Methodenartikel

Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten

DOI:

10.3791/57731

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13. September 2018

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1Center for Mitochondrial and Epigenomic Medicine, Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Cellular and Molecular Biology, University of Pennsylvania, 3Department of Biological Sciences, Mississippi State University, 4Center for Mechanisms of Evolution, Biodesign Institute, Arizona State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll bietet Forschern mit einem neuen Tool um die Treue der Transkription in mehrere Modellorganismen zu überwachen.

Zusammenfassung

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Genaue Transkription ist erforderlich für den treuen Ausdruck der genetischen Information. Überraschend allerdings wenig über die Mechanismen, die die Treue der Transkription zu steuern bekannt ist. Um diese Lücke in den wissenschaftlichen Erkenntnissen optimiert wir vor kurzem die Kreis-Sequenzierung Assay um Übertragungsfehler während das Transkriptom des Saccharomyces Cerevisiae, Drosophila Melanogasterund Caenorhabditis erkennen Elegans. Dieses Protokoll erhalten Forscher mit ein leistungsfähiges neues Tool um die Landschaft der Übertragungsfehler in eukaryontischen Zellen zuzuordnen, so dass die Mechanismen, die die Treue der Transkription Steuern noch nie da gewesenen detailliert aufgeklärt werden können.

Einleitung

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Das Genom enthält eine genaue biologische Bauplan des Lebens. Um dieses Konzept richtig zu implementieren, ist es wichtig, dass das Genom mit großer Präzision transkribiert werden. Transkription ist jedoch unwahrscheinlich, fehlerfrei zu sein. Z. B. RNA-Polymerasen sind seit langem bekannt, fehleranfällige in-vitro-1,2, und es wurde kürzlich gezeigt, dass sie Fehler in Vivo begehen sowie3,5,6, besonders bei der Konfrontation mit DNA-Schaden7,8,9,10. Zusammengenommen zeigen diese Beobachtungen, dass Übertragungsfehler auftreten kontinuierlich in allen lebenden Zellen, was darauf hindeutet, dass sie eine potente Quelle für mutierte Proteine sein könnte.

Dabei bezeichnet transkriptionelle Mutagenese, unterscheidet sich von klassischen Mutagenese in zweierlei Hinsicht. Erstens im Gegensatz zu genetischen Mutationen, Übertragungsfehler mitotische und Post-mitotische Zellen beeinflussen, wie sie DNA-Replikation nicht abhängen. Die Mechanismen, die die Treue der Transkription auswirken wird, daher wertvolle Einblicke in die Mutation Last der mitotischen und Post-mitotischen Zellen bereitstellen. Interessanterweise, Übertragungsfehler haben vor kurzem bei der Förderung von Protein Aggregation11,12,13 in Verbindung gebracht und haben beide Karzinogenese10 Beitrag zur vermutet worden und die Entwicklung der Antibiotika-Resistenz bei Bakterien14.

Zweitens sind im Gegensatz zu genetischen Mutationen, Übertragungsfehler vorübergehend in der Natur. Ihre temporäre Existenz ist besonders anspruchsvoll, da dadurch Übertragungsfehler überaus schwer zu erkennen. Zum Beispiel während verschiedenen Laboren wertvolle Reporter Assays für die Untersuchung der transkriptionellen Mutagenese geplant haben, können diese Tests nur Übertragungsfehler in einer begrenzten Anzahl von Kontexten und Modell Organismen4,15messen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben viele Forscher RNA Sequenzierung Technik (RNA-Seq) verwandelt, die theoretisch Übertragungsfehler während das Transkriptom Art aufgezeichnet werden können. Diese Studien sind jedoch leicht durch Bibliothek Bau Artefakte, z. B. reverse Transkriptionsfehler, PCR-Amplifikation Fehler und die fehleranfällige Art der Sequenzierung selbst verwechselt. Z. B. begehen Reverse Transcriptases etwa ein Fehler jeden ~ 20.000 Basen, während RNA-Polymerasen (RNAPs) nur ein Fehler alle 300.000 Basen5,6machen sollen. Da die Fehlerquote der reversen Transkription allein die Fehlerquote der RNA-Polymerasen in den Zellen Zwerge, ist es praktisch unmöglich, wahre Übertragungsfehler von Artefakten, verursacht durch die Bibliothek Vorbereitung mit traditionellen RNA-Seq-Daten ( zu unterscheiden Abbildung 1a).

Um dieses Problem zu lösen, entwickelten wir eine optimierte Version des Kreis-Sequenzierung (Cirseq oder C-Seq fortan) Assay5,16. Dieser Test ermöglicht dem Benutzer, Übertragungsfehler und andere seltene Varianten in der RNA in die Transkriptom-5zu erkennen. Rundschreiben-Sequenzierung Assay trägt diesen Namen, weil ein wichtiger Schritt in diesem Assay dreht sich um RNA Circularization. Sobald die RNA Ziele circularized sind, sind sie reverse transkribiert in einer rollenden Kreis Mode, lineare DNA-Moleküle zu produzieren, die zahlreiche Kopien der gleichen RNA-Vorlage enthalten. Wenn ein Fehler in einer dieser Vorlagen vorhanden war, würde dieser Fehler auch in jeder einzelnen Wiederholung das DNA-Molekül enthaltenen vorhanden sein. Im Gegensatz dazu Fehler eingeführt durch reverse Transkription, PCR-Amplifikation und Sequenzierung neigen dazu, die zufällig entstehen und werden somit in nur ein oder zwei Wiederholungen. Durch Erzeugung einer Konsensussequenz für jedes DNA-Molekül, und zufällige Fehler von allen wiederholt auftretenden Fehler zu unterscheiden, können so effektiv von wahren Übertragungsfehler (Abbildung 1 b) Bibliothek Bau Artefakte getrennt werden.

Richtig eingesetzt, kann C-Seq-Assay verwendet werden, um genau die Rate der Basis Substitutionen, Einfügungen und Löschungen in RNA in das Transkriptom aller Arten zu erfassen (siehe z. B. Traverse und Ochman17). Beispielsweise haben wir die C-Seq-Assay verwendet, um eine einheitliche Basis Abwicklung5 genomweite Messungen der Fehlerquote der Transkription in Saccharomyces Cerevisiae, Drosophila Melanogasterund Caenorhabditis Elegans ermöglichen (unveröffentlichte Beobachtungen). Ursprünglich verwendet, um präzise RNA-Virus Populationen sequenzieren, wurde diese optimierte Version des C-Seq-Assays modernisiert, um zu harte Bedingungen bei der Bibliothek-Vorbereitung zu minimieren, die Bibliothek Bau Artefakte beitragen. Darüber hinaus wird mithilfe einer Anzahl von im Handel erhältlichen Kits der Durchsatz des Assays, sowie die Benutzerfreundlichkeit verbessert. Wenn Sie richtig eingesetzt, kann dieser Assay genau Tausender Übertragungsfehler pro replizieren, dadurch erheblich zu verbessern, auf früheren Studien6erkennen. Insgesamt ist diese Methode bietet ein mächtiges Werkzeug um transkriptioneller Mutagenese studieren und ermöglicht es dem Benutzer, neue Einblicke in die Mechanismen, die die Treue der Transkription in einer Vielzahl von Organismen zu steuern.

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Protokoll

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1. Vorbereitung

  1. RNases sind allgegenwärtig; daher, Reinigen des Arbeitsbereichs durch Besprühen mit einer Dekontamination Reagenz nach unten (z. B., RNase entfernt) und 70 % Ethanol. Spray keine Pipetten, Stifte oder Rohr-Racks, potentielle Fehlerquellen RNase Verunreinigungen zu entfernen.
  2. Um weitere RNases verhindern Kontamination der Proben, tragen Sie einen Kittel oder Langarm T-shirt während der Experimente. Vermeiden Sie den Kontakt zwischen der Handschuhe und der Innenseite der Tube, die verwendet wird, vor allem wenn sie aus einer Box oder Tasche abrufen.
  3. Vor der reversen Transkription ändern Sie Handschuhe häufig.
    Hinweis: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, unterbrochen Sie das Experiment vor der reversen Transkription nicht werden.

2. Zelle und tierische Kultur und Sammlung

  1. Saccharomyces Cerevisiae Wachstum und Sammlung
    1. Ggf. eine C-Seq-Bibliothek aus Hefe ist zunächst impfen Sie eine einzige Kolonie von S. Cerevisiae in 3 mL Medium enthält Hefeextrakt, Adenin und Pepton Traubenzucker (YAPD) zu, und inkubieren Sie es über Nacht bei 30 ° C in einer rollenden Trommel.
    2. Am Morgen wieder impfen Sie die Kultur in 50 mL YAPD Medium um eine optische Dichte (OD) von 0,1 und wachsen Sie die Zellen, bis sie eine OD von 0,5 – 0,7 (~ 7 x 106 Zellen/mL) erreichen.
    3. Sammeln Sie die ganze 50 mL-Kultur (ca. 350 x 106 -Zellen) in einem 50 mL konische Röhrchen und drehen Sie die Zellen nach unten für 3 min bei 2.100 X g. Vorsichtig das YAPD Medium zu entfernen und das Pellet einmal mit 1 X PBS waschen.
    4. Dann, Aufschwemmen Sie das Pellet in 480 µL Lyse Puffer, 48 µL 10 % SDS und 480 µL Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (25:24:1), pH 6,8. Wirbel der Probe bei maximaler Geschwindigkeit für 5 s und übertragen es auf 1,5 mL Schraubverschluss Rohr mit 750 µL eiskalte Zirkonia Perlen (mitgelieferten). Fahren Sie mit Schritt 3 dieses Protokolls für die Zelle Lysis und total RNA-Extraktion.
      Hinweis: Alle für Schritt 2.1.4 erforderlichen Reagenzien sind in der empfohlenen Hefe RNA-Extraktion-Kit ausgestattet. Diese Reagenzien funktionieren genauso gut für die Hefe, Würmer, und fliegt damit nach der Sammlung von der Hefe (Schritt 2.1), Würmer (Schritt 2.2) oder fliegen (Schritt 2.3), ein einheitlicher Ansatz verwendet werden kann, um C-Seq-Bibliotheken (Schritte 3 – 10) zu generieren.
  2. Caenorhabditis Elegans Kultur und Sammlung
    1. Wenn eine C-Seq-Bibliothek aus Worms gewünscht wird, Kaution 30 erwachsenen Würmer auf einem frischen Teller des Nährbodens mit OP50 Bakterien entdeckt.
      Hinweis: Fünf Platten sind ausreichend für 1 replizieren.
    2. Kultur die Würmer für 4 Tage und die Würmer durch sanft waschen die Platten mit 5 mL der M9 Medien sammeln und bündeln die Würmer in ein einzelnes 50 mL konische Röhrchen.
    3. Drehen Sie die Würmer nach unten bei 100 X g für 2 min ein Pellet zu erstellen. Die Zentrifuge mit der niedrigsten Geschwindigkeit möglich, um nicht zu stören, die Pellets zu verlangsamen.
    4. Sanft bewegen Sie die Würmer in einem 1,5 mL-Tube, waschen Sie sie zweimal in 1,5 mL M9 Medien und Zentrifugieren Sie das Rohr bei 100 X g für 1 min um Bakterien zu entfernen und eine saubere 100 µL Pellet von Würmern zu generieren.
    5. Die Würmer in 480 µL Lyse Puffer, 48 µL 10 % SDS und 480 µL Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol aufzuwirbeln. Wirbel der Probe bei maximaler Geschwindigkeit für 5 s und übertragen es auf 1,5 mL Schraubverschluss Rohr mit 750 µL eiskalte Zirkonia Perlen. Fahren Sie mit Schritt 3 dieses Protokolls für die Lyse der Würmer und der gesamten RNA-Extraktion.
  3. Drosophila Melanogaster Kultur und Sammlung
    1. Auf Wunsch eine C-Seq-Bibliothek von Fliegen ist Kultur 20 – 25 fliegen in Fläschchen, die entweder Traubenzucker oder Melasse basierenden Medium enthalten. Aliquoten die fliegen über 3 Fläschchen, so dass jede Durchstechflasche enthält ca. 8 fliegen.
    2. Um die fliegen zu sammeln, legen Sie das Fläschchen in einem Eiskübel, bis die fliegen sediert werden. Dann sammeln sie mit dem Pinsel in einem 1,5 mL-Tube. Sammeln Sie die fliegen nicht durch CO-2 -Behandlung.
    3. Lassen Sie die warme fliegen auf Raumtemperatur (RT), und fügen Sie schnell eine vorgefertigte Mischung aus 500 µL Puffer Lyse, 50 µL 10 % SDS und 500 µL Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol am Rohr. Verwenden Sie eine Micropestle zu Schleifen, die fliegen mit ca. 15 Hübe, begleitet von einer Firma, die Drehbewegung, wenn der Stößel den Boden des Rohres erreicht.
    4. Gießen Sie die Mischung aus fliegen und Lyse Medien in 1,5 mL Schraubverschluss Rohr mit 750 µL eiskalte Zirkonia Perlen und Wirbel es bei maximaler Geschwindigkeit für 5 S. fahren Sie mit Schritt 3 dieses Protokolls für die Lyse von den fliegen und die total RNA-Extraktion.

3. Gesamt-RNS Reinigung

Hinweis: an dieser Stelle alle drei Protokolle konvergieren, und ein einziger, einheitlicher Ansatz kann verwendet werden, um C-Seq-Bibliotheken zu generieren.

  1. Schrauben Sie die Kappe fest auf und befestigen Sie den Schlauch ein Vortexer mit einem Adapter oder Klebeband. Wirbel der Röhre mit maximaler Geschwindigkeit für 10 min in die Proben zu lösen. Zentrifugieren Sie dann die Probe bei 16.100 X g für 5 min, die organische Lösungsmittel aus der wässrigen Phase zu trennen.
  2. Sorgfältig entfernen Sie, 400 – 500 µL der wässrigen Phase ohne störende weiße, trübe Interphase und eine 15 mL konische Röhrchen mit 1,9 mL Bindung Puffer hinzufügen. Mischen Sie sie gründlich durch aufschütteln.
  3. 1,25 mL 100 % Ethanol und Mischen der Probenmaterials durch aufschütteln. Übertragen Sie 700 µL der Probe auf eine Filterpatrone in ein Sammelrohr montiert und spin Probe bei 14.500 X g für 30 S. wiederholen, bis alle der Probe wird durch die Patrone übergeben.
    Hinweis: an dieser Stelle kann die Probe etwas undurchsichtig. Wenn zu viele Zellen, Würmer oder fliegen lysiert wurden, konnte Ausscheidungen angezeigt, die den Filter verstopfen können.
  4. Waschen Sie den Filter einmal mit 700 µL der Waschlösung 1 und zweimal mit 500 µL der Waschlösung 2 oder 3. Beenden Sie die Waschungen durch Drehen der Proben bei 14.500 X g für 2 min, überschüssige Ethanol zu entfernen.
  5. Übertragen der Filterpatrone zu einem 1,5 mL Delphin Schlauch und fügen Sie 108 µL vorgewärmte Elution Lösung (65 ° C).
    Hinweis: Setzen Sie niemals RNA-Proben auf Temperaturen über 65 ° C vor einer reversen Transkription, wie tun also Cytosin zu Uracil Deamination Ereignisse, die unmöglich auslösen wird zu unterscheiden, Übertragungsfehler sind.
  6. Verschlechtern die DNA-Kontaminationen in der isolierten RNA (siehe Schritte 2.1-3.4) durch Zugabe von 11 µL 10 x DNase I-Puffer, 2 µL RNase-Inhibitor und 4 µL DNase I (8 U), und sie bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
  7. Fügen Sie nach der Verdauung 11 µL DNase Inaktivierung Reagenz. Wirbel der Mischung und lassen Sie es bei RT 5 min. Zentrifugieren Sie dann die Probe bei 15.000 X g für 3 min, pellet-Inaktivierung Reagenz und 110 µL des Überstands ohne zu stören das Pellet zu sammeln. Übertragen Sie den überstand auf eine 1,5 mL-Tube.
    Hinweis: DNase Inaktivierung Reagenz kann ziemlich schwierig sein, pipettieren richtig, so überprüfen Sie die PIPETTENSPITZE nach jeder pipettieren Aktion. Wird die Inaktivierung Reagenz zu zähflüssig zu pipettieren, fügen Sie 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) gleich 1/5 der das restliche Volumen hinzu.
  8. (Qualitätskontrolle) Messen Sie die Konzentration der gesamten RNA mit einem Spektralphotometer. Dann 1 µL Gesamt-RNS beiseite und es zu einer Konzentration von 10 ng/µL in Nuklease-frei (NF) Wasser zu verdünnen. Führen Sie die RNA auf eine entsprechende Nukleotid-Analysegerät mit einer hohen Empfindlichkeit RNA Band um sicherzustellen, dass die RNA nicht abgebaut wird und einen Wert von eRIN mindestens 8.5 oder höher (Abb. 2 b hat).

(4) mRNA Bereicherung

  1. Führen Sie die mRNA-Anreicherung mit einer mRNA Miniprep kit (siehe Tabelle der Materialien). Die Probe für ein Gesamtvolumen von 250 µL 140 µL NF Wasser hinzufügen. Fügen Sie 250 µL 2 x Bindung Puffer, durchmischen der Probenmaterials durch aufschütteln und 15 µL Oligo (dT) Perlen hinzufügen.
  2. Mischen der Probenmaterials durch pipettieren es rauf und runter und bei 65 ° C für 2 min inkubieren. Legen Sie dann die Probe bei RT 10 min. lang. Zu guter Letzt Zentrifugieren der Probe bei 16.100 X g für 2 min, pellet-die Perle: mRNA-komplexe.
  3. Den überstand verwerfen und das Pellet in 500 µL der Waschlösung Aufschwemmen. Übertragen Sie die Lösung auf eine Spin-Spalte und drehen Sie es für 1 min bei 15.000 X g. Die Flow-through zu verwerfen Sie und waschen Sie die Probe mit einem zusätzlichen 500 µL Waschlösung. Dann drehen Sie die Probe für 2 min bei 15.000 X g , jede überschüssige Ethanol aus der Spin-Filter zu entfernen.
  4. Spin-Filter auf einem Delphin-Rohr übertragen und erneut das Pellet in der Spalte mit 80 µL vorgewärmte Elution Lösung (65 ° C). Die Probe für 1,5 min bei 65 ° C inkubieren und durch drehen es für 1 min bei 15.000 X geluieren.
  5. Messen Sie die Konzentration des gereinigten RNA mit einem Spektralphotometer oder ähnliches Werkzeug, das für die Quantifizierung der RNA-Konzentration und Qualität ermöglicht.

5. RNase III Fragmentierung und RNA bereinigen

Hinweis: (Wichtig), kreisförmige RNA-Moleküle geeignet zur Erzeugung von C-Seq Bibliotheken vorzubereiten die RNA muss fragmentiert werden, etwa 60 – 80 Basen in Länge. Während bisherige Methoden eine chemische Fragmentierung Fragment RNA verwendet haben, führt chemischer Fragmentierung mit Schwermetallen Schäden in der RNA-Proben, die während der letzten Endes als Übertragungsfehler fehlinterpretiert werden können. Um dieses Problem zu umgehen, setzen Sie stattdessen auf eine Fragmentierung mit RNase III um kleine Fragmente zu erzeugen. Ein weiterer Vorteil dieses enzymatischen Ansatzes ist, dass es kompatibel enden erforderlich für Ligation, vermieden die Notwendigkeit für eine Ende-Reparatur nach chemischer Fragmentierung schafft.

  1. Richten Sie die RNA Fragmentierung Reaktion mit 1 µg der gereinigten RNA, 10 µL Reaktion Puffer, 5 µL RNase III und genügend NF Wasser um das Volumen bis zu 100 µL bringen (siehe Tabelle der Materialien). Fügen Sie zuletzt das Enzym und pipette das Gemisch nach oben und unten mindestens 10 mal um zu mischen. Inkubation der Probe bei 37 ° C für 25 min, die dazu neigt, RNA-Fragmente von ca. 60-80 Basen in der Länge zu produzieren.
  2. Sobald die 25 min Inkubation abgeschlossen ist, die Reaktion sofort mit einer Oligo Aufräumen Aufräumen und Konzentrator kit (siehe Tabelle der Materialien), um jede weitere Verdauung zu verhindern. Fügen Sie 200 µL Puffer Oligo-Bindung auf die Probe mischen durch aufschütteln und 800 µL 100 % Ethanol hinzufügen hinzu. Mischen der Probenmaterials durch aufschütteln und überträgt es auf einer bereitgestellten Spin-Spalte in einem Sammelrohr.
  3. Zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 X g für 30 s und waschen es mit 750 µL Waschpuffer RNase III zu entfernen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 X g für 30 s, verwerfen den Durchfluss und die Probe nochmals mit 750 µL Waschpuffer waschen, wie oben beschrieben. Nach dem zweiten durchströmten wurden verworfen, Zentrifugieren der Spalte bei 15.000 X g für 2 min, überschüssige Ethanol zu entfernen.
  4. Übertragen Sie die Spalte auf eine frische 1,5 mL-Tube und eluieren Sie Probe in 24 µL NF Wasser durch 10.000 x g für 1 min drehen.
  5. Qualitäts-CHECK: Nehmen Sie 2 µL der gereinigten RNA-Fragmente und verdünnen Sie es 2-fach 2 µL NF Wasser hinzufügen. Führen Sie die fragmentierte RNA auf einem Bildschirm Band um sicherzustellen, dass die fragmentierte RNA im Bereich von 50 – 100 Basen in der Länge (Abbildung 2 c).

(6) RNA Circularization und rollenden Kreis reversen Transkription

  1. Um die RNA-Fragmente circularize, Denaturieren Sie Wärme-20 µL der Probe bei 65 ° C für 1 min und legen Sie es sofort für 2 min auf Eis. Dann fügen Sie 4 µL 10 x T4 RNA Ligase Puffer, 4 µL 10 mM ATP, 1 µL RNase-Inhibitor, 1 µL NF Wasser und 8 µL 50 % Polyethylenglykol (PEG).
  2. Durchmischen der Probenmaterials durch Vortexen hinzufügen 2 µL 10 U/µL T4 RNA Ligase I. Mix der Probenmaterials wieder durch pipettieren sie und bei 25 ° C für 2 h in einem Thermocycler mit der Temperatur des Deckels eingestellt bei 30 ° c inkubieren
  3. Nach 2 h die Probe 10 µL NF Wasser hinzu und bereinigen Sie die Probe mit einem Oligo-Aufräum und Konzentration Kit gemäß den Spezifikationen des Herstellers. Eluieren Sie die Probe in 20 µL NF Wasser.
  4. Umkehren der kreisförmigen RNA-Moleküle zu transkribieren, 9 µL RNA 4 µL 10 mM dNTPs, 4 µL 50 ng/µL zufällige Hexamers und 9 µL NF Wasser hinzufügen. Mischen Sie alles gründlich durch pipettieren, Denaturieren Sie die Probe bei 65 ° C für 1 min, und legen Sie ihn auf Eis für 2 min. laden die restlichen RNA als Back-Up.
  5. Fügen Sie 8 µL 5 X erste-Strang Synthese Puffer, 2 µL von 0,1 mM DVB-t und 4 µL 200 U/µL Reverse Transkriptase hinzu und mischen Sie alles durch pipettieren. Inkubation der Probe bei 25 ° C für 10 min, gefolgt von einer 20 min Inkubation bei 42 ° C bei geschlossenem Deckel bei 5 ° C höher als die Inkubationstemperatur festlegen.
    Hinweis: Eine Reverse Transkriptase mit Strang Verschiebung Fähigkeiten muss bei diesem Schritt verwendet werden, um einen rollenden Kreis reversen Transkription zu ermöglichen.
  6. Die Probe 10 µL NF Wasser hinzu und reinigen Sie es mit dem Oligo-Aufräum und Konzentration-Kit entsprechend den Empfehlungen des Herstellers. Eluieren Sie das Beispiel in 42 µL Elution Lösung.
  7. Qualitäts-CHECK: Verdünnen Sie 2 µL-einzelsträngige cDNA in 2 µL NF Wasser zu und führen Sie dieses Beispiels auf einem Nukleotid Analyse-Instrument mit einer hohen Empfindlichkeit RNA Klebeband aus. Wenn die reverse Transkription richtig, eine Bibliothek von cDNA-Molekülen gearbeitet haben, sollte das reichen von etwa 60 – 1.500 Stützpunkten in Länge, sichtbar sein. Im Idealfall ist die meisten cDNA im Bereich von 500-1.000 Basen (Abb. 2d).

7. zweiter Strang cDNA Synthese und Ende Reparatur

  1. Verwenden Sie ein zweites Strang Synthese Kit um eine doppelsträngige cDNA-Bibliothek zu generieren. Legen Sie die Proben auf Eis und 38 µL der Probe fügen Sie 30 µL NF Wasser hinzu. Dann 8 µL 10 x zweiten Strang Puffer und 4 µL der zweite Strang Enzym, und Mischen der Probenmaterials durch sanfte pipettieren vor der Inkubation bei 16 ° C für 2,5 h.
  2. Aufräumen der Proben mit der Oligo Aufräum und Konzentration kit entsprechend den Empfehlungen des Herstellers für 100 µL Reaktionen und eluieren Proben in 38 µL NF Wasser.
  3. Richten Sie die Ende-Reparatur-Reaktion 35,5 µL doppelsträngige cDNA, 6,5 µL Ende reparieren Reaktion Puffer und 3 µL Ende Prep-Enzym-Mix 20 µL NF Wasser hinzufügen. Sorgfältig überprüfen Sie die Reaktion Puffer für weiße Ausscheidungen und lösen sie durch die Hand-Erwärmung, falls vorhanden.
  4. Mischen Sie die Ende-Reparatur-Reaktion durch pipettieren und bei 20 ° C für 30 min, gefolgt von einer zweiten 30 min Inkubation bei 65 ° c inkubieren Stellen Sie die Temperatur des Deckels Thermocycler bei 5 ° C höher als die Inkubationstemperatur.

(8) Adapter Ligation und Größenauswahl an vorbereiteten Bibliotheken

  1. Verwenden Sie einen mehrstufigen bibliothekmodul Vorbereitung für die endgültige Bibliothek Vorbereitungen (siehe Tabelle der Materialien). Erstens die Adapter für Next-Generation Sequenzierung 10-fach verdünnen in 10 mM Tris-HCl, eine Endkonzentration von 1,5 µM. Dann, jede Probe 2,5 µL verdünnter Adapter und 1 µL der Ligatur Enhancer hinzu und mischen sie durch aufschütteln.
  2. Fügen Sie 15 µL Blunt/TA Ligase Master Mix hinzu, mischen Sie es durch pipettieren und bei 20 ° C für 15 min inkubieren. Dann fügen Sie 3 µL Reagenz Enzym Uracil-spezifische Exzision und bei 37 ° C für 15 min inkubieren. Nach Abschluss der Ligatur der Probe für ein Gesamtvolumen von 100 µL 13,5 µL NF Wasser hinzu und fahren Sie mit der Größenauswahl.
    Hinweis: Es empfiehlt sich, Größe-wählen Sie für die cDNA-Moleküle, die im Bereich von 600 – 800 Basen in der Länge sind. Würden die fragmentierte RNA-Moleküle ca. 60 – 80 Basen in Länge, Auswahl für Moleküle, die 600 – 800 Basen in der Länge sind wird sichergestellt, dass die meisten der ausgewählten Moleküle ist ideal für die Weiterverarbeitung mindestens drei tandemwiederholungen enthalten und Analyse.
  3. Wählen Sie für Moleküle, die 600 – 800 bp in der Länge sind, fügen Sie 30 µL resuspendierte magnetische Beads (siehe Tabelle der Materialien), gewöhnt, RT, jede Probe und Mischen von pipettieren hinzu. Übertragen Sie die Probe auf eine 1,5 mL-Tube und inkubieren Sie es bei RT 5 min.
  4. Legen Sie die Probe auf einem Magnetstativ für 5 min, die Perlen von der Überstand zu trennen. Den überstand (enthält die gewünschte cDNA-Moleküle), um eine neue 1,5 mL tube und entsorgen Sie die magnetischen Perlen (die große DNA-Moleküle gebunden sind) zu übertragen.
  5. Jede Proben eine frische Aliquote von 15 µL des magnetischen Beads hinzugefügt werden, durch pipettieren, gründlich mischen und brüten für 5 min bei RT. die Proben auf einem magnetischen Gestell und inkubieren sie 5 min bei RT Dann sorgfältig entfernen Sie und entsorgen Sie die Überstände, und achten Sie nicht auf die Perlen zu stören.
    Hinweis: Entsorgen Sie nicht magnetischen Kügelchen, die jetzt die gewünschte Ziel-cDNA enthalten.
  6. Fügen Sie 200 µL von 80 % Ethanol zu allen Beispielen frisch zubereitet, ohne zu stören die gebeizte magnetische Beads und inkubieren Sie 30 S. verwerfen das Ethanol und waschen Sie die Proben noch einmal mit 80 % Ethanol. Dann vollständig jede Spur von Ethanol aus den Proben zu entfernen und an der Luft Trocknen der Perlen für 5 min aber vorsichtig sein, nicht um die Perlen zu trocknen. Wenn die Perlen übertrocknet werden, wird in den Pellets Risse.
  7. Um die Proben aus den Perlen eluieren, die Rohre aus dem Magnetstativ entfernen und hinzufügen 19 µL 10 mM Tris-HCl. pipettieren und unten mehrmals zu Nukleinsäuretablette die Perlen und die Proben 5 min bei RT inkubieren Wenn die Perlen übertrocknet waren, inkubieren sie für > 10 min.
  8. Setzen Sie die Proben wieder auf die Magnetstativ und inkubieren sie für 5 min, die Perlen von der Überstand zu trennen. Sorgfältig entfernen 15 µL des Überstands mit gereinigtem, Größe ausgewählt cDNA-Bibliotheken aus den Rohren und überträgt es auf eine frische 1,5 mL-Tube.

(9) PCR-Amplifikation und letzte Perle Reinigung

  1. Fügen Sie 5 µL universelle Grundierung und 5 µL eines eindeutigen Index-Primers (siehe Tabelle der Materialien) zu jedem gereinigt cDNA Bibliothek und mischen Sie sie gründlich durch pipettieren. Sorgfältig prüfen Sie die Polymerase-master-Mix für Kristalle und anderen Ausscheidungen, und wärmen Sie den master-Mix von hand zu, bis Ausscheidungen auflösen.
    1. Fügen Sie 25 µL der Polymerase-master-Mix zum Beispiel, mischen sie durch pipettieren und folgen die Radsport Bedingungen unten für die PCR-Amplifikation. Ausführen der ersten Denaturierung bei 98 ° C für 30 s, und führen Sie einem doppelten Schritt PCR-Reaktion von Denaturating dann die Proben bei 98 ° C für 10 s und Glühen/Verlängerung der PCR Produkte bei 65 ° C 75 s (12 X), gefolgt von eine letzte Verlängerung bei 65 ° C für 5 min und eine unbestimmte Hold bei 4 ° C.
  2. Reinigen Sie die endgültige Bibliotheken durch Zugabe von 45 µL resuspendierte magnetische Beads direkt an der PCR-Reaktion, mischen sie durch pipettieren, und inkubieren sie bei RT 5 min Transfer die Probe zu einem 1,5 mL Schlauch und legen Sie sie in einem Magnetstativ. 5 min inkubieren, überstand verwerfen und waschen Sie es zweimal mit frisch zubereiteten 80 % Ethanol für 30 s.
  3. Nach der zweiten Wäsche voll das Ethanol aus der Probe zu entfernen und die Perle Pellet für 5 min an der Luft trocknen und in 35 µL 0.1 X TE eluieren. Aufschwemmen der Perlen von pipettieren sie und inkubieren sie bei RT 5 min. Ort der Probe auf dem magnetischen Stand und nach 5 min, 30 µL des Überstands nach einer frischen 1,5 mL-Tube. Speichern Sie die Bibliotheken bei-80 ° C.
  4. Qualitäts-CHECK: Verdünnen Sie 1 µL der endgültigen Bibliothek in 9 µL NF Wasser und führen Sie das Beispiel auf einem dedizierten DNA Analyse-Instrument mit einem hochempfindlichen Chip; die Mehrheit der cDNA sollte im Bereich von 600 – 800 bp in der Länge (Abb. 2e).
  5. Schicken Sie nach der Elution die Proben für die Sequenzierung auf einem massiv parallelen Sequenzierung Plattform mit 250 bp gepaart Ende liest oder 300 bp Einend-mal gelesen ab.

10. Bio-Informatik Analyse des Kreises Sequenzierung Daten

Hinweis: Analyse und Interpretation von Rohdaten aus der C-Seq-Test erfordert eine eigene Bio-Informatik-Pipeline. Eine schematische Darstellung der Pipeline, die für unsere Analysen verwendet wurde ist in Abbildung 3dargestellt. Diese Pipeline auf https://github.com/LynchLab/MAPGD herunterladen.

  1. Zuerst schneiden Sie die Lesevorgänge zu entfernen-Adapter-Sequenzen und minderwertige Basis Anrufe mit Cutadapt18, mit einer Qualität Schwellenwert von 20.
  2. Identifizieren Sie dann, die Wiederholungen kodiert, indem die Concatemerized-RNA-Molekül mit Hilfe eines geeigneten Algorithmus keine Wiederholungen mit einer Mindestgröße von 30 Nukleotiden zu erkennen und ein Maximum von 2 Diskrepanzen zwischen wiederholt18. Diese Wiederholungen einer Konsensussequenz abgeleitet und verfolgen die Basis Anrufe und zugehörigen Qualitätsfaktoren in jeder Position.
    Hinweis: Da reversen Transkription an beliebiger Stelle auf die circularized RNS-Molekül beginnen kann, den Start einer Wiederholung entspricht nicht unbedingt am 5′-Ende der fragmentierten RNS-Molekül (nachfolgend der Ligatur-Punkt). Dementsprechend wird die Konsensussequenz kontinuierlich gegen die entsprechenden Transkriptom Karte nicht der Identifizierung der Ligatur Punkt erfordert.
  3. Ermittlung den Ligatur Punkt Karte eine Concatemer Konsensussequenz gegen die Referenz Transkriptom mit BLAST-wie Alignment Tool (BLAT)19.
    1. Verketten Sie zwei Instanzen von der Konsensussequenz um sicherzustellen, dass die zugeordnete Sequenz mindestens eine volle ununterbrochene Auftreten der ersten RNA-Fragment-Sequenz enthält. Dann drehen Sie die Konsensussequenz an der vorhergesagten Ligatur Punktposition starten.
  4. Ordnen Sie die gedrehte Konsensus-Sequenzen gegen das Genom mit TopHat20 und verwenden Sie die Achsen alle Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) erkennen, die für Übertragungsfehler verwechselt werden könnte.
  5. Rufen Sie die Übertragungsfehler aus der zugeordneten gedrehte Konsensus-Sequenzen und testen Sie, ob der Kandidat Fehler vier zusätzliche Tests bestehen.
    1. Zunächst sicherstellen Sie, dass ein Transkription Fehler nicht mit einem SNP überlappt (eine typische Anforderung ist, dass mindestens 20 mal gelesen müssen Sie ab einer bestimmten Basis und nicht mehr als 5 % des lautet eine alternative Basis Forderung unterstützen kann).
    2. Zweitens, überprüfen Sie, ob mindestens 3 tandemwiederholungen der Konsensussequenz abgeleitet ist jeweils die gleiche Basenpaar nennt; und drittens, stellen Sie sicher, dass die Summe der Qualitätsfaktor von dieser Position mehr als 100 sein muss.
  6. Überprüfen Sie für eine vierte und letzte, drehen Sie die Konsensussequenz in allen möglichen Kombinationen (Simulation von allen möglichen Positionen des Punktes Ligatur) und ordnen Sie jede Version gegen die Referenz-Genom mit TopHat.
    Hinweis: Wenn eines gedrehten Sequenzen im Genom eine perfekte Übereinstimmung findet, der entsprechende Ligatur Punkt gilt heute als die richtige ist und der Transkription Fehler Anruf abgelehnt werden sollte.

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Ergebnisse

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Wie alle massiv parallelen Sequenzierung Ansätze produziert jedes C-Seq-Experiment eine sperrige, große Datasets. Für Erstanwender kann es schwierig zu handhaben diese Datasets sein; Daher empfiehlt es sich, dass alle Benutzer wenden Sie sich an einen erfahrenen Bio-Informatician vor dem experimentieren. Im Durchschnitt ist die Erwartung, dass Benutzer ca. 55 – 70 Giga Basen (Gbases) pro Durchlauf auf den meisten massiv parallelen Sequenzierung Plattformen generieren werden. Für dieses Pr...

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Diskussion

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Hier beschreiben wir eine optimierte Protokoll für die Vorbereitung der C-Seq-Bibliotheken für den Nachweis von Übertragungsfehler in Saccharomyces Cerevisiae, Drosophila Melanogasterund Caenorhabditis Elegans. Dieses Protokoll hat zahlreiche Vorteile gegenüber bestehenden Protokolle sowie alternative Verfahren.

In den letzten 15 Jahren wurden zahlreiche Reporter-Systeme entwickelt, die auf Luciferase7,8 oder...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Publikation möglich wurde durch die Finanzierung von Grant T32ES019851 (zu C. Fritsch), gewähren, R01AG054641 und AFAR junge Ermittler (M. Vermulst).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
RiboPure RNA-AufreinigungskitThermoFisherAM1926Gesamt-RNA-Aufreinigung
Genelute mRNA-AufreinigungskitSigma-AldrichMRN70-1KTmRNA-Aufreinigung
Nukleasefreies WasserAmbionAM9937Elution und Verdünnung
Ambion RNase IIIThermoFisherAM2290RNA-Fragmentierung
T4 RNA-Ligase 1 (ssRNA Ligase)New England BiolabsM0204SRNA-Zirkularisierung
RibolockThermoFisherEO0381RNase-Inhibitor
SuperScript III Reverse TranskriptaseThermoFisher18080044Reverse Transkription mit Rollkreis
10 mM dNTP-MixThermoFisher18427013Reverse Transkription mit Rollkreis
Zufällige Hexamere (50 ng/µ L)ThermoFisherN8080127Reverse Transkription mit Rollkreis
NEB ZweitstrangsynthesemodulNew England BiolabsE6111SZweitstrangsynthese
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit für IlluminaNew England BiolabsE7370ScDNA-Bibliotheksvorbereitung
NEB Next Index PrimerNEBE7335SMultiplex-PCR-Primer
Oligo Clean & KonzentratorZymo ResearchD4061Aufreinigung von RNA- und DNA-Proben
DynaMag-2 MagnetThermoFisher12321DAufreinigung von magnetischen Beads
AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63881Aufreinigung von magnetischen Beads
Eppendorf 5424 MikrozentrifugeFisherScientific05-403-93Zentrifugation
INCU-Shaker 10 LBenchmark ScientificH1010Zellkultur
T100 ThermocyclerBIO RAD1861096Zyklische Bedingungen bei mittleren bis hohen Temperaturen
PTC-200 ThermocyclerGMI8252-30-0001 Zyklische Bedingungen bei niedrigen Temperaturen
RNase AwayMolecular Bioproducts700S-11Sterilisation
50 mL ZentrifugenröhrchenCorning430290Nukleasefreies
15 mL ZentrifugenröhrchenCorning430052Nukleasefreie
Eppendorf RöhrchenUSA Scientific1615-5500Nukleasefrei
4200 Tapestation SystemAgilentG2991AANukleotidanalysegerät für die Qualitätskontrolle von RNA- und einzelsträngigen DNA-Proben
Hochempfindliches RNA-BildschirmbandAgilent5067-5579Qualitätskontrolle von RNA- und einzelsträngigen DNA-Proben
RNA ScreenTape ProbenpufferAgilent5067-5577Qualitätskontrolle von RNA- und einzelsträngigen DNA-Proben
RNA ScreenTape LadderAgilent5067-5578Qualitätskontrolle von RNA- und einzelsträngigen DNA-Proben
2100 Bioanalysator InstrumentAgilentG2939BAQualitätskontrolle doppelsträngiger DNA Qualitätskontrolle
High Sensitivity DNAKit Agilent5067-4626Qualitätskontrolle für doppelsträngige cDNA-Proben
WasserbadVWR462-0244Inkubation
NanoDrop 2000/2000C SpektralphotometerThermoFisherND-2000CBestimmung der RNA-Konzentration

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
  3. Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
  4. Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532(2014).
  5. Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484(2017).
  6. Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
  7. Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
  8. Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
  9. Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
  10. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
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  13. van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
  14. Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
  15. Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
  16. Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
  17. Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
  18. Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
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  20. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36(2013).
  21. Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
  22. Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).

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Circle Sequencing AssayRNA Polymerase FidelitySaccharomyces cerevisiaeDrosophila melanogasterCaenorhabditis elegansRNA Fragment ZirkularisierungT4 RNA Ligasereverse TranskriptionZweitstrangsyntheseAdapterligationGr enselektion mittels MagnetbeadsPCR AmplifikationLibrary Cleanup

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