Methodenartikel

Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten

DOI:

10.3791/57731

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13. September 2018

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1Center for Mitochondrial and Epigenomic Medicine, Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Cellular and Molecular Biology, University of Pennsylvania, 3Department of Biological Sciences, Mississippi State University, 4Center for Mechanisms of Evolution, Biodesign Institute, Arizona State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll bietet Forschern mit einem neuen Tool um die Treue der Transkription in mehrere Modellorganismen zu überwachen.

Zusammenfassung

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Genaue Transkription ist erforderlich für den treuen Ausdruck der genetischen Information. Überraschend allerdings wenig über die Mechanismen, die die Treue der Transkription zu steuern bekannt ist. Um diese Lücke in den wissenschaftlichen Erkenntnissen optimiert wir vor kurzem die Kreis-Sequenzierung Assay um Übertragungsfehler während das Transkriptom des Saccharomyces Cerevisiae, Drosophila Melanogasterund Caenorhabditis erkennen Elegans. Dieses Protokoll erhalten Forscher mit ein leistungsfähiges neues Tool um die Landschaft der Übertragungsfehler in eukaryontischen Zellen zuzuordnen, so dass die Mechanismen, die die Treue der Transkription Steuern noch nie da gewesenen detailliert aufgeklärt werden können.

Einleitung

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Das Genom enthält eine genaue biologische Bauplan des Lebens. Um dieses Konzept richtig zu implementieren, ist es wichtig, dass das Genom mit großer Präzision transkribiert werden. Transkription ist jedoch unwahrscheinlich, fehlerfrei zu sein. Z. B. RNA-Polymerasen sind seit langem bekannt, fehleranfällige in-vitro-1,2, und es wurde kürzlich gezeigt, dass sie Fehler in Vivo begehen sowie3,5,6, besonders bei der Konfrontation mit DNA-Schaden7,8

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Protokoll

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1. Vorbereitung

  1. RNases sind allgegenwärtig; daher, Reinigen des Arbeitsbereichs durch Besprühen mit einer Dekontamination Reagenz nach unten (z. B., RNase entfernt) und 70 % Ethanol. Spray keine Pipetten, Stifte oder Rohr-Racks, potentielle Fehlerquellen RNase Verunreinigungen zu entfernen.
  2. Um weitere RNases verhindern Kontamination der Proben, tragen Sie einen Kittel oder Langarm T-shirt während der Experimente. Vermeiden Sie den Kontakt zwischen der Handschuhe und der Innenseite der Tube, die verwendet wird, vor allem wenn sie aus einer Box oder Tasche abrufen.
  3. Vor der reversen Transkription ändern Sie Handsch....

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Ergebnisse

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Wie alle massiv parallelen Sequenzierung Ansätze produziert jedes C-Seq-Experiment eine sperrige, große Datasets. Für Erstanwender kann es schwierig zu handhaben diese Datasets sein; Daher empfiehlt es sich, dass alle Benutzer wenden Sie sich an einen erfahrenen Bio-Informatician vor dem experimentieren. Im Durchschnitt ist die Erwartung, dass Benutzer ca. 55 – 70 Giga Basen (Gbases) pro Durchlauf auf den meisten massiv parallelen Sequenzierung Plattformen generieren werden. Für dieses Pr.......

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Diskussion

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Hier beschreiben wir eine optimierte Protokoll für die Vorbereitung der C-Seq-Bibliotheken für den Nachweis von Übertragungsfehler in Saccharomyces Cerevisiae, Drosophila Melanogasterund Caenorhabditis Elegans. Dieses Protokoll hat zahlreiche Vorteile gegenüber bestehenden Protokolle sowie alternative Verfahren.

In den letzten 15 Jahren wurden zahlreiche Reporter-Systeme entwickelt, die auf Luciferase7,8 oder.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Publikation möglich wurde durch die Finanzierung von Grant T32ES019851 (zu C. Fritsch), gewähren, R01AG054641 und AFAR junge Ermittler (M. Vermulst).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
RiboPure RNA-AufreinigungskitThermoFisherAM1926Gesamt-RNA-Aufreinigung
Genelute mRNA-AufreinigungskitSigma-AldrichMRN70-1KTmRNA-Aufreinigung
Nukleasefreies WasserAmbionAM9937Elution und Verdünnung
Ambion RNase IIIThermoFisherAM2290RNA-Fragmentierung
T4 RNA-Ligase 1 (ssRNA Ligase)New England BiolabsM0204SRNA-Zirkularisierung
RibolockThermoFisherEO0381RNase-Inhibitor
SuperScript III Reverse TranskriptaseThermoFisher18080044Reverse Transkription mit Rollkreis
10 mM dNTP-MixThermoFisher18427013Reverse Transkription mit Rollkreis
Zufällige Hexamere (50 ng/µ L)ThermoFisherN8080127Reverse Transkription mit Rollkreis
NEB ZweitstrangsynthesemodulNew England BiolabsE6111SZweitstrangsynthese
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit für IlluminaNew England BiolabsE7370ScDNA-Bibliotheksvorbereitung
NEB Next Index PrimerNEBE7335SMultiplex-PCR-Primer
Oligo Clean & KonzentratorZymo ResearchD4061Aufreinigung von RNA- und DNA-Proben
DynaMag-2 MagnetThermoFisher12321DAufreinigung von magnetischen Beads
AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63881Aufreinigung von magnetischen Beads
Eppendorf 5424 MikrozentrifugeFisherScientific05-403-93Zentrifugation
INCU-Shaker 10 LBenchmark ScientificH1010Zellkultur
T100 ThermocyclerBIO RAD1861096Zyklische Bedingungen bei mittleren bis hohen Temperaturen
PTC-200 ThermocyclerGMI8252-30-0001 Zyklische Bedingungen bei niedrigen Temperaturen
RNase AwayMolecular Bioproducts700S-11Sterilisation
50 mL ZentrifugenröhrchenCorning430290Nukleasefreies
15 mL ZentrifugenröhrchenCorning430052Nukleasefreie
Eppendorf RöhrchenUSA Scientific1615-5500Nukleasefrei
4200 Tapestation SystemAgilentG2991AANukleotidanalysegerät für die Qualitätskontrolle von RNA- und einzelsträngigen DNA-Proben
Hochempfindliches RNA-BildschirmbandAgilent5067-5579Qualitätskontrolle von RNA- und einzelsträngigen DNA-Proben
RNA ScreenTape ProbenpufferAgilent5067-5577Qualitätskontrolle von RNA- und einzelsträngigen DNA-Proben
RNA ScreenTape LadderAgilent5067-5578Qualitätskontrolle von RNA- und einzelsträngigen DNA-Proben
2100 Bioanalysator InstrumentAgilentG2939BAQualitätskontrolle doppelsträngiger DNA Qualitätskontrolle
High Sensitivity DNAKit Agilent5067-4626Qualitätskontrolle für doppelsträngige cDNA-Proben
WasserbadVWR462-0244Inkubation
NanoDrop 2000/2000C SpektralphotometerThermoFisherND-2000CBestimmung der RNA-Konzentration

Referenzen

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  1. Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
  2. Walmacq, C., et al.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

Circle Sequencing AssayRNA Polymerase FidelitySaccharomyces cerevisiaeDrosophila melanogasterCaenorhabditis elegansRNA Fragment ZirkularisierungT4 RNA Ligasereverse TranskriptionZweitstrangsyntheseAdapterligationGr enselektion mittels MagnetbeadsPCR AmplifikationLibrary Cleanup

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