt 5.8 beschrieben.
6. Wenn ein Reporter transgene mauslinie verwenden (z. B. Nkx2.1-Cre; Ai9, Lhx6-GFP, etc.), Striatum an einer Petrischale mit sACSF übertragen und anzeigen unter Leuchtstofflampenlicht sezieren Umfang. Verwenden Sie Pinzette, um jedem nicht-striatalen Gewebe von Striatum (in Nkx2.1-Cre; entfernen Ai9 Mäuse, entfernen Sie alle "helles" Gewebe, wie Globus Pallidus hat viel höheren MGE abgeleitet, TdTomato + Zelle Dichte im Vergleich zum Striatum). Wiederholen Sie für alle Striatum.
7. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Welpen, und achten Sie auf ersetzen die sACSF in den Petrischalen zwischen den Welpen, damit die sACSF kalt und frisch bleibt.

7. Erzeugung von einzelligen Dissoziationen

1. Nach Abschluss der Dissektion, bereiten Sie eine 1 mg/mL Pronase Lösung durch wiegen 10 mg Pronase und Auflösen in 10 mL Carboxygenated sACSF.
2. Übertragung des Gewebes aus der Sammlung Fläschchen 50 mL bis 5 mL Runde Unterseite Röhrchen mit 2 mL der Lösung Pronase-sACSF. Inkubieren Sie das Gewebe für 20 min bei Raumtemperatur, schütteln/streichen das Rohr 3 - 4 mal mit dem Finger während der Inkubation, die Proben zu mischen.
3. Während diese Inkubation bereiten Rekonstitution Lösung: 1 % FBS (100 μl) + DNAse (1 μl von 1: 10.000 Lager DNAse) in 10 mL Carboxygenated sACSF.
4. Nach 20 min sorgfältig entfernen Sie die Pronase-Lösung, um das Gewebe an der Unterseite nicht zu stören, und ersetzen Sie es mit 1-2 mL der Rekonstitution Lösung (Gesamtvolumen richtet sich nach der Menge des Gewebes ab).
5. Mechanisch distanzieren Sie das Gewebe durch Verreiben des Gewebes mit der zuvor vorbereiteten feuerpolierte Pasteur Pipetten. Beginnend mit der großen Bohrung (~ 600 µm) Pipette, abzusaugen und die Gewebe-Lösung mindestens zehn Mal um zu brechen, das Gewebe zu vertreiben. Stellen Sie Luftblasen in die Lösung. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die mittlere Pipette Bohrung und Kleinkaliber Pipette. Die Lösung sollte bedeckt sein und keine klare Stück des Gewebes in die Röhrchen sichtbar sein soll.
6. Pipettieren Klumpen die Zelle lysate Lösung durch einen 50 µm Filter in 5 mL konische Röhrchen, jede Zelle zu entfernen. Gehen Sie mit diesen Lösungen einzelne Zelle fließen Cytometry (oder möglicherweise direkt zu Zelle zählen, wenn keine Sortierung benötigt werden).

8. Vorbereitung FACS-gereinigte Zelle Lösungen für die Transplantation

1. Übertragen Sie nach Erhalt der Zelle Lösungen aus der Durchflusszytometer die Lösung auf eine (oder mehrere) 1,5 mL konische Rohre und drehen Sie die Zellen bei 500 g für 5 min bei 4^oC. Nach Zentrifugation, entfernen Sie Medien so, dass ~ 20-40 µL bleiben in der Tube. Rekonstruieren Sie Zellen in diesem verbleibenden Medien (und kombinieren Sie Lösung zu, wenn mehrere Röhren benötigt wurden).
2. Vermischen Sie auf einem kleinen Stück Parafilm 2 µL der Zelle Lösung + 8 µL sACSF + 10 µL Trypan blau Fleck. Pipettieren 10 µL in einem Hemocytometer mit Folie abdecken.
3. Die Anzahl der lebenden Zellen in jedem der 4 x 4 quadratischen Raster in den Ecken der Hemocytometer mit einem standardlabor Hand Stückzähler (abgestorbene Zellen werden von den Farbstoff blau), und diese 4 zählt im Durchschnitt. Multiplizieren Sie diese Zahl mit 100, um die Anzahl der Zellen pro Mikroliter bestimmen.
4. Bei Bedarf stellen Sie Lautstärke, so dass die Zellen in einer Konzentration von 10.000-30.000 Zellen/µL bei Rekonstitution Lösung sind. Endkonzentration ist abhängig vom Gesamtbetrag der Zellen und die gewünschte Anzahl von Transplantationen. Halten Sie Zellen auf dem Eis für die transplantation

9. die Transplantation in P0-2 WT Welpen

1. Wickeln Sie einen Welpen WT in einigen Parafilm oder einem Handschuh und Ort, wo es gut abgedeckt unter dem Eis. Stellen Sie einen Timer für 5 min und starten Sie ihn. Nach dieser Zeit Entfernen der Pup und überprüfen Sie, ob es nicht Einklemmen der der Hindpaw reagiert.
2. Während der Welpe auf dem Eis ist, mischen Sie die Zelle Lösung durch pipettieren sie mehrmals um sicherzustellen die Zellsuspension ist gut gemischt, vor der Verladung (mischen Sie die Zellen vor dem Laden der Mikropipette für jede Injektion). Dann entleeren Sie die Mikropipette des Mineralöls zu und füllen Sie es vollständig mit der Zellsuspension.
3. Legen Sie narkotisierten Hund auf der Petrischale mit seinem Kopf auf den Klebstoff Kitt liegen, so dass die Oberseite des Kopfes relativ flach ist. Legen Sie das Maßband mit dem Diamant-Loch über den Kopf des Welpen, ziehen es straff, damit die Haut gedehnt und der Kopf ist fest, aber, dass die Maus komfortabel und Atmung gut ist. Lambda sollte durch das Diamant-Loch sichtbar sein.

Abbildung 3 : Schaltplan und Bilder für die Transplantation
(A) Bilder von Injektion Setup. Beachten Sie, dass Lambda ist deutlich sichtbar durch die Pup Schädel und sollte für den Nullabgleich der Mikropipette verwendet werden. Maßstabsleiste = 1 Zoll. (B) schematische Darstellung der Injektionsverfahren Hippocampus ausrichten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

4. Bewegen Sie die gesicherte Pup unter der Nanoject und senken Sie der Mikropipette zu, so dass die Spitze der Mikropipette auf direkt über Lambda. Notieren Sie die X / y-Koordinaten auf dem Manipulator.
5. Stellen Sie die Manipulator-Regler um die Mikropipette in die gewünschten Koordinaten entlang der Mediolateral und der Anteroposterior Achse des Kopfes zu verschieben: S1 Cortex → anteriore 1,0 mm und 1,0 mm seitlich, Hippocampus → 0,75-1,0 mm anterior und 1,0-1,2 mm seitlich, Striatum → 2,0-2,2 mm vordere und seitliche 1,5 mm. Koordinaten können leicht kompensieren Alter des Welpen (z. B. P0 vs. P2) oder die Belastung von Mäusen (z. B. CD1 Mäuse größer sind und C57/B6 bei P2) angepasst werden.
6. Die Mikropipette zu senken, bis es eine kleine Konkavität auf der Haut bildet. Dann den Drehknopf z-Manipulator fest aber vorsichtig zu fahren die Mikropipette durch die Haut und Schädel, das Gehirn zu betreten. Wenn die Mikropipette ins Gehirn gelangt, der Druck auf den Schädel erscheint und die Konkavität verschwindet.
7. Zurückziehen Sie die Mikropipette leicht, bis die Spitze von einem Kegel von Haut umgeben ist, geformt wie ein Zelt. Lesen Sie die Koordinaten entlang der Z-Achse: Diese werden die z-Null-Punkt.
8. Die Mikropipette auf die gewünschte Tiefe zu senken: Cortex → 0,75-1,0 mm, Hippocampus → 1,2-1,5 mm, Striatum → 2,0-2,5 mm. Tiefe kann leicht angepasst werden, um Alter oder Belastung des Welpen zu kompensieren.
9. Die Zellsuspension mit dem oben beschriebenen Nanoject III-Programm zu injizieren. Nach der Injektion Programm abgeschlossen ist, 15-20 Sek. warten, bevor Sie langsam zurückziehen Mikropipette um Lösung Austritt aus der Injektionsstelle zu minimieren.
10. Wenn bilaterale Injektionen durchführen, Re-zero Mikropipette über Lambda und verschieben Sie an die richtigen Koordinaten in die andere Hemisphäre. Alternativ kann man zwei Injektionen in die Rinde von der gleichen Hemisphäre durch Verschieben der Mikropipette anterior der ersten Injektion 1 mm machen.
11. Sobald die Transplantation abgeschlossen ist, entfernen Sie das Klebeband und übertragen Sie der Welpe auf das Heizkissen zu. Falls erforderlich, tag der Welpe von Rute oder Zeh abschneiden. Sobald der Welpe eine rote Farbe zurückerworben hat und bewegt sich, legen Sie es zurück in den Käfig mit der Mutter.

Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie bestimmte Gehirnregionen aus frühen postnatalen Gehirn (Abbildung 1-2) zu ernten, sammeln Einzelzelle Dissoziationen Interneuron Grundstoffe und Transplantation dieser Zellen in verschiedenen Hirnregionen in naiven WT postnatale Welpen (Abbildung 3). Analysezwecken Posthoc geerntet wurden Gehirne, die Interneuron Vorläufer Transplantate erhalten zwischen P30-35 Zellmorphologie, neurochemische Marker und elektrophysiologischen Eigenschaften zu charakterisieren. Diese Arten von Tests sind oft zwischen P21-P30 bei normalen Mäusen durchgeführt, aber da die Reifung der transplantierten Zellen aufgrund der Dissektion/Dissoziation Verfahren geringfügig verzögern könnte, warten weitere 5-10 Tage empfiehlt sich, dies zu kompensieren verzögerten Reifung. Die Art der durchzuführenden Analyse bestimmen die richtige Strategie, um das Gehirn zu ernten. Vor allem, beobachteten wir bevorzugten Zelltod von spezifischen Interneuron Untergruppen, die für oder gegen bestimmte Subtypen20beeinflussen könnte.

Für immunhistochemische Analyse Mäuse waren mit 4 % Paraformaldehyd durchblutet und die Gehirne wurden entfernt. 50 μm Vibratome Scheiben wurden durch die gezielte Hirnregion vorbereitet und in Frostschutzmittel gespeichert und/oder verarbeitet für Immunostaining wie zuvor beschrieben20. GRIPS enthielt keine Tomate + Zellen, die durch unsachgemäße Ausrichtung (z. B. Injektion zu tief in die Herzkammer), Zellen verloren oder Apoptose unterziehen, während die Pfropfen Verfahren oder Ablehnung der transplantierten Zellen vom Host sein könnte. Basierend auf endgültige Zellzahlen, es wird geschätzt, dass nur 2-5 % der transplantierten Zellen überleben20, die im Einklang mit anderen Transplantation Verfahren22,23.

Es überrascht nicht, gab es erhebliche Variabilität in die Gesamtzahl der Tomate +-Zellen in der erfolgreichen Transplantationen von Dutzenden bis hin zu mehreren tausend Tomaten + Zellen (Abb. 4A). Transplantierten Zellen wurden lokalisiert, in die richtigen Regionen, mit vielen Anzeigen von Interneuron Morphologien und gut charakterisierten Interneuron neurochemische Marker (Abbildung 4 b). Ähnlichen Zellzahlen überleben und Reifung Profile wurden beobachtet, wenn Zellen in neue Umgebungen in heterotopic Transplantationen (Abbildung 4) veredelt wurden.

Neben immunhistochemische Analyse erfolgte elektrophysiologische Analyse der transplantierten Zellen um zu bestätigen, dass sie Gehirn Schaltung integriert haben und erwarteten intrinsische und Brennprozess Anzeigeeigenschaften. Gehirne von Mäusen P30-35 geerntet wurden und Scheiben für physiologische Aufnahmen wie zuvor beschrieben20vorbereitet. Die veredelten Interneuronen präsentiert Erwachsenen-ähnliche physiologische Eigenschaften und unterschiedliche feuern Muster könnte charakterisiert, waren Vertreter von gut charakterisierten Interneuron Subtypen (Abb. 5A), was darauf hindeutet, dass gepfropft Interneuronen konnten in der Host-Umgebung richtig Reifen. Um sicherzustellen, dass die transplantierte Zellen in das neuronale Netz integriert wurden, waren sEPSCs auch aufgezeichnete (Abb. 5 b). Darüber hinaus wurden eine Teilmenge der Transplantationen mit Interneuronen, die mit dem Ausdruck ChR2 gefolgt von Aufnahme von Pyramidenzellen lokalisierte in der Nähe von transplantierten Interneuronen durchgeführt. Diese Daten zeigen, dass postsynaptischen Gabaergen Strömungen durch blaues Licht (Abbildung 5-D) hervorgerufen werden.

Abbildung 4 : Veredelte Interneuron Vorstufen bevölkern Host Hirnregionen repräsentative Abschnitte von P30 WT-Mäusen, die transplantiert wurden mit Tomate + Interneuron Vorläufern auf P1. (A) im Orbit Cortex-Rinde Transplantationen, die transplantierten Zellen füllen alle kortikale Schichten und anzeigen Morphologien, die endogene Interneurone zu imitieren. Ausgewählte Bilder markieren die Variabilität der Zellzahlen von verschiedenen Transplantationen, mit dem linken Bild haben eine viel größere Anzahl von Tomaten + Zellen pro Abschnitt im Vergleich zu der Transplantation auf der rechten Seite. (B) geringer Vergrößerung (links) und hoher Vergrößerung (rechts) repräsentative Abschnitte von Orbit Hippocampus-Hippocampus Transplantate. Beachten Sie, dass der Großteil der Tomate + Zellen im Stratum Oriens (SO) SST (wahrscheinlich O-LM Zellen) Ausdrücken, während viele Tomaten + Zellen im Stratum Pyramidale (SP) PV (wahrscheinlich Korb-Zellen), ähnlich wie endogene hippocampal Interneuronen auszudrücken. (C) Beispiel einer heterotopisch Transplantation (Cortex, Striatum) mit Tomate + im Striatum. Skalieren Sie Bars = 200 μm in A im Bedienfeld "niedrige Mag" B, C 50 μm und high-Power Mag in B. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5 : Veredelte Interneurone sind Elektrophysiologisch ausgereift und integrieren sich in das neuronale Netz Host
(A) Repräsentative Beispiele für die höchsten Frequenzen Feuern von veredelten Interneuronen aufgenommen. Links, schnell Spick Interneuron aus ein Hip-Ctx-Transplantat injiziert aktuellen Schritte:-100 pA und 520 pA; richtige, Non-Fast Spick konnte aus einem Transplantat Ctx-Ctx injiziert aktuellen Schritte:-100 pA und 360 PA. (B) Beispiel für sEPSCs in einer spät Spick konnte von einer Transplantation von Hüfte zu Hüfte aufgezeichnet. (C) repräsentatives Bild anzeigen Nkx2.1-Cre; Ai32 (YFP) aus einem Ctx-Ctx Transplantation mit einer Biocytin gefüllt (rot) pyramidale Zelle. Maßstabsleiste = 50 μm. (D) Beispiel für einen Gabaergen postsynaptischen Ströme hervorgerufen durch blaue Lichtimpulse verzeichneten Pyramidenzellen, aufgenommen mit einem [145 mM] Cl-. In schwarz, durchschnittliche Spuren; rot verzeichnet durchschnittliche Antwort in Anwesenheit von Gabazine. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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