Obwohl viele Insekten in der Unterordnung Heteroptera (Insecta: Hemiptera) sind giftig, deren Venom-Zusammensetzung und die Funktionen ihrer Venom-Toxine sind meist unbekannt. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zum Heteropteran Gifte für weitere Charakterisierung, mittels Elektrostimulation, Belästigung und Drüse Dissektion zu ernten.
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Methodenartikel
Ernte Venom Giftstoffe aus Assassin Bugs und andere Heteropteran Insekten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Heteropteran Insekten wie Assassin Bugs (Reduviidae) und riesigen Wasserwanzen (Belostomatidae) stammte aus einem gemeinsamen Vorfahren predaceous und giftige, und die Mehrzahl der erhaltenen Wanzen behalten diese trophische Strategie. Einige Wanzen ernähren vertebrate Blut umgestellt haben (z. B. Kissing Fehler, Triatominae; und Bettwanzen, Cimicidae) während andere zurückgesetzt haben, ernähren sich von Pflanzen (die meisten Pentatomomorpha). Allerdings ist mit Ausnahme von Kissing Bugs verwendet, um zu erleichtern, Blut-Fütterung, wenig Speichel über Heteropteran Gifte im Vergleich gegen die Gifte der Schlangen, Spinnen und Skorpione bekannt.
Ein Hindernis für die Charakterisierung von Heteropteran Venom Giftstoffe ist die Struktur und Funktion der Venom/Lippen Drüsen, die sowohl morphologisch komplex sind und mehrere biologische Aufgaben (Verteidigung, Beutefang und extraoralen Verdauung). Dieser Artikel beschreibt drei Methoden, mit denen wir erfolgreich Heteropteran Gifte zu sammeln. Erstens stellen wir Elektrostimulation sowie eine komfortable Möglichkeit, Venom zu sammeln, die oft tödlich, wenn injiziert ist Beute Tiere entfällt die Kontamination von Drüsengewebe. Zweitens zeigen wir, dass sanfte Belästigung der Tiere ausreichen, um Venom Extrusion aus dem Rüssel und/oder Venom spucken in einigen Gruppen von Wanzen zu produzieren. Drittens, beschreiben wir Methoden zur Ernte Venom Giftstoffe durch Dissektion narkotisierter Tiere, die Giftdrüsen zu erhalten. Diese Methode ist komplementär zu anderen Methoden, wie es gestatten, Ernte von Toxinen aus Taxa in denen Elektrostimulation und Belästigung unwirksam sind. Diese Protokolle können Forscher Giftstoffe aus Heteropteran Insekten zur Charakterisierung von Struktur und Funktion und mögliche Anwendungen in Medizin und Landwirtschaft zu ernten.
Einleitung
Heteropteran Gifte sind potent bioaktiven Substanzen1. Beispielsweise die Venom/Speichel Absonderungen von Blut-Fütterung Heteroptera wie Kissing Bugs (Triatominae) und Wanzen (Cimicidae) erleichtert die Fütterung durch Störung der Hämostase2. Giftstoffe in diese Gifte Zielen auf mehrere Wege einschließlich Koagulation, Thrombozytenaggregation sowie Vasokonstriktion und den Schmerz und Jucken Wege. Gifte von den meisten anderen Heteropteran-Arten werden angepasst, um Raub, anstatt Blut-Fütterung zu erleichtern. Ihre Gifte verursachen Lähmung, Tod und Gewebe Verflüssigung bei in Wirbellose Tiere3,4injiziert. Wenn in Wirbeltieren injiziert, kann ihres Giftes auch drastische Auswirkungen haben. Beispielsweise führt die Injektion des Giftes von Assassin Bug Holotrichius Innesi in Wirbeltieren Muskellähmung, Schmerzen und Blutungen; Mäuse-Envenomated von diesem Fehler sterben schnell durch Atemlähmung5.
Transkriptomischen und Proteomic Untersuchungen ergaben die Proteinzusammensetzung von einigen Heteropteran Gifte. Gifte predaceous Arten sind reich an Proteasen, andere Enzyme, und Peptide und Proteine der unbekannte Struktur und Funktion6,7,8. Kissing Bug Venom ist reich an Triabin-Protein-Familie, deren Mitglieder tiefgreifend Koagulation und Thrombozytenaggregation, Vasokonstriktion2,9 beeinflussen. Allerdings ist es nicht bekannt, welche Giftstoffe die meisten Bioactivities des Giftes zugrunde liegen. Z. B. Venom Kissing Bug Triatoma Infestans gemeldet werden Schmerzmittel und hemmen Natrium-Kanäle10, aber die Komponenten verantwortlich müssen noch geklärt werden. Ebenso ist es nicht bekannt, welche Komponente(n) Assassin Bug Gift Lähmungen oder Schmerzen verursachen. Voraussetzung für die Identifizierung verantwortlich für bestimmte Venom Bioactivities und zur Charakterisierung von Struktur und Funktion von neuartigen Venom Giften, Toxinen ist Venom erhalten.
Venom wurde von Wanzen durch Elektrostimulation5,6,7,8,11,12,13, Provokation der Defensive eingeholt Antworten4,8, mechanisch quetschen Thorax12,14,15,16, sezieren, Venom Drüsen8,17 ,18,19,20,21,22und Anwendung des Agonisten muskarin Acetylcholin-Rezeptor-23. Die möglichen vor- und Nachteile einer Methode zu urteilen wird erschwert durch die Morphologie der Heteropteran Giftdrüsen, die wichtigste Drüse mit zwei separaten Lumen, die vorderen wichtigste Drüse (AMG) und posterior wichtigste Drüse (PMG), bestehen als auch eine damit verbundenen Zubehör Drüse (AG). Diese verschiedenen Drüse Fächer produzieren unterschiedliche Protein Sekrete, die für verschiedene biologische Funktionen einschließlich Beutefang, Verteidigung und extraoralen Verdauung8,17spezialisiert werden können. In Peiratine und Ectrichodiine Assassin Bugs wurde der AMG Beutefang und die PMG mit extraoralen Verdauung17zugeordnet. Jedoch ist in der Harpactorine Fehler Pristhesancus Plagipennis die PMG für Beutefang und Verdauung spezialisiert, während die AMG wird theoretisiert, um defensive Venom8absondern. Die AG wurde als kleine sekretorischen Funktion in Assassin Bugs8 oder als ein wichtiger Standort der Protease Lagerung in riesigen Wasserwanzen23beschrieben. Weitere Arbeit ist natürlich erforderlich, die Funktion jedes Fach Drüse unter verschiedenen Heteropteran Untergruppen zu klären und die Funktion der meisten Venom Toxine zu bestimmen. In diesem Bericht beschreiben wir Protokolle für die Ernte Venom Giftstoffe aus Wanzen auf dieses Ziel hin.
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Protokoll
Dieses Protokoll entspricht der University of Queensland Maßnahmengruppe in Responsible Care und das Verwenden von Tieren in Forschung und Lehre (PPL 4.20.11) sowie die National Health und Medical Research Council Australian Code für die Pflege und Nutzung der Tiere für wissenschaftliche Zwecke (8th Edition 2013).
Achtung: Achten Sie darauf, nicht Envenomated werden beim Umgang mit Assassin Bugs. Achten Sie darauf, um die Augen zu schützen, im Umgang mit Arten, die Venom defensiv zu spucken. Kümmern sich im ganzen nicht auf Versuchstiere zu verletzen. Dazu gehören Überwachung des Drucks über Beschränkungen wie Gummibänder und um sicherzustellen, dass der Rüssel nicht unterbrochen wird.
Hinweis: Optional, Betäuben Tiere durch die Einwirkung von CO2 für 0,5-2 min oder Kühlung auf 4-10 ° C vor der Venom Ernte 1-3 soll sichere Übertragung und Zurückhaltung zu erleichtern. Betäubung ist nicht unbedingt erforderlich aber sichere Zurückhaltung der agile oder starke Proben erleichtern kann. Tiere dürfen jedoch, wach um Venom Ernte zu ermöglichen. Behalten Sie downstream-Anwendungen im Hinterkopf, wenn die Entscheidung, ob Proteaseinhibitoren hinzufügen.
1. Ernte Venom Giftstoffe durch Elektrostimulation
- Erhalten Sie lebende Exemplare, um Giftstoffe zu ernten.
- Einsatz vorbereitete Kunststoff Pinzette mit positiven und negativen Elektroden montiert auf beiden Tipp. Schließen Sie elektrifizierte Pinzette an ein Elektrostimulator oder eine Quelle für konstante Spannung, der ermöglicht die Anpassung der Spannung an.
- Verwenden Sie für kleine (~ 10 mm) und groß (~ 25 mm) Assassin Bugs Peak Spannungen von 15 und 25 V bzw..
- Verwenden Sie für größere Wanzen wie riesige Wasserwanzen bis zu 40 V.
- Zurückhalten Sie live Fehler durch Umreifen sie zu einer Plattform mit einem Gummiband über dem Thorax.
- Setzen Sie die Spitze der Rüssel in einen entsprechenden Hinweis sammeln. Verwenden Sie für Assassin Bugs einer PIPETTENSPITZE P200. Für riesige Wasserwanzen, schneiden die Extremität aus ein P200-Tipp, um die Blende zu vergrößern.
- Heben Sie den Rüssel mit einem geschlossenen sauberen Pinzette und schieben Sie offenen Blende der Sammlung Spitze über das Ende der Rüssel.
- Falls gewünscht, Aufnahme ~ 5 µL Reinstwasser vor Erteilung der Rüssel in das Sammeln Tipp. Dies reduziert die Verluste Gift bleibt innerhalb der Spitze, obwohl die geernteten Venom verdünnt werden.
- Gelten Sie Elektrostimulation. Tauchen Sie die stimulierenden Elektroden in leitfähigen Gel, wie 2,5 M NaCl/50% Glycerin. Bringen Sie die Elektroden auf den Brustkorb. Belostomatids beantragen Sie die beiden Elektroden an die dorsale hintere Oberfläche des Kopfes.
- Speichern Sie Venom, Autodegradation zu verhindern. Nachdem Venom extrudiert wird, übertragen Sie schnell auf ein Rohr bei-20 ° C oder-60 ° C oder ein Röhrchen mit Protease-Inhibitor Cocktail.
- Wiederholen Sie die Schritte 1,5 und 1,6 bis ausreichend Venom übernommen wird oder keine weiteren Venom bevorstehend ist.
2. Gewinnung von Venom Giftstoffe durch Belästigung
- Bereiten Sie Tiere für die Ernte von Venom und setzen Sie die Spitze der Rüssel in einen Vorraum der Sammlung, wie in den Absätzen 1.1 und 1.3-1.4 beschrieben.
- Wenn Venom spontan extrudiert wird, gehen Sie zu Schritt 2.3. Ist dies nicht der Fall, die Tiere zu belästigen, sanft berühren sie an Beinen, Bauch und Antennen mit einer Pinzette bis Venom entsteht.
- Übertragen Sie schnell Venom auf ein Rohr bei-20 ° C oder 60 ° C oder ein Rohr mit Proteasehemmer cocktail, falls gewünscht.
3. Gewinnung von Venom Giftstoffe durch Belästigung von Venom "Spucken" Arten
- Betäuben Sie oder betäuben Sie teilweise, das Insekt vor Herausnahme aus seinem Gehege, vorzeitige defensive spucken zu verhindern.
- Venom spucken Verhalten zu provozieren. Enthalten Sie, und positionieren Sie das Insekt mit dem tiefen Deckel von einem Standard 90 x 16 mm Petrischale. Halten Sie den Deckel leicht posterior und 1-4 cm über das Insekt, Flug zu verhindern. Die meisten Insekten werden mehrfach, oft kurz hintereinander spucken. Sicherstellen Sie, dass alle Venom auf der Unterseite der Schale gesammelt wird.
- Sammeln Sie die Venom auf der Unterseite der Petrischale durch Spülen mit 10 µL Reinstwasser. Übertragen Sie schnell auf ein Rohr bei-20 ° C oder-60 ° C oder ein Röhrchen mit Protease-Inhibitor Cocktail.
4. Ernte Venom Giftstoffe durch Drüse Dissektion
- Tiere zu opfern. Stark zu betäuben oder zu töten, Tiere mit > 5 min Exposition gegenüber CO2. Rohr-pure CO2 direkt in die Luftlöcher des Tieres Gehäuse Gehäuse.
- PIN-Insekt Dissektion Tray. Sezieren Sie für Assassinen Bugs durch die ventrale Oberfläche (4.3). Sezieren Sie für riesige Wasserwanzen durch die dorsalen Oberfläche (4.4).
- Ventralen Dissektion
- Fügen Sie drei Stifte in den hinteren Bauchraum das Insekt ohne Durchbohrung der Giftdrüsen gedrückt.
- Geschnitten Sie einen kurze Mittellinie Schnitt in der ventralen Oberfläche des Bauches mit einer Miniatur-Skalpell. Verwenden Sie Miniatur Schere, um die Mittellinie Inzision anterior auf den Kopf, kümmert sich um das Exoskelett nur schneiden und beschädigt nicht die interne Strukturen zu verlängern.
- Um die internen Strukturen aufzudecken, machen Sie mehrere seitliche Einschnitte erstreckt sich von der Mittellinie Schnitt an der Seite des Insekts. Dann pin wieder jede Klappe des ventralen Exoskelett, interne Strukturen zu offenbaren.
- Machen Sie für große Assassin Bugs vier seitliche Einschnitte in die Mitte des Abdomen, vorderen Bauch, zwischen ersten und zweiten Beine und vor der ersten Etappe.
- Dorsalen Dissektion
- Entfernen Sie die Flügel in der Nähe der Basis. Fügen Sie drei Stifte in den hinteren Bauchraum das Insekt ohne Durchbohrung der Giftdrüsen gedrückt.
- Schneiden Sie einen Mittellinie Schnitt aus dem Kopf auf den Bauch mit Miniatur-Schere und Skalpell, kümmert sich um das Exoskelett nur geschnitten und interne Strukturen nicht zu beschädigen.
- Erzwingen Sie die beiden Hälften des Insekts auseinander. Platzieren von mehreren Pins seitlich entlang der Länge des Insekts, der inneren Hohlraum ausgesetzt zu verlassen.
- Entfernen Sie die Flugmuskeln mit einer Pinzette.
- Die Dissektion Tablett zu überfluten. Fügen Sie PBS, bis der Fehler untergetaucht ist, um interne Strukturen hinaufschweben und werden leichter visualisiert.
- Mit Pinzette und Mikro-Schere, vorsichtig, Binde- und Nervengewebe und Luftröhre. Die Giftdrüsen erscheinen als länglich, durchscheinend Strukturen entlang jeder Seite der Verdauungskanal erstreckt.
- Identifizieren Sie die wichtigste Drüse durch ihr charakteristisches Erscheinungsbild, mit vorderen und hinteren Lappen und zwei Kanälen an der Hilus.
- Falls gewünscht, identifizieren Sie die Zubehör Drüse durch das Rohr aus dem Hilus verfolgen. Befreien Sie die wichtigste Drüse durch Schneiden die zwei Kanäle aus dem Hilus.
- Ernten Sie die gewünschte Drüse Lumen. Übertragen die Drüse zu einem Microcentrifuge auf Eis mit 30 µL PBS oder RTL plus Proteaseinhibitor cocktail. Die Drüsen mit einer sauberen scharfe Nadel Lanze.
- Vortex für 10 s und Zentrifuge (1 min, 5.000 × g, 4 ° C), die Drüse Lumen zu leeren. Entfernen Sie das Drüsengewebe mit einer Pinzette.
- Klären des Toxin-Extraktes. Zentrifuge (5 min, 17.000 × g, 4° C), feste Partikel, Beibehaltung des Überstands und verwerfen die Pellets zu entfernen. Lagerung bei-20 ° C und-60 ° C bis Autoproteolytic Abbau zu verhindern.
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Ergebnisse
Einige Heteropteran Arten, wie die Harpactorine p. Plagipennis und die Reduviine Platymeris Rhadamanthus, liefern zuverlässig große Mengen (5-20 µL) des Giftes in Reaktion auf Elektrostimulation (Tabelle 1). Im allgemeinen führen die meisten Peiratine, Reduviine und Harpactorine Bugs Venom als Reaktion auf diese Methode. Unter den Stenopodaine Fehler entlockte Elektrostimulation Venom aus Oncocephalus SP., aber nicht Thodelmus sp. Die H...
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Diskussion
Der wichtigste Schritt bei der Ernte Assassin Bug Venom ist die Auswahl der geeigneten Methode je nach Zweck der Studie. Jede der drei Methoden zur Ernte Heteropteran Gifte hat vor- und Nachteile je nach downstream-Anwendungen.
Induktion Fehler Venom aus der Rüssel (Protokolle 1-3) vertreiben vermeidet Kontamination des Giftes von Drüsengewebe. Darüber hinaus diese Methoden sind nicht tödlich und können viele Male wiederholt werden, im Laufe des Lebens einen Fehler. Elektrostimulation in der R...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir anerkennen finanzielle Unterstützung von der Australian Research Council (Zuschüsse DP130103813 und LP140100832, G.F.K., DECRA Gemeinschaft DE160101142, EABU), der Australian National Health & Medical Research Council (Principal Research Fellowship APP1044414, G.F.K.), und der University of Queensland (Postdoctoral Fellowship, A.A.W.).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Elektrostimulator | Grass Technologies | S48 Square Pulse Stimulator | Elektrostimulator für gepulste Elektrostimulation |
| Federleichte Pinzette | Australischer Entomologe Zubehör | E122B | Für den Umgang mit lebenden giftigen Insekten |
| Proteasehemmer Cocktail | Sigma | 4693124001 | Zur Verhinderung der autoproteolytischen Verdauung von Gift |
| Dissektion Ausrüstung | Australian Entomological Supplies | E152Micro | Für feine Dissektionen |
| Insektenstifte | Australian Entomological Supplies | E162 | Für feine Dissektionen |
Referenzen
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