Ernte Venom Giftstoffe aus Assassin Bugs und andere Heteropteran Insekten

Heteropteran Gifte sind potent bioaktiven Substanzen¹. Beispielsweise die Venom/Speichel Absonderungen von Blut-Fütterung Heteroptera wie Kissing Bugs (Triatominae) und Wanzen (Cimicidae) erleichtert die Fütterung durch Störung der Hämostase². Giftstoffe in diese Gifte Zielen auf mehrere Wege einschließlich Koagulation, Thrombozytenaggregation sowie Vasokonstriktion und den Schmerz und Jucken Wege. Gifte von den meisten anderen Heteropteran-Arten werden angepasst, um Raub, anstatt Blut-Fütterung zu erleichtern. Ihre Gifte verursachen Lähmung, Tod und Gewebe Verflüssigung bei in Wirbellose Tiere^3,4injiziert. Wenn in Wirbeltieren injiziert, kann ihres Giftes auch drastische Auswirkungen haben. Beispielsweise führt die Injektion des Giftes von Assassin Bug Holotrichius Innesi in Wirbeltieren Muskellähmung, Schmerzen und Blutungen; Mäuse-Envenomated von diesem Fehler sterben schnell durch Atemlähmung⁵.

Transkriptomischen und Proteomic Untersuchungen ergaben die Proteinzusammensetzung von einigen Heteropteran Gifte. Gifte predaceous Arten sind reich an Proteasen, andere Enzyme, und Peptide und Proteine der unbekannte Struktur und Funktion^6,7,8. Kissing Bug Venom ist reich an Triabin-Protein-Familie, deren Mitglieder tiefgreifend Koagulation und Thrombozytenaggregation, Vasokonstriktion^{2,9 beeinflussen}. Allerdings ist es nicht bekannt, welche Giftstoffe die meisten Bioactivities des Giftes zugrunde liegen. Z. B. Venom Kissing Bug Triatoma Infestans gemeldet werden Schmerzmittel und hemmen Natrium-Kanäle¹⁰, aber die Komponenten verantwortlich müssen noch geklärt werden. Ebenso ist es nicht bekannt, welche Komponente(n) Assassin Bug Gift Lähmungen oder Schmerzen verursachen. Voraussetzung für die Identifizierung verantwortlich für bestimmte Venom Bioactivities und zur Charakterisierung von Struktur und Funktion von neuartigen Venom Giften, Toxinen ist Venom erhalten.

Venom wurde von Wanzen durch Elektrostimulation^{5,6,7,8,11,12,13}, Provokation der Defensive eingeholt Antworten^4,8, mechanisch quetschen Thorax^12,14,15,16, sezieren, Venom Drüsen^{8,17 ,18,19,20,21,22}und Anwendung des Agonisten muskarin Acetylcholin-Rezeptor-²³. Die möglichen vor- und Nachteile einer Methode zu urteilen wird erschwert durch die Morphologie der Heteropteran Giftdrüsen, die wichtigste Drüse mit zwei separaten Lumen, die vorderen wichtigste Drüse (AMG) und posterior wichtigste Drüse (PMG), bestehen als auch eine damit verbundenen Zubehör Drüse (AG). Diese verschiedenen Drüse Fächer produzieren unterschiedliche Protein Sekrete, die für verschiedene biologische Funktionen einschließlich Beutefang, Verteidigung und extraoralen Verdauung^8,17spezialisiert werden können. In Peiratine und Ectrichodiine Assassin Bugs wurde der AMG Beutefang und die PMG mit extraoralen Verdauung¹⁷zugeordnet. Jedoch ist in der Harpactorine Fehler Pristhesancus Plagipennis die PMG für Beutefang und Verdauung spezialisiert, während die AMG wird theoretisiert, um defensive Venom⁸absondern. Die AG wurde als kleine sekretorischen Funktion in Assassin Bugs⁸ oder als ein wichtiger Standort der Protease Lagerung in riesigen Wasserwanzen²³beschrieben. Weitere Arbeit ist natürlich erforderlich, die Funktion jedes Fach Drüse unter verschiedenen Heteropteran Untergruppen zu klären und die Funktion der meisten Venom Toxine zu bestimmen. In diesem Bericht beschreiben wir Protokolle für die Ernte Venom Giftstoffe aus Wanzen auf dieses Ziel hin.

Dieses Protokoll entspricht der University of Queensland Maßnahmengruppe in Responsible Care und das Verwenden von Tieren in Forschung und Lehre (PPL 4.20.11) sowie die National Health und Medical Research Council Australian Code für die Pflege und Nutzung der Tiere für wissenschaftliche Zwecke (8^th Edition 2013).

Achtung: Achten Sie darauf, nicht Envenomated werden beim Umgang mit Assassin Bugs. Achten Sie darauf, um die Augen zu schützen, im Umgang mit Arten, die Venom defensiv zu spucken. Kümmern sich im ganzen nicht auf Versuchstiere zu verletzen. Dazu gehören Überwachung des Drucks über Beschränkungen wie Gummibänder und um sicherzustellen, dass der Rüssel nicht unterbrochen wird.

Hinweis: Optional, Betäuben Tiere durch die Einwirkung von CO₂ für 0,5-2 min oder Kühlung auf 4-10 ° C vor der Venom Ernte 1-3 soll sichere Übertragung und Zurückhaltung zu erleichtern. Betäubung ist nicht unbedingt erforderlich aber sichere Zurückhaltung der agile oder starke Proben erleichtern kann. Tiere dürfen jedoch, wach um Venom Ernte zu ermöglichen. Behalten Sie downstream-Anwendungen im Hinterkopf, wenn die Entscheidung, ob Proteaseinhibitoren hinzufügen.

1. Ernte Venom Giftstoffe durch Elektrostimulation

1. Erhalten Sie lebende Exemplare, um Giftstoffe zu ernten.
2. Einsatz vorbereitete Kunststoff Pinzette mit positiven und negativen Elektroden montiert auf beiden Tipp. Schließen Sie elektrifizierte Pinzette an ein Elektrostimulator oder eine Quelle für konstante Spannung, der ermöglicht die Anpassung der Spannung an.
   1. Verwenden Sie für kleine (~ 10 mm) und groß (~ 25 mm) Assassin Bugs Peak Spannungen von 15 und 25 V bzw..
   2. Verwenden Sie für größere Wanzen wie riesige Wasserwanzen bis zu 40 V.
3. Zurückhalten Sie live Fehler durch Umreifen sie zu einer Plattform mit einem Gummiband über dem Thorax.
4. Setzen Sie die Spitze der Rüssel in einen entsprechenden Hinweis sammeln. Verwenden Sie für Assassin Bugs einer PIPETTENSPITZE P200. Für riesige Wasserwanzen, schneiden die Extremität aus ein P200-Tipp, um die Blende zu vergrößern.
   1. Heben Sie den Rüssel mit einem geschlossenen sauberen Pinzette und schieben Sie offenen Blende der Sammlung Spitze über das Ende der Rüssel.
   2. Falls gewünscht, Aufnahme ~ 5 µL Reinstwasser vor Erteilung der Rüssel in das Sammeln Tipp. Dies reduziert die Verluste Gift bleibt innerhalb der Spitze, obwohl die geernteten Venom verdünnt werden.
5. Gelten Sie Elektrostimulation. Tauchen Sie die stimulierenden Elektroden in leitfähigen Gel, wie 2,5 M NaCl/50% Glycerin. Bringen Sie die Elektroden auf den Brustkorb. Belostomatids beantragen Sie die beiden Elektroden an die dorsale hintere Oberfläche des Kopfes.
6. Speichern Sie Venom, Autodegradation zu verhindern. Nachdem Venom extrudiert wird, übertragen Sie schnell auf ein Rohr bei-20 ° C oder-60 ° C oder ein Röhrchen mit Protease-Inhibitor Cocktail.
7. Wiederholen Sie die Schritte 1,5 und 1,6 bis ausreichend Venom übernommen wird oder keine weiteren Venom bevorstehend ist.

2. Gewinnung von Venom Giftstoffe durch Belästigung

1. Bereiten Sie Tiere für die Ernte von Venom und setzen Sie die Spitze der Rüssel in einen Vorraum der Sammlung, wie in den Absätzen 1.1 und 1.3-1.4 beschrieben.
2. Wenn Venom spontan extrudiert wird, gehen Sie zu Schritt 2.3. Ist dies nicht der Fall, die Tiere zu belästigen, sanft berühren sie an Beinen, Bauch und Antennen mit einer Pinzette bis Venom entsteht.
3. Übertragen Sie schnell Venom auf ein Rohr bei-20 ° C oder 60 ° C oder ein Rohr mit Proteasehemmer cocktail, falls gewünscht.

3. Gewinnung von Venom Giftstoffe durch Belästigung von Venom "Spucken" Arten

1. Betäuben Sie oder betäuben Sie teilweise, das Insekt vor Herausnahme aus seinem Gehege, vorzeitige defensive spucken zu verhindern.
2. Venom spucken Verhalten zu provozieren. Enthalten Sie, und positionieren Sie das Insekt mit dem tiefen Deckel von einem Standard 90 x 16 mm Petrischale. Halten Sie den Deckel leicht posterior und 1-4 cm über das Insekt, Flug zu verhindern. Die meisten Insekten werden mehrfach, oft kurz hintereinander spucken. Sicherstellen Sie, dass alle Venom auf der Unterseite der Schale gesammelt wird.
3. Sammeln Sie die Venom auf der Unterseite der Petrischale durch Spülen mit 10 µL Reinstwasser. Übertragen Sie schnell auf ein Rohr bei-20 ° C oder-60 ° C oder ein Röhrchen mit Protease-Inhibitor Cocktail.

4. Ernte Venom Giftstoffe durch Drüse Dissektion

1. Tiere zu opfern. Stark zu betäuben oder zu töten, Tiere mit > 5 min Exposition gegenüber CO₂. Rohr-pure CO₂ direkt in die Luftlöcher des Tieres Gehäuse Gehäuse.
2. PIN-Insekt Dissektion Tray. Sezieren Sie für Assassinen Bugs durch die ventrale Oberfläche (4.3). Sezieren Sie für riesige Wasserwanzen durch die dorsalen Oberfläche (4.4).
3. Ventralen Dissektion
   1. Fügen Sie drei Stifte in den hinteren Bauchraum das Insekt ohne Durchbohrung der Giftdrüsen gedrückt.
   2. Geschnitten Sie einen kurze Mittellinie Schnitt in der ventralen Oberfläche des Bauches mit einer Miniatur-Skalpell. Verwenden Sie Miniatur Schere, um die Mittellinie Inzision anterior auf den Kopf, kümmert sich um das Exoskelett nur schneiden und beschädigt nicht die interne Strukturen zu verlängern.
   3. Um die internen Strukturen aufzudecken, machen Sie mehrere seitliche Einschnitte erstreckt sich von der Mittellinie Schnitt an der Seite des Insekts. Dann pin wieder jede Klappe des ventralen Exoskelett, interne Strukturen zu offenbaren.
   4. Machen Sie für große Assassin Bugs vier seitliche Einschnitte in die Mitte des Abdomen, vorderen Bauch, zwischen ersten und zweiten Beine und vor der ersten Etappe.
4. Dorsalen Dissektion
   1. Entfernen Sie die Flügel in der Nähe der Basis. Fügen Sie drei Stifte in den hinteren Bauchraum das Insekt ohne Durchbohrung der Giftdrüsen gedrückt.
   2. Schneiden Sie einen Mittellinie Schnitt aus dem Kopf auf den Bauch mit Miniatur-Schere und Skalpell, kümmert sich um das Exoskelett nur geschnitten und interne Strukturen nicht zu beschädigen.
   3. Erzwingen Sie die beiden Hälften des Insekts auseinander. Platzieren von mehreren Pins seitlich entlang der Länge des Insekts, der inneren Hohlraum ausgesetzt zu verlassen.
   4. Entfernen Sie die Flugmuskeln mit einer Pinzette.
5. Die Dissektion Tablett zu überfluten. Fügen Sie PBS, bis der Fehler untergetaucht ist, um interne Strukturen hinaufschweben und werden leichter visualisiert.
6. Mit Pinzette und Mikro-Schere, vorsichtig, Binde- und Nervengewebe und Luftröhre. Die Giftdrüsen erscheinen als länglich, durchscheinend Strukturen entlang jeder Seite der Verdauungskanal erstreckt.
   1. Identifizieren Sie die wichtigste Drüse durch ihr charakteristisches Erscheinungsbild, mit vorderen und hinteren Lappen und zwei Kanälen an der Hilus.
   2. Falls gewünscht, identifizieren Sie die Zubehör Drüse durch das Rohr aus dem Hilus verfolgen. Befreien Sie die wichtigste Drüse durch Schneiden die zwei Kanäle aus dem Hilus.
7. Ernten Sie die gewünschte Drüse Lumen. Übertragen die Drüse zu einem Microcentrifuge auf Eis mit 30 µL PBS oder RTL plus Proteaseinhibitor cocktail. Die Drüsen mit einer sauberen scharfe Nadel Lanze.
   1. Vortex für 10 s und Zentrifuge (1 min, 5.000 × g, 4 ° C), die Drüse Lumen zu leeren. Entfernen Sie das Drüsengewebe mit einer Pinzette.
8. Klären des Toxin-Extraktes. Zentrifuge (5 min, 17.000 × g, 4° C), feste Partikel, Beibehaltung des Überstands und verwerfen die Pellets zu entfernen. Lagerung bei-20 ° C und-60 ° C bis Autoproteolytic Abbau zu verhindern.

Einige Heteropteran Arten, wie die Harpactorine p. Plagipennis und die Reduviine Platymeris Rhadamanthus, liefern zuverlässig große Mengen (5-20 µL) des Giftes in Reaktion auf Elektrostimulation (Tabelle 1). Im allgemeinen führen die meisten Peiratine, Reduviine und Harpactorine Bugs Venom als Reaktion auf diese Methode. Unter den Stenopodaine Fehler entlockte Elektrostimulation Venom aus Oncocephalus SP., aber nicht Thodelmus sp. Die Holoptiline und Emesine Bugs, die Stichprobe Ausbeute nicht signifikante Venom (z.B. genug für die Analyse durch Massenspektrometrie) als Reaktion auf Elektrostimulation. Elektrostimulation kann auch verwendet werden, um Venom aus Belostomatid Bugs und räuberische Wanzen zu ernten. Allerdings induzierte Elektrostimulation Wasser Scorpions (Nepidae) Veröffentlichung der Inhalte der cephalic Drüsen nur, anstatt Venom aus dem Rüssel. Venom durch Elektrostimulation bei einigen Arten zu ernten ist am ehesten durch die morphologische Komplexität der Giftdrüsen und die physiologischen Mechanismen, die kontrollieren der Freisetzung von Venom8.

Neben der Freigabe von Venom durch Elektrostimulation, Reduviids p. Plagipennis, Havinthus Rufovarius, p. Rhadamanthus und Belostomatid Lethocerus Distinctifemur, wird spontan werfen Sie Venom aus dem Rüssel aus bei der Handhabung. Solchen Venom Auswurf defensive zeigt häufig begleitet. P. Rhadamanthus spuckt auch Venom defensiv4, ein Verhalten, das auftritt, in Schlangen24 und Spinnen25 aber von denen wir nicht bewusst in anderen Reduviid-Arten.

SDS-PAGE und Proteomics Experimente zeigen, dass die Gifte geerntet, indem man Elektrostimulation und Belästigung eiweißreichen6,7,8. Proteine machen einen Großteil der materielle Gegenwart, obwohl es auch wahrscheinlich, dass Gifte anorganische Ionen und andere Stoffe enthalten. Assassin-Bug Venom durch Elektrostimulation und Belästigung erhalten in der Regel enthält mehr als hundert Peptide und Proteine (Abbildung 1, Abbildung 2). Belostomatid Venom wurde zuvor berichtet, reich an Lysophospholipids13. Infrarot-Absorption Spektren des Giftes aus dem Belostomatine Wasser Bug Diplonychus Eques stehen im Einklang mit einem Gehalt an Proteinen und Lysophospholipids. Nur für Protein und nicht Lysophospholipids6wurde für die Lethocerine L. DistinctifemurBeweise gefunden.

Wie Spinne Gifte26berichtet, dürfte die Venom aus Heteropteran Insekten geerntet variieren in Konzentration und Zusammensetzung, je nach dem Insekt verwendet und die Methode, durch die es geerntet wird. UV-Spektroskopie von verdünnten Venom Proben schlägt Absorption Werte (ein280) von 50-250 (10 mm Weglänge) für unverdünnte Venom, Einklang mit einer hohen Proteinkonzentration von ~ 50-250 mg/mL7,12,19. Beute-Entzug wurde berichtet, zu aufeinander folgenden Anstieg Venom Konzentration und gelähmten potenzielle3 sowie sukzessiven Rückgang der pH-Wert27führen. Verlängerte Hunger führt jedoch im Zustand und Tod. Sowie Konzentration kann die Methode mit der Venom von Wanzen geerntet wird seine Zusammensetzung beeinflussen. Toxin Zusammensetzung des Giftes von Assassin Bug p. Plagipennis unterschieden sich deutlich, je nachdem, ob es durch Elektrostimulation oder Belästigung8geerntet wurde. Im Falle von p. Plagipenniszeigte dies durch Elektrostimulation den Inhalt der PMG nachgiebig zu sein, während Belästigung der Inhalt des AMG ergab. Venom erhält man durch Elektrostimulation, aber keine Belästigung, potent gelähmte Beute Insekten (Abbildung 3). Es ist jedoch unklar, inwieweit dieses Ergebnis auf anderen Reduviidae oder andere Heteroptera verallgemeinert werden kann.

Ernte von Venom direkt durch Sezieren Giftdrüsen ermöglicht die Kontrollmechanismen der Giftdrüsen umgangen werden, auf Kosten der Kontamination mit Drüsengewebe (nicht-Venom) Proteine. Unabhängig davon können Extrakte aus seziert Material gewonnen für Bioaktivität/Toxizität Assays verwendet werden. Zum Beispiel wurden Extrakte der PMG, AMG und AG von p. Plagipennis, unter Verwendung der oben genannten Protokoll mit flüssige Chromatographie/Tandem-Massenspektrometrie8analysiert. Dieser Prozess identifiziert insgesamt 182, 114 und 71 Proteine insgesamt, davon 45, 51 und 12 als vermeintliche Venom Proteine basierend auf Aminosäure-Sequenz Merkmale mit den verbleibenden Proteinen als vermeintliche Zimmermädchen Proteine klassifiziert eingestuft wurden. Injektion von Extrakten der PMG, aber nicht AMG oder AG, in Insekten führte zu Lähmung und Tod8.

Tabelle 1: Taxon Spezifität der Methoden zur Ernte Venom von Wanzen.

Abbildung 1 : Proteine erkannt von LC-MS/MS-Analyse der 2D SDS-PAGE-Spots und HPLC Bruchteile von Venom gesammelt von P. Plagipennis durch Elektrostimulation (Protokoll 1), zeigt reichlich Proteasen, CUB-Domäne und Proteine Heteropteran Venom Family 1. (A) 2D SDS-PAGE Gel von Rohöl p. Plagipennis Venom, zeigt Proteinfamilien von LC-MS/MS Gel Spots identifiziert. (B) HPLC-Chromatogramm von Fraktionierung p. Plagipennis Gift, zeigt Proteinfamilien von LC-MS/MS-Analyse der gesammelten Fraktionen identifiziert. Reproduziert mit Erlaubnis7. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Anteil der Sequenzen gehören zu jeder großen Protein-Klasse in der Venom von P. Plagipennis. Reproduziert mit Erlaubnis7. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : P. Plagipennis Venom erhalten durch Elektrostimulation, aber keine Belästigung, lähmt Insekten. (A) Wirkung der Injektion Venom durch Elektrostimulation oder Belästigung oder Wasser auf Cricket Flucht gewonnen. Für jede Bedingung Venom 0,17 µL Venom gleichwertig in den Bauch und die Zeit zu einen umgedrehten Petrischale Deckel entweichen injiziert wurde (s, bis zu 300 s, Mittelwert ± SD) erzielte. (B) Dosis-Wirkungs-Kurve für die Hemmung der Flucht Erfolg von Venom aus p. Plagipennis durch Elektrostimulation gewonnen. Reproduziert mit Erlaubnis8. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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