Methodenartikel

Ein Neurosphäre Assay auszuwertende endogenen neurale Stammzellen Aktivierung in einem Mausmodell der minimalen Spinal Cord Injury

DOI:

10.3791/57727

⸱

13. September 2018

 ,  , 
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Surgery, University of Toronto, 3Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier zeigen wir die Leistung eines minimalen Rückenmark Verletzungen Modells in einer Erwachsenen Maus, die den zentralen Kanal Nische Gehäuse endogenen neurale Stammzellen (NSCs) erspart. Wir zeigen, wie neurosphäre Assay verwendet werden kann, um Aktivierung und Migration der definitive und primitiven NSCs nach Verletzung zu quantifizieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurale Stammzellen (NSCs) im Erwachsenen Säugetier Rückenmark sind relativ mitotically Ruhestrom Einwohner periventrikulären Zellen, die studierte in Vitro mit neurosphäre Assay werden können. Dieser Assay koloniebildenden ist ein mächtiges Werkzeug um die Reaktion der NSCs auf exogene Faktoren in einer Petrischale zu studieren; jedoch kann auch hiermit, die Wirkung von in Vivo Manipulationen mit das richtige Verständnis der Stärken und Grenzen des Tests zu studieren. Eine Manipulation der klinischen Interesse ist die Wirkung von Verletzungen auf endogene Aktivierung der NSC. Aktuelle Modelle von Verletzungen des Rückenmarks sind eine Herausforderung, diese zu studieren, da die Schwere der gemeinsamen Prellung, Komprimierung und Durchtrennung Modelle führen die Zerstörung der NSC Nische an der Stelle der Verletzung wo die Stammzellen befinden. Hier beschreiben wir ein minimaler Verletzung-Modell, das an der oberflächlichen dorsolateralen Oberfläche der unteren thorakalen Ebene (T7/8) des Rückenmarks Erwachsenen Maus lokalisierte schädigt. Dieses Modell Verletzungen erspart den zentralen Kanal auf der Ebene der Verletzungen und ermöglicht Analyse von NSCs, die auf der Ebene der Läsion zu verschiedenen Zeitpunkten nach Verletzung befinden. Wir zeigen hier, wie die neurosphäre Assay genutzt werden kann, um die Aktivierung von zwei unterschiedlichen, Comyn-bezogenen, Populationen von NSCs zu studieren, die in das Rückenmark periventrikulären Region - primitiv und definitive NSCs befinden (pNSCs und dNSCs, beziehungsweise). Wir zeigen, wie zu isolieren und Kultur Diese NSCs aus der periventrikulären Region auf der Ebene der Verletzungen und der weißen Substanz Verletzung Aufstellungsort. Unsere Post-op Rückenmark Sezierungen zeigen vermehrt pNSC und dNSC abgeleitet neurosphären aus der periventrikulären Region des verletzten Schnüre im Vergleich zu Kontrollen, zu deren Aktivierung über Verletzungen sprechen. Darüber hinaus nach Verletzungen, dNSC abgeleitet neurosphären isoliert werden aus Verletzung Aufstellungsort – Nachweis der Fähigkeit der NSCs aus ihrer Nische periventrikulären auf Seiten der Verletzung zu migrieren.

Einleitung

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Das zentrale Nervensystem enthält eine Subpopulation von selbst erneuernde, multipotente Stammzellen, die alle die verschiedenen Reifen neuronale Zelle Arten1,2,3,4auslösen können. Diese neuronalen Stammzellen (NSCs) befinden sich in spezialisierten Nischen im Gehirn und im Rückenmark und nach Verletzungen zu vermehren, migrieren und differenzieren in ausgereifte Nervenzellen aktiviert werden kann. NSCs und deren Nachkommen haben gezeigt, zu der Verletzung Aufstellungsort in kortikalen Verletzung Modelle5,6migrieren. Im Gehirn nachweislich die NSCs aus der seitlichen Ventrikel an der Stelle der Verletzung zu migrieren, wo sie in Astrozyten, die glial Narbe Bildung7beitragen, zu differenzieren. Im Rückenmark jedoch wurden nur wenige Studien um zu Fragen, ob diese gleichen endogenen NSCs nutzbar gemacht werden können, Förderung der Erholung nach Verletzungen des Rückenmarks durchgeführt. In der Tat gibt es derzeit eine Debatte darüber, ob Aktivierung des Stammzell-Pools im Rückenmark eine direkte physische Schädigung der Auskleidung der zentralen Kanal8 periventrikulären Nische erfordert oder wenn die Schäden an der Wirbelsäule Parenchym (verlassen des Stamms Schnur Zelle Nische intakt) genügt zur Aktivierung endogener NSCs9zur Verfügung.

Eine Reihe von Rückenmark Verletzungen (SCI) Modelle wurden eingesetzt, um die Pathophysiologie der akuten und chronischen Verletzungen zu studieren. Diese Modelle wurden auch zur möglichen Therapien zur Behandlung von SCI durch Neuroprotektion, Immunmodulation und entwickelnden Zelle Transplantation/Ersatz Strategien10,11,13testen. Aktuelle Modelle verfügen über Kompression und/oder Prellung Verletzungen, die groß angelegte funktionelle Defizite sowie umfangreiche Läsionen und Kavitation in der Schnur14,15verursachen. Daraus resultierende glial Narben können mehrere wirbelsäulensegmente zusammen mit der Mehrheit der Breite/Umfang des Rückenmarks16erstrecken. So, während diese Modelle klinisch relevant sind, leisten sie große Herausforderungen für das Studium der Reaktion des endogenen NSCs nach Verletzung. Es gibt chemische Modelle der Verletzung, die um mildere Formen der Verletzung zu verursachen, die den zentralen Kanal17erübrigen können angepasst werden können. Jedoch diese Art von Verletzungen im Fokus der Demyelinisierung SCI zugeordnet und sind keine klinisch relevanten Modelle für die körperliche und/oder mechanische Schäden im Zusammenhang mit traumatischen Sci.

Um die Einschränkungen der aktuellen Modelle der Verletzung zu beheben, haben wir eine Nadel Track minimal SCI-Modell, ursprünglich entwickelt in der Ratte9, für den Einsatz in einer Erwachsenen Maus-Modell angepasst. Unser Modell angepasst Verletzungen erstellen eine konsistentere Läsion der dorsolateralen Region des Rückenmarks Maus und ersparen den Zentralkanal an Ebene(n) Verletzungsgefahr. Der Vorteil dieses Modells ist, dass es die Untersuchung von NSC Kinetik erlaubt nach Verletzungen und ihre mögliche radialen Migration an der Stelle der Verletzung. Die Verwendung von einem Maus-Modell ermöglicht auch den Einsatz von transgenen Mäusen, die Linie Verfolgung von endogenen NSCs und ihre Nachkommen nach Verletzung zu ermöglichen. Die Eigenschaften der NSCs können näher untersucht werden, über eine modifizierte Form des in-vitro- neurosphäre Assays, die in diesem Protokoll eingeführt wird.

Die neurosphäre-Assay ist ein in Vitro koloniebildenden Assay, der die Isolierung der NSCs im Beisein von Mitogene ermöglicht. Bei klonalen Beschichtung dichten vermehren sich einzelne NSCs um freischwebende kugelige Kolonien von Zellen entstehen, die aus einer kleinen Subpopulation von NSCs und eine große Mehrheit der Stammväter18,19bestehen. In unserem Protokoll zeigen wir die Isolierung von zwei unterschiedlichen, Comyn im Zusammenhang mit NSCs aus der periventrikulären Region des Rückenmarks-Basislinie Bedingungen und im Anschluss an unser minimal SCI-Modell. Definitive neuronale Stammzellen Zellen (dNSCs) express nestin und glial fibrillary sauren Protein (GFAP) und in Anwesenheit von epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) und Heparin (zusammen benannt EFH)20angebaut. Diese dNSCs sind selten im Rückenmark naiv, was zu sehr wenige neurosphären in Vitro. Wir zeigen jedoch, dass dNSCs nach minimal SCI, erweitert die Zahl der neurosphären isoliert von der periventrikulären Region21aktiviert sind. Primitive neurale Stammzellen (pNSCs) sind oberhalb des dNSCs in der neuronalen Stammzelle Abstammung. pNSCs sind äußerst selten, ausdrückliche niedrigen Niveau der Pluripotenz Markierung Oct4, und Leukämie hemmenden Faktor (LiF) reagieren22. pNSCs bilden keine neurosphären, wenn Sie aus dem Rückenmark Erwachsener Mäuse aufgrund des Vorhandenseins von Myelin basic Protein (MBP) in Primärkulturen isoliert; jedoch pNSC neurosphären von MBP mangelhaft Mäusen isoliert werden und ihre Zahlen sind erweiterte folgende Verletzungen – ähnlich wie bei dNSCs21. Schließlich zeigen wir, dass neurosphären dNSC abgeleitet von der Stelle der Verletzung in frühen Zeiten nach minimal Sci isoliert werden können Diese Ergebnisse zeigen, dass unsere Verletzungen Modell und Assays die Aktivierung Merkmale der periventrikulären NSCs wie ihre Fähigkeit beurteilen können, vermehren sich und Wandern in Reaktion auf eine Verletzung.

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Protokoll

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Dieses Protokoll wurde genehmigt, die vom Tier Pflege an der University of Toronto und steht im Einklang mit "Guide, der Pflege und Verwendung der Versuchstiere" (2Nd Edition, Canadian Council on Animal Care, 2017).

1. minimale Spinal Cord Injury Chirurgie

Hinweis: Vor der Operation stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumente und Materialien durch geeignete Methoden (Abbildung 1A) sterilisiert werden.

  1. Bauen Sie einen thorakalen Bogen von 4 – 5 Plätze der Gaze aufrollen und Tapen sie zusammen in der Mitte eine feste Rolle von Gaze zu erhalten.
  2. Platzieren Sie den Mauszeiger in der Induktion Kammer und initiieren Sie Anästhesie mit 5 % Isofluran zu. Das Fehlen einer Zehe Prise Reflex, bevor Sie fortfahren, als auch während des Verfahrens zu bestätigen. Während die Operation mehr als 30 min dauern kann, optimieren Sie für die minimale Isofluran-Belichtung (5 min. 5 %) und die verbleibende Zeit bei 2 – 3 %.
  3. Übertragen Sie die Maus auf eine Nase Kegel an der Narkose Maschine bei 2 – 3 % Isofluran Erhaltungsdosis befestigt. Verwenden Sie Haarschneidemaschinen, um Pelz aus der Rücken des Tieres aus der Mitte des Rückens bis zu den Hals/Ohren zu entlarven einen breiten rechteckigen Bereich der Haut für eine Operation zu entfernen.
  4. Übertragen Sie die Maus auf ein stereotaxischen Instrument, indem man seine Nase in die beigefügte bugnase und Stabilisierung des Schädels mit Ohr-Bars. Isofluran bei 5 % während der Platzierung der Ohr-Bars und unteren wieder auf 2 – 3 % zu erhalten, sobald die Maus in der stereotaktischen Gerät gesichert ist.
  5. Präoperative schmerzstillende Medikamente intraperitoneal verwalten – Meloxicam (2,0 mg/kg). Wenden Sie großzügig Auge Schmierung auf die offene Maus Augen Hornhaut Austrocknung bei der Narkose zu verhindern.
  6. Legen Sie die thorakalen Bogen unterhalb der Maus Bauch während Begradigung der Maus Körper und Wirbelsäule durch leichtes Ziehen an der Schwanzwurzel. Verwenden Sie Labor Kennzeichnung Band um die Rute und alle erweiterten Gliedmaßen in einer sternförmigen Position zu sichern. Sobald sicher ist, drücken Sie die thorakalen Bogen Rostral, aus dem Bauch der Maus in Richtung der oberen Brustkorb – um die Brustwirbelsäule (Abbildung 1 b) zu stützen.
  7. Bereiten Sie ein steriles Operationsfeld durch Desinfektion das Fell abgeschnitten Hautareal in Schritt 1.3 mit 70 % Ethanol, gefolgt von Povidon-Jod vorbereitet. Zweimal wiederholen. Wenden Sie ein steriles op Tuch um einen breiten sterilen Bereich zu halten.
  8. Mit einem #10 Skalpellklinge, machen Sie einen vertikalen Schnitt parallel zur Längsachse des Tieres vom Mittelpunkt der beiden Schulterblättern an die Krümmung der Brustwirbelsäule. Ziehen Sie die Haut, Weichteile und die Kontur der Wirbelsäule (Abbildung 1) aussetzen.
  9. Identifizieren Sie den unteren Rand des suprascapular Fettpolster (dies abgrenzt die T4/5 Ebene der Wirbelsäule). Schneiden Sie mit der gleichen #10 Klinge vorsichtig aber mit Kraft, entlang beider Seiten des vertebralen Knochen T5-T8/9, die Rücken-Muskel-Sehnen aus der Spalte zu lösen.
  10. Legen Sie die Zähne der Retraktoren in Schnitt Standorte auf beiden Seiten der Wirbelsäule. Passen Sie die Belichtung mit dem Ausbau der Retraktoren um die Wirbelsäule ausreichend zu erhöhen, ohne zu viel belasten die eingefahrenen Muskelschichten (Abbildung 1).
  11. Unter dem Operationsmikroskop sorgfältig reinigen der restlichen Muskel und andere Weichteile über der Wirbelsäule um den vertebralen Knochen (Abb. 1E) verfügbar zu machen. Identifizieren Sie die Wirbel, die werden durch umklammern den Dornfortsatz der Wirbel mit gezahnten Zangen und bewegte sie leicht entfernt werden und nach unten.
    Hinweis: Dies sollte Identifizierung der intervertebralen Gelenke ermöglichen und die kleinen Öffnungen (Foramina Bandscheiben) unter den Wirbeln von Interesse.
  12. Legen Sie einen Kopf der abgestumpften gebogene Schere in beiderseits der exponierten Bandscheiben Foramen, kaudalen, der Wirbelkörper Lamina, herausgeschnitten werden und schneiden Sie die Bandscheiben Anschlussfugen bilateral.
  13. Heben Sie der Lamina nach oben und schneiden Sie die obere Befestigung der Lamina zu isolieren und entfernen die Knochen.
    Hinweis: Dadurch werden die intakte duralsack, enthält das Rückenmark (Abb. 1F) sichtbar. Möglicherweise gibt es übermäßige Blutungen, die gesteuert werden kann, indem man vorgeschnitten 1 x 1 cm Gaze auf die betroffenen Gebiete und/oder mit sterilen PBS waschen.
  14. Legen Sie mit der dorsalen Mittellinie Vene als ein Wahrzeichen eine 45° gebogene Welle von einer Nadelspitze 30 G (mit Nadel Fase nach oben) in der dorsolateralen Oberfläche des Rückenmarks (ca. 1 mm tief) bei etwa 0,5 mm seitlich auf beiden Seiten der Mittellinie.
  15. Bewegen Sie die Nadel ~ 2 mm von kaudalen, rostral (Parallel zu der Mittellinie) so dass die gesamte Länge der Abschrägung der Nadel in die Schnur eingelegt wird. Entfernen Sie die Nadel durch Rückverfolgung über den Pfad des Eintrags (Abbildung 1).
    Hinweis: Es dürfen keine Blutung aber Schwellung des spinalen Gewebes kann bei diesem Schritt gesehen werden.
  16. Um die Wunde zu schließen, entfernen Sie die Aufrollvorrichtung und die Rückenmuskulatur auf beiden Seiten der Verletzung zusammen in der Mittellinie mit einer 6-0 resorbierbaren Naht zu Naht. Verwenden Sie eine 4-0 sterile Seide Naht, um anschließend die darüber liegende Haut zu schließen.
  17. Auftragen Sie antibiotische Salbe an die Spitze der oberflächlichen genähten Haut zur Vorbeugung von postoperativen Infektionen mit der Spitze von einem Wattestäbchen Postoperative Schmerzmittel von 0,1 mg/kg von Buprenorphin subkutan zusammen mit Flüssigkeiten (1 mL gesäugt Ringer Lösung) zu verwalten.
  18. Schalten Sie den Verdampfer Isoflurane und Sauerstoff. Entfernen Sie die Maus aus der stereotaktischen Gerät und in einen sauberen Käfig mit keine Bettwäsche.
  19. Platzieren Sie den Mauszeiger in den Käfig ca. 30 cm entfernt von einer Wärmelampe für die Wiederherstellung von Anästhesie und Monitor Verhalten nach dem Aufwachen. Die Maus sollte innerhalb von 5 – 10 min. aufwachen und haben die Hirschkuh-Limb-Funktion mit möglichen Parese und/oder Schweif Schwäche nach dem Aufwachen.
  20. Verhalten der Maus in den nächsten Tagen zu überwachen und postoperative Pflege und Analgetika (d.h., Maische, gesäugt Ringer Lösung Flüssigkeit subkutan, 0,1 mg/kg Buprenorphin 2 x täglich subkutan für 2 – 3 Tage und Eigengewicht Überwachung ) gemäß lokalen Tierhaus Vorschriften und im Einzelfall als Verwertung kann variieren.

2. Neurosphäre Assay Dissektion

Hinweis: Führen Sie korrekte sterile Gewebekultur Verfahren in der gesamten.

  1. Vorbereitung der enzymatischen Lösung
    1. Am Albumin Ovomucoid Inhibitor mit Glasflasche und sanft Wirbel bis aufgelöst fügen Sie 32 mL von Earle es ausgewogen Salz Lösung (EBSS hinzu).
    2. Ein vorportionierte Papain glasphiole 5 mL EBSS hinzu, und legen Sie in einem 37 ° C Wasserbad auflösen. Die Lösung wird klar (Lösung 1).
    3. Nehmen Sie 500 µL EBSS und fügen Sie die vorportionierte DNase ich Glas-Fläschchen zu einer Konzentration von 1 mg/mL (Lösung 2). Lösung 1 fügen Sie 250 µL dieser Mischung hinzu und mischen Sie sehr leicht durch das Fläschchen hin und her kippen.
      Hinweis: Alle Lösungen gemacht (Lösung 1 und 2) sind genug für die Verarbeitung von zwei Stücken des Gewebes. Wenn mehrere Stücke von Gewebe verarbeitet, mit mehr Lösung Prep unterzubringen.
  2. Gewebe-Vorbereitung und Dissektion
    1. Ort ein Labor abwischen Isofluran in den Käfig Maus trieft und lassen 2-3 min für Dämpfe um Maus komplett zu betäuben. Folgenden ko, entfernen Sie die Maus aus dem Käfig und das Fehlen einer Zehe-Prise Reflex zu bestätigen.
    2. Führen Sie durch zervikale Dislokation mit einem stumpfen Metallgegenstand (d.h., Metall-Käfig-Karte), das Tier einzuschläfern. Sprühen Sie das euthanasierten Tier aus seinem Hals zu Mitte hinten großzügig mit 70 % Ethanol.
    3. An der Basis des Schädels mit einer Schere den Kopf abschneiden und in einen Bio-Beutel entsorgen. Machen Sie einen Mittellinie Schnitt in der Haut über die gesamte Länge des Rückens, die Muskeln und Wirbelsäule Knochen Kontur (Abbildung 2A) verfügbar zu machen.
    4. Heben Sie die medialen Aspekt jedes Schulterblatt (dh., Schulterblatt – durch darüberliegende fettlappen identifiziert) und mit einer Schere wegschneiden Weichgewebe (zwischen Schulterblatt und Wirbelsäule). Separate voll, die zugrunde liegenden vertebrale Spalte verfügbar zu machen.
    5. Im Anschluss an die Krümmung der Wirbelsäule stecken Sie das gleiche Paar der Schere in die oberen thorakalen Blende und isolieren Sie der Wirbelsäule durch Wegschneiden beigefügten Rippen, Muskeln und inneren Organen (Abb. 2 b) zu.
    6. Einführen Sie Schere in die Caudale Wirbelkörper Foramen/Öffnung und schneiden Sie die intervertebralen Gelenke auf beiden Seiten der Schichten (dorsalen Oberfläche). Achten Sie besonders darauf, das intakte Kabel nicht beschädigen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das gewünschte Niveau und/oder Länge des Kabels ist ausgesetzt.
    7. Schneiden Sie vorsichtig die Spinal nerve(s) seitlich erstreckt sich von der Schnur vor das Rückenmark Gewebe in einer Petrischale mit regelmäßigen künstliche Liquor cerebrospinalis übertragen. Halten Sie die Probe auf Eis (Abbildung 2).
    8. Schneiden Sie unter dem Mikroskop Dissektion das Rückenmark Gewebe um ~ 2 mm rostral und kaudalen, Verletzung Aufstellungsort erweitert. Zwei Paare der Zange verwenden, um das Kabel vorsichtig in 2 Hälften längs entlang der dorsalen und ventralen Risse zu trennen (Abbildung 2").
    9. Schneiden Sie mit Microscissors den verletzten dorsolateralen weißen Substanz. Legen Sie das Stück in ein 15 mL konische Röhrchen.
    10. Hält man die Hälfte des Rückenmarks nach unten mit der Pinzette, necken und Entfernen der weißen Substanz mit ein weiteres Paar feine Pinzette entlang der Rostrocaudal Umfang des Rückenmarks, um die gewünschten periventrikulären Region zu isolieren. Wiederholen Sie für die andere Hälfte des Rückenmarks.
    11. Legen Sie die Stücke von periventrikulären Gewebe in einer separaten 15 mL konische Röhrchen. Verwenden Sie Microscissors und sanft das Gewebe gegen die Wände der konischen Röhren Blatt vor den Mund.
      Hinweis: Gewebe Dissoziation Modifikationen stammen aus Papain Dissoziation Systemprotokoll23 und zuvor beschriebenen Gewebe Vorbereitung Verfahren24.
    12. Die Gewebeprobe 2,5 mL des neuen Lösung 1 (Schritt 2.1.3) hinzu, und legen Sie auf einer Wippe bei 37 ° C für 30 Minuten.
    13. Genannte sanft das Gewebe in der Lösung mit einer PIPETTENSPITZE 1.000 µL. Zentrifugieren Sie die trüben Zellsuspension bei 300 X g für 5 min bei RT
    14. Bereite Lösung 3 mit 2,7 mL Earle es ausgewogen Salzlösung, 300 µL Ovomucoid Inhibitor Lösung (Schritt 2.1.1) und 150 µL der DNase ich Lösung (Schritt 2.1.3).
    15. Den überstand von Schritt (Schritt 2.2.13) zu verwerfen und Aufschwemmen in 1,5 mL der Lösung 3 aus dem vorherigen Schritt (Schritt 2.2.14).
    16. Diese neue Zellsuspension (Schritt 2.2.15) auf 5 mL Ovoimucoid Inhibitor Lösung (Schritt 2.1.1) in einem neuen 15 mL konische Rohr erstelle ich einen diskontinuierlichen Dichtegradienten Schicht. Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei RT.
    17. Überstand verwerfen und erneut in 2 mL Neurobasal Medien. Zentrifuge bei 300 X g für 3 min bei RT.
    18. Überstand verwerfen und in 1 mL Neurobasal Medien aufzuwirbeln. Filtern Sie die Suspension mit einer 20 µm Zelle Sieb gefolgt von 4 mL der Medien für ein Gesamtvolumen von 5 mL.
  3. Beschichtung
    1. Neurosphäre Wachstum durch die Ergänzung Neurobasal Medien mit epidermalen Wachstumsfaktor (20 ng/mL) Nährmedien vorbereiten / Fibroblasten Wachstum Faktor (20 ng/mL) / Heparin (2 µg/mL) [für definitive NSCs] oder Leukemina hemmenden Faktor (10 ng/mL) [für primitive NSCs]. Fügen Sie 10 mL der beiden Medien in einer Gewebekultur Flasche 25 mL.
    2. Verwenden Sie ein Hemocytometer und Trypan blau färben, berechnen Sie die Anzahl der Zellen in Suspension aus (Schritt 2.2.18)25. Sobald berechnet, Zellen hinzufügen Gewebe Kulturflaschen vorbereitet (Schritt 2.3.1) zu einer klonalen Dichte von 10 Zellen/µL und Ort Gewebekultur-Kolben mit zusätzlichen Zellen in den Brutkasten für 24 h (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO2).
      Hinweis: Ein Beispiel für die Zählung Technik lautet wie folgt: nehmen Sie 10 µL Zellsuspension und Mix mit 10 µL Trypan blau färben. Fügen Sie 10 µL dieser Mischung in eine Hemocytometer. Unter einem 10-fach Lichtmikroskop zählen die Anzahl der lebenden Zellen und die Summe aller Zellen innerhalb 4 der 4 x 4-Quadranten gezählt. Verwenden Sie die Formel: 100.000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1.000], geben Sie das Volumen der Zellsuspension auf in jedem 25 mL Gewebekultur Kolben darauf klonalen Dichte (10 Zellen/µL) überzogen werden.
    3. Nach 24 h sanft schwenken Sie die Flasche und Inhalt in eine 15 mL konische Rohr. Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei RT.
    4. Den überstand verwerfen und erneut aussetzen der Zellen in 1 – 2 mL frische Neurobasal Medien.
    5. Wiederholen Sie Schritt 2.3.2 um die Anzahl der Zellen in Suspension und Platte Zellen zur klonalen Dichte in einer Gewebekultur 24-Well-Platte mit 500 µL ihrer jeweiligen Mitogen ergänzt Medien (EFH für definitive NSC Wachstum) und LIF für primitive NSC Wachstum.
      Hinweis: Verwenden Sie die angepasste Formel (5.000 / [X Zellen/4) x 2 x 10 x 1.000), berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension auf in jeweils gut 500 µL Medien überzogen werden.
    6. Platten mit Zellen in den Inkubator (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO2) wachsen für 7 Tage zu platzieren.
  4. Zählen
    1. Nach 7 Tagen in der Kultur Platten ausbauen und unter einem Lichtmikroskop anzeigen. Neurosphären durch zählen kugelige Kolonien, die zu quantifizieren > 80 µm im Durchmesser für dNSCs Kulturen und > 50 µm Durchmesser für pNSCs Kulturen.
      Hinweis: Bei Bedarf neurosphären können weitere passagiert26 oder differenziert. Wenn Zellen nicht mehr benötigt werden, indem Sie Brunnen (ca. 1 mL) für 20 min beschleunigte Wasserstoffperoxid hinzufügen, so dass die Farbe des Mediums gelb zu entsorgen. Dann verwerfen.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nach der Operation sollten die Mäuse minimale motorische Defizite erleben inklusive Schweif und mögliche Hind-Limb-Parese für bis zu 24 h. Nach dieser Zeit sollten die Mäuse keine Lähmung der hinteren Gliedmaßen und/oder Parese und minimale Veränderungen in Gang erleben.

Abbildung 3 zeigt repräsentative Ergebnisse aus der neurosphäre Test 5 Tage nach der minimalen Rückenmark-Verletzung. Die absolute...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Während des chirurgischen Eingriffs gibt es ein paar wichtige Schritte wo die Forscher besondere Aufmerksamkeit widmen sollte, um optimale Ergebnisse zu erhalten und zu minimieren Variabilität zwischen den Tieren. Mit der eingeatmeten Anästhesie (Isofluran) während der Operation achten wie die Narkose neuroprotektive Wirkung mit längerer Exposition27gezeigt hat. Entsprechend, wenn das Studium der Regenerationsfähigkeit des Rückenmarks nach Verletzung, bemühen Sie, so schnell und effizient wie mögl...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wird von der Krembil Stiftung (Betriebskostenzuschuss CMM) finanziert. WX erhielt der Carlton Marguerite Smith Student Award. NL erhielt eine Ontario-Graduate-Stipendium.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Agricola RetractorFine Science Tools17005-04
Moria Vannas-Wolff Federschere (gebogen)Fine Science Tools15370-50Passen Sie bei der Bestellung an, um stumpfe Spitzen zu erhalten
Graefe Pinzette (gerade, 1 x 2 Zähne)Fine Science Tools11053-10
Extra feine Graefe Pinzette (gebogen, gezahnt)Fine Science Tools11152-10Oder eine andere Pinzette zum Nähen
Hartman-Hämostaten (gerade)Fine Science Tools13002-10Oder eine andere geeignete zum Nähen
Skalpellgriff #3Fine Science Tools10003-12Oder eine andere geeignete
Haarschneidemaschineamazon.cahttps://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BAoder eine andere geeignete
Stereotaxe InstrumentStoeling51500oder ein anderes geeignetes
Buprenorphinoder ein geeignetes, von meiner Tierpflegeeinrichtung
Meloxicam genehmigtes Instrument Meloxicamoder ein geeignetes, von der Tierpflegeeinrichtung
Tears Naturale P.M. genehmigtes Instrument.Alconhttps://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXEoder ein anderes geeignetes
Isofluran,Baxter International IncDIN 02225875oder ein anderes für die Anästhesie geeignetes
Q-Tips Cottom Swabsamazon.ca
Cotton GauzeFisher Scientific13-761-52
30 g NadelnBecton Dickinson305106für Verletzungen
25 g NadelnBecton Dickinson305122für Drogeninjektionen
1 mL SpritzenBecton Dickinson3090659für Medikamenteninjektionen
3 mL SpritzenBecton Dickinson309657für Flüssigkeitsinjektionen
4-0 Nahtuoftmedstore.com2297-VS881für die Hautnaht
6-0 Nahtuoftmedstore.comVS889für Muskelnähte
Polysporin Salbeamazon.ca 102051
Isofluran-VerdampferVetEquip901806
konische 15-ml-RöhrchenThermoFisherAlle geeigneten
PetrischalenThermoFisherAlle geeigneten
Trypan BlueThermoFisherAlle
HämozytometerThermoFisherAlle geeigneten
ZentrifugenThermoFisherAlle geeigneten
Standard-DissektionswerkzeugeFine Science Tools
DissektionsmikroskopZeissStemi 2000
ZählmikroskopOlympusCKX41
Neural Basal-A MediumInvitrogen10888-022
B27Invitrogen17404-044
Penicillin- StreptomycinGibco15070
L- GlutaminGibco25030
DMEMInvitrogen12100046
F12Invitrogen12700075
30% GlukoseSigmaG61521 M, 9,01 g in 100 mL dH2O
1 M Glukose
7,5% NaHCO3SigmaS5761155 mM, 1,30 g in 100 mL dH2O
155 mM NaHCO3
1 M HEPESSigmaH337523,83 g in 100 mL dH2O
Apo-TransferrinR& D Systems3188-AT
Putrescine SigmaP7505
InsulinSigmaI5500
SelenSigmaS9133
ProgesteronSigmaP6149
Papain-DissoziationssystemWorthington Biochemical CorporationPDS1 Fläschchen Papain kann für 2 Proben verwendet werden
: Epidermaler WachstumsfaktorInvitrogenPMG8041Pulver, rekonstituiert mit 1 ml Hormonmischung und aliquotiert in 20 μl Fläschchen zur Lagerung im Gefrierschrank
Fibroblast WachstumsfaktorInvitrogenPHG0226Pulver, rekonstituiert mit 0,5 ml Hormonmischung und aliquotiert in 20 μ; L-Fläschchen für die Lagerung im Gefrierschrank
HeparinSigmaH3149
Leukämie-Hemmfaktorim Haus
Trypanblau-Hämozytometer
24-Well-PlattenNUNC
2 M NaClSigmaS588611,69 g in 100 mL dH2O
1 M KCLSigma P54057,46 g in 100 mL dH2O
1 M MgCl2SigmaM239320,33 g in 100 mL dH2O
108 mM CaCl2Sigma C79021,59 g in 100 mL dH2O
von geeignet , https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
  2. McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
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