Dieses Protokoll bietet Forschern mit einem neuen Tool um die Treue der Transkription in mehrere Modellorganismen zu überwachen.
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Methodenartikel
Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Genaue Transkription ist erforderlich für den treuen Ausdruck der genetischen Information. Überraschend allerdings wenig über die Mechanismen, die die Treue der Transkription zu steuern bekannt ist. Um diese Lücke in den wissenschaftlichen Erkenntnissen optimiert wir vor kurzem die Kreis-Sequenzierung Assay um Übertragungsfehler während das Transkriptom des Saccharomyces Cerevisiae, Drosophila Melanogasterund Caenorhabditis erkennen Elegans. Dieses Protokoll erhalten Forscher mit ein leistungsfähiges neues Tool um die Landschaft der Übertragungsfehler in eukaryontischen Zellen zuzuordnen, so dass die Mechanismen, die die Treue der Transkription Steuern noch nie da gewesenen detailliert aufgeklärt werden können.
Einleitung
Das Genom enthält eine genaue biologische Bauplan des Lebens. Um dieses Konzept richtig zu implementieren, ist es wichtig, dass das Genom mit großer Präzision transkribiert werden. Transkription ist jedoch unwahrscheinlich, fehlerfrei zu sein. Z. B. RNA-Polymerasen sind seit langem bekannt, fehleranfällige in-vitro-1,2, und es wurde kürzlich gezeigt, dass sie Fehler in Vivo begehen sowie3,5,6, besonders bei der Konfrontation mit DNA-Schaden7,8
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Protokoll
1. Vorbereitung
- RNases sind allgegenwärtig; daher, Reinigen des Arbeitsbereichs durch Besprühen mit einer Dekontamination Reagenz nach unten (z. B., RNase entfernt) und 70 % Ethanol. Spray keine Pipetten, Stifte oder Rohr-Racks, potentielle Fehlerquellen RNase Verunreinigungen zu entfernen.
- Um weitere RNases verhindern Kontamination der Proben, tragen Sie einen Kittel oder Langarm T-shirt während der Experimente. Vermeiden Sie den Kontakt zwischen der Handschuhe und der Innenseite der Tube, die verwendet wird, vor allem wenn sie aus einer Box oder Tasche abrufen.
- Vor der reversen Transkription ändern Sie Handsch....
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Ergebnisse
Wie alle massiv parallelen Sequenzierung Ansätze produziert jedes C-Seq-Experiment eine sperrige, große Datasets. Für Erstanwender kann es schwierig zu handhaben diese Datasets sein; Daher empfiehlt es sich, dass alle Benutzer wenden Sie sich an einen erfahrenen Bio-Informatician vor dem experimentieren. Im Durchschnitt ist die Erwartung, dass Benutzer ca. 55 – 70 Giga Basen (Gbases) pro Durchlauf auf den meisten massiv parallelen Sequenzierung Plattformen generieren werden. Für dieses Pr.......
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Diskussion
Hier beschreiben wir eine optimierte Protokoll für die Vorbereitung der C-Seq-Bibliotheken für den Nachweis von Übertragungsfehler in Saccharomyces Cerevisiae, Drosophila Melanogasterund Caenorhabditis Elegans. Dieses Protokoll hat zahlreiche Vorteile gegenüber bestehenden Protokolle sowie alternative Verfahren.
In den letzten 15 Jahren wurden zahlreiche Reporter-Systeme entwickelt, die auf Luciferase7,8 oder.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Publikation möglich wurde durch die Finanzierung von Grant T32ES019851 (zu C. Fritsch), gewähren, R01AG054641 und AFAR junge Ermittler (M. Vermulst).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| RiboPure RNA-Aufreinigungskit | ThermoFisher | AM1926 | Gesamt-RNA-Aufreinigung |
| Genelute mRNA-Aufreinigungskit | Sigma-Aldrich | MRN70-1KT | mRNA-Aufreinigung |
| Nukleasefreies Wasser | Ambion | AM9937 | Elution und Verdünnung |
| Ambion RNase III | ThermoFisher | AM2290 | RNA-Fragmentierung |
| T4 RNA-Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204S | RNA-Zirkularisierung |
| Ribolock | ThermoFisher | EO0381 | RNase-Inhibitor |
| SuperScript III Reverse Transkriptase | ThermoFisher | 18080044 | Reverse Transkription mit Rollkreis |
| 10 mM dNTP-Mix | ThermoFisher | 18427013 | Reverse Transkription mit Rollkreis |
| Zufällige Hexamere (50 ng/µ L) | ThermoFisher | N8080127 | Reverse Transkription mit Rollkreis |
| NEB Zweitstrangsynthesemodul | New England Biolabs | E6111S | Zweitstrangsynthese |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit für Illumina | New England Biolabs | E7370S | cDNA-Bibliotheksvorbereitung |
| NEB Next Index Primer | NEB | E7335S | Multiplex-PCR-Primer |
| Oligo Clean & Konzentrator | Zymo Research | D4061 | Aufreinigung von RNA- und DNA-Proben |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Aufreinigung von magnetischen Beads |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Aufreinigung von magnetischen Beads |
| Eppendorf 5424 Mikrozentrifuge | FisherScientific | 05-403-93 | Zentrifugation |
| INCU-Shaker 10 L | Benchmark Scientific | H1010 | Zellkultur |
| T100 Thermocycler | BIO RAD | 1861096 | Zyklische Bedingungen bei mittleren bis hohen Temperaturen |
| PTC-200 Thermocycler | GMI | 8252-30-0001 | Zyklische Bedingungen bei niedrigen Temperaturen |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 700S-11 | Sterilisation |
| 50 mL Zentrifugenröhrchen | Corning | 430290 | Nukleasefreies |
| 15 mL Zentrifugenröhrchen | Corning | 430052 | Nukleasefreie |
| Eppendorf Röhrchen | USA Scientific | 1615-5500 | Nukleasefrei |
| 4200 Tapestation System | Agilent | G2991AA | Nukleotidanalysegerät für die Qualitätskontrolle von RNA- und einzelsträngigen DNA-Proben |
| Hochempfindliches RNA-Bildschirmband | Agilent | 5067-5579 | Qualitätskontrolle von RNA- und einzelsträngigen DNA-Proben |
| RNA ScreenTape Probenpuffer | Agilent | 5067-5577 | Qualitätskontrolle von RNA- und einzelsträngigen DNA-Proben |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5578 | Qualitätskontrolle von RNA- und einzelsträngigen DNA-Proben |
| 2100 Bioanalysator Instrument | Agilent | G2939BA | Qualitätskontrolle doppelsträngiger DNA Qualitätskontrolle |
| High Sensitivity DNA | Kit Agilent | 5067-4626 | Qualitätskontrolle für doppelsträngige cDNA-Proben |
| Wasserbad | VWR | 462-0244 | Inkubation |
| NanoDrop 2000/2000C Spektralphotometer | ThermoFisher | ND-2000C | Bestimmung der RNA-Konzentration |
Referenzen
- Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
- Walmacq, C., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
