Bewertung der Rolle der mitochondrialen Funktion in krebsbedingte Fatigue

Summary

Unser Ziel war es, eine praktische Protokoll zur Bewertung der mitochondrialen Dysfunktion mit Müdigkeit bei Krebspatienten zu entwickeln. Dieses innovative Protokoll ist für die klinische Anwendung mit nur standard Aderlass und grundlegende Laborverfahren optimiert.

Abstract

Müdigkeit ist eine gemeinsame und schwächenden Erkrankung, die meisten Krebspatienten betroffen. Bisher testen Müdigkeit bleibt schlecht gekennzeichnet mit keine Diagnose Objektiv messen die Schwere dieser Erkrankung. Hier beschreiben wir eine optimierte Methode zur Beurteilung der Funktion der Mitochondrien der PBMCs von ermüdeten Krebspatienten gesammelt. Mit einem kompakten extrazelluläre Flux System und sequentielle Einspritzung der Atemwege Inhibitoren, untersuchten wir PBMC mitochondriale funktionellen Status durch Messung des basalen mitochondriale Atmung, Atemwege Kapazitätsreserven und Energie Phänotyp, der beschreibt die bevorzugte Energiepfad, auf stress zu reagieren. Frische PBMCs sind leicht zugänglich in der klinischen Einstellung mit standard Aderlass. Der gesamte Test beschrieben in diesem Protokoll kann in weniger als 4 Stunden ohne die Einbeziehung der komplexen biochemischen Techniken erfolgen. Darüber hinaus beschreiben wir eine Normalisierung Methode, die für den Erhalt reproduzierbare Daten notwendig ist. Vorgestellten einfachen Verfahren und Normalisierung Methoden ermöglichen wiederholte Probenentnahme aus dem gleichen Patienten und Generierung von reproduzierbaren Daten, die zwischen den Zeitpunkten auszuwertende potenzielle behandlungseffekte verglichen werden können.

Introduction

Müdigkeit ist eine weit verbreitet und bedrückende Bedingung, die eine negative Auswirkung auf die Lebensqualität von Krebs Patienten¹hat. Zu diesem Zeitpunkt Krebs Müdigkeit bleibt schlecht definiert und verlässt sich nur auf subjektive Berichterstattung durch die Patienten². Daher ist dringend notwendig, eine leicht anpassbar diagnostische Labortest zur Charakterisierung von Müdigkeit in der klinischen Einstellung^3,4Objektiv zu identifizieren.

Mehrere zugrunde liegende Mechanismen, einschließlich der Dysfunktion der Mitochondrien, sind vorgeschlagen worden, um Müdigkeit⁵verursachen. Mitochondrien sind die Kraftpaket Organellen, Bereitstellung von 95 % der zellulären Energiebedarf über Oxidative Phosphorylierung und spielen eine wichtige Rolle im Kalzium-Signalisierung, Apoptose, immun-Signalisierung und Regulierung von anderen intrazellulären Signal Veranstaltungen⁶ . Dementsprechend können zu Müdigkeit beeinträchtigt mitochondriale Bioenergetik und Mängel in der Energieerzeugung beitragen. Diese Hypothese zu unterstützen, haben frühere Studien Mutationen in der mitochondrialen DNA bei Patienten mit chronischen Ermüdung-Syndrom⁷beobachtet. Während es unklar bleibt, ob der pathophysiologische Ursprung der Müdigkeit liegt innerhalb des zentralen Nervensystems oder der peripheren Geweben, z. B. Skelettmuskulatur^8,9, gibt es derzeit keine direkte Methode zum einschätzen mitochondriale Dysfunktion im Zusammenhang mit Müdigkeit in live, atmenden Zellen.

Mit peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) Funktion der Mitochondrien zu studieren, bietet mehrere Vorteile. Erstens PBMCs sind leicht zugänglich in der klinischen Einstellung mit standard Aderlass und können schnell mit grundlegende Labortechniken isoliert werden. Blutentnahme ist weniger invasiv als andere Gewebe wie ein Muskelbiopsie zu sammeln. So können Blutproben vom selben Patienten wiederholt im Laufe der Zeit gesammelt werden die longitudinalen Beurteilung der behandlungseffekte erleichtert. Interessanterweise schien mitochondriale Funktion in PBMCs mit Niere mitochondriale Status in einem Tiermodell¹⁰gut korreliert werden. Darüber hinaus wurden Immunzelle Mitochondrien als Proxy für systemische Veränderungen unter verschiedenen Krankheiten Bedingungen^11,12verwendet. Mitochondrien in zirkulierenden Immunzellen sind besonders empfindlich auf Veränderungen der Immunfunktionen und immun Signalmoleküle wie Zytokine^13,14,15. Zum Beispiel wurde beobachtet, dass PBMCs von Patienten mit akuten entzündlichen Rheumaerkrankungen hohe Ausgangswert Sauerstoff Verbrauch¹⁴aufweisen. Im Gegensatz dazu reduzierte Sauerstoffverbrauch in PBMCs von Patienten mit systemischen entzündlichen Erkrankungen einschließlich Sepsis¹⁶isoliert. Unter entzündlichen Erkrankungen können freie Radikale produziert von dysfunktionalen Mitochondrien erhöhten oxidativen Stress und längerer Entzündung¹⁷fördern. Die zentrale Rolle der Mitochondrien in der Energieerzeugung als auch oxidativen Stress schlägt den potenziellen Nutzen der mitochondrialen Funktion als Proxy für das Studium Müdigkeit bei Krebs Patienten ¹³.

Frühere Studien, die Funktion der Mitochondrien verwendet, biochemischen Techniken, mögliche Messung Mitochondrien-Membran oder Isolierung von bestimmten Zell-Populationen, die möglicherweise nicht bereitwillig anpassungsfähig in der klinischen Einstellung^{5, 14,18}. In den letzten Jahren die Entwicklung von extrazellulären Flussmittel Assays hat konnten Forscher leicht und genau untersuchen Änderungen in Sauerstoff-Verbrauch (OCR) in Reaktion auf automatisierte Injektionen von Atmungs-Hemmer^{19,20 , 21 , 22}. jedoch die meisten dieser Studien eignen sich für bestimmte Zelltypen und das große Hochdurchsatz-Format möglicherweise nicht anwendbar in einem klinischen Umfeld. In diesem Manuskript beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für die Prüfung der Funktion der Mitochondrien für die klinische Anwendung.

Protocol

Die aktuelle Studie (NCT00852111) wurde durch die institutionelle Review Board (IRB) des National Institute of Health (NIH), Bethesda, Maryland genehmigt. Teilnehmer an dieser Studie eingeschrieben waren euthymischen Männer, die 18 Jahre oder älter, wer nicht-metastatischem Prostatakrebs mit oder ohne vorherige Prostatektomie diagnostiziert wurden und wurden geplant, um externen Strahl Strahlentherapie (EBRT) erhalten. Potentielle Teilnehmer ausgeschlossen waren, hätten sie eine fortschreitende Krankheit, die erhebliche Müdigkeit verursachen können psychiatrische Erkrankungen innerhalb der letzten fünf Jahre, hatte unkorrigierte Hypothyreose oder Anämie, oder hatte eine zweite Malignität. Personen, die Sedativa, Steroide oder nicht-steroidalen Entzündungshemmern verwendet wurden ebenfalls ausgeschlossen. Gesunden Blutproben wurden am NIH-Abteilung der Transfusionsmedizin von gesunden Spendern unter ein IRB genehmigten Protokoll (NCT00001846) erhalten. Alle Teilnehmer werden am Magnuson Clinical Research Center an der NIH rekrutiert. Unterschriebene schriftliche informierte Einwilligungen wurden vor der Teilnahme an der Studie erhalten.

1. mitochondriale Funktion Messung Vorbereitung (1. Tag des Experiments)

1. Sensorkassette-Hydrat (siehe Tabelle der Materialien; ungefähre Dauer: 5 min).
   1. Nehmen Sie Sensorkassette aus Verpackung. Fügen Sie 200 μL Kalibrator Lösung in jede Vertiefung der Dienstprogramm-Platte, dann füllen Sie jede Wassergraben mit 400 μl Kalibrator Lösung.
   2. Die Utility-Platte, die nun Kalibrator Lösung aufweist zurückzukehren Sie Sensorplatte. Hydrat die Patrone in einem Inkubator-CO₂ 37 ° C über Nacht.
      Hinweis: Sensorkassette muss für ein Minimum von 4 h und maximal 72 h hydratisiert werden.

2. klinische Probenvorbereitung (Tag 2 des Experiments)

1. Messen Sie mit dem 13-Element Bewertung der chronischen Krankheit Funktionstherapie - Müdigkeit (FACIT-F)^2,23,24 bei Baseline (vor EBRT Einleitung), Mittelpunkt und Vollendung des EBRT und 1 Jahr Post-EBRT Müdigkeit.
   1. Verwenden Sie einen 0 - 4 Maßstab für jedes Element Reaktion, wobei 0 für "überhaupt nicht" und ein 4 weist darauf hin, dass der Beschwerdegegner bezieht sich auf die zugehörige Anweisung "sehr viel." Gesamtnoten sollte zwischen 16-53, mit niedrigeren Punktzahlen spiegelt hohe Müdigkeit Intensität liegen.
   2. Definieren Sie Müdigkeit als ein FACIT-F-Wert niedriger als 43, mit einem FACIT-F-Score von ≥43, fehlender oder nicht klinisch bedeutsamen Müdigkeit²angibt.
      Hinweis: Ein FACIT-F-Wert von 43 besten teilt Müdigkeit Resultate von Krebs-Patienten und die allgemeine Bevölkerung².
   3. Umfassen die folgenden 13 Artikel in der FACIT-Müdigkeit-Skala: 1) ich fühle mich müde; (2) Ich fühle mich ganz schwach; (3) Ich fühle mich lustlos, ("ausgewaschen"); (4) Ich fühle mich müde; (5) Ich habe Probleme beim Starten Dinge, weil ich müde bin; (6) Ich habe Probleme, die Dinge zu beenden, weil ich müde bin; (7) Ich habe Energie; (8) Ich bin in der Lage, meine üblichen Tätigkeiten zu tun; (9) ich müssen tagsüber schlafen. (10) Ich bin zu müde, um zu essen; (11) Ich brauche Hilfe meine üblichen Aktivitäten; (12) Ich bin frustriert zu tun, was ich tun möchte, zu müde; und 13) ich habe meine sozialen Tätigkeit zu begrenzen, weil ich müde bin.
2. PBMC aus frisch gesammelten Blutproben zu isolieren (Dauer: 1 h).
   1. Sammeln Sie 8 mL Blut in eine mononukleären Zellen Vorbereitung Rohr (siehe Tabelle der Materialien).
      Hinweis: Blutproben sollten innerhalb von 2 h Kollektion verarbeitet werden. Die Qualität der PBMCs möglicherweise gefährdet, wenn Blutproben mehr als 2 h nach Musterkollektion verarbeitet werden.
   2. Zentrifugieren Sie bei 1.750 x g für 30 min bei Raumtemperatur (18-25 ° C). Übertragen Sie die trübe Schicht auf eine 15 mL konische Rohr. Fügen Sie bis zu 15 mL PBS und invertieren Sie 5 Mal zu.
   3. Zentrifugieren Sie bei 300 X g für 15 Minuten bei 4 ° C. Sorgfältig entfernen und entsorgen des Überstands ohne störende Pellet. Wieder aussetzen der Pellets durch Zugabe von bis zu 10 mL PBS, und 5 Mal zu invertieren.
   4. Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie Flüssigkeit überstand und auszusetzen Sie Zellen in 1 mL PBS wieder. Die PBMCs auf einem 1,5 mL Microfuge Rohr übertragen.
   5. Bei 610 X g für 10 Minuten zentrifugieren. Sorgfältig entfernen überstand und Aufschwemmen Pellet komplette RPMI-1640 (RPMI-1640 ergänzt mit 10 % FBS, 10 mM Penicillin/Streptomycin).
3. Beschichten Zellplatten für nicht-anhaftende Zellen (Dauer: 30 min).
   1. Zell- und klebelösung vorzubereiten (siehe Tabelle der Materialien) durch eine Verdünnung der Stammlösung 0,1 M Natriumbicarbonat pH 8.0. Die Arbeitslösung sollte 3,5 µg/cm² Fläche.
      Hinweis: Diese Lösung enthält Polyphenolen Proteine aus der marine Miesmuschel Mytilus Edulisgewonnen. Diese Proteine sind wichtige Komponenten des Klebers abgesondert von der Muschel, selbst auf Oberflächen zu verankern. Wir finden, dass Cell-Tak am besten mit PBMCs funktioniert.
   2. Jedes gut 100 μL der verdünnten Klebstoff-Lösung hinzu und mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie dreimal mit VE-Wasser und Luft trocknen.

3. die mitochondriale Funktion Messung

1. Vorbereitung der Assay-Medien (Dauer: 10 min).
   Hinweis: Assay Medien müssen am Tag des Experiments frisch zubereitet werden.
   1. Hinzufügen von L-Glutamin, Pyruvat und Glukose Base-Medien (die gleichen Bestandteile wie Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM), aber ohne Natrium Bikarbonat, Glukose, Glutamin oder Natrium Pyruvat) Assay Medien machen. Medien Aufwärmen auf 37 ° C, dann pH auf 7,4 einstellen.
      Hinweis: Konzentrationen von L-Glutamin, Pyruvat und Glukose sind in der Regel identisch mit Konzentrationen in normales Wachstumsmedien, aber anhand der Assay ist einstellbar.
2. Der Mito Stresstest PBMCs vorbereiten (Dauer: 2 h).
   1. Platte genug PBMCs aus Schritt2 in jede Vertiefung, 80-90 % Konfluenz zu erreichen. Nach unserer Erfahrung hat 1,5 x 10⁵ Zellen/Well die konstantesten Ergebnisse ergeben.
      Hinweis: Wells A und H sind Hintergrund Brunnen und sollte nur Assay Medien mit keine Zellen enthalten. In Brunnen B bis G empfehlen wir die Beschichtung mindestens 3-6 Brunnen pro Patientenprobe um Ausreißer Rechnung zu tragen.
   2. Spin-down Platten 200 X g für 2 min damit Zellen an der Unterseite der Brunnen zu halten. Waschen Sie die Zellen einmal mit Assay Medien. Dieser Schritt entfernt das Wachstumsmedium Serum und Natriumbicarbonat.
      Hinweis: Nach unserer Erfahrung die Waschschritt entfernt in der Regel 20-30 % der Zellen.
   3. Hinzufügen von 180 μL Assay Medien in jedem Brunnen, einschließlich Hintergrund Brunnen A und H. Inkubation in einem nicht-CO₂ -37 ° C-Inkubator für 45-60 min.
3. Läuft die Mito-Stress-Test
   1. Rekonstruieren Sie Drogen im Mito Stress Kit mit Assay Medien wie folgt:
      1. Oligomycin: Fügen Sie 252 μL Assay Medien in das Fläschchen, eine Stammlösung auf 50 μM zu generieren hinzu.
      2. FCCP: Fügen Sie 288 μL der Assay-Medien in das Fläschchen eine Stammlösung auf 50 μM zu erzeugen.
      3. Antimycin A / Rotenone: Fügen Sie 216 μL der Assay-Medien in die Flasche, eine Stammlösung auf 25 μM zu generieren.
   2. Wirbel wieder ca. 1 Minute lang Drogen hergestellt. Verdünnen Sie in funktionierende Lösungen.
      Hinweis: Sollten Konzentrationen von der gebrauchslösungen titriert und vor dem Experiment je nach Zelltyp im Vorhinein festgelegt. Für PBMCs, finden wir, dass 1 μM Oligomycin, 1 μM FCCP und 0,5 μM Antimycin A / Rotenone arbeiten die besten.
   3. Pipette die Drogen in jedem Hafen in der sensorkassette nacheinander:
      1. Anschluss A: Pipette 20 μL von 10 μM Oligomycin für eine Endkonzentration in jede Vertiefung von 1 μM.
      2. Port B: Pipette 22 μL von 10 μM FCCP, für eine Endkonzentration in jede Vertiefung von 1 μM.
      3. Port C: Pipette 25 μL von 5 μM Antimycin A / Rotenon für eine Endkonzentration in jede Vertiefung von 0,5 μM.
4. Wählen Sie "Mito-Stress-Test" auf einem extrazellulären Flux-Instrument. Folgen Sie Eingabeaufforderung, Instrument und legen Sie die Sensor-Patrone. Das Gerät wird automatisch Sensorkalibrierung durchführen. Setzen Sie die Zellplatte, nachdem Sensorkalibrierung und das Instrument den Rest des Tests zu beenden. Sauerstoff-Dynamik ist gemessen am 530 nm (Anregung) / 650nm (Emission), und Proton-Konzentration gemessen bei 470 nm (Anregung) / 530 nm (Emission).

(4) Normalisierung der Funktion der Mitochondrien Daten

1. Bereiten Sie Cell Proliferation Assay-Lösung (Dauer: 5 min).
   1. 11,7 mL PBS 48 μL Nukleinsäure-Fleck (500 X) und 240 μL Hintergrund Suppressor hinzufügen (2 X). Der Nukleinsäure-Fleck ist eine Zelle-permeationsfähigen DNA-Bindung-Farbstoff, und die Hintergrund-Suppressor ist eine Maskierung Farbstoff, der abgestorbenen Zellen oder Zellen mit kompromittierten Zellmembran Integrität von gebeizt wird blockiert. Die Kombination aus der DNA-Bindung-Farbstoff und die Hintergrund-Suppressor sorgt dafür, dass nur lebende Zellen gefärbt sind.
   2. Fügen Sie gleiches Volumen von 2 x Arbeitslösung (180 μL hinzu) nach der Mito-Stress-Test abgeschlossen wurde direkt in das Medium in jede Vertiefung.
2. Inkubieren Sie die Zellen in Anwesenheit von Zelle Verbreitung Assay Lösung in einem Inkubator 37 ° C für 45-60 min. Quantify die Anzahl von lebenden Zellen (fluoreszierend) auf eine Platte Leser bei 508 nm (Anregung) / 527 nm (Emission) und OCR-Daten zu normalisieren (Dauer: 10 min) .
   Hinweis: Zusätzlich zu der Nummer lebenden Zellen, Benutzer können auch ihre Daten mit der Gesamtzahl der Zellen, Höhe der Nukleinsäure, proteinkonzentrationen usw.zu normalisieren.

Results

Die Mito-Stress-Test beruht auf Messung der Sauerstoff-Verbrauch (OCR) nach sequentielle Einspritzung von verschiedenen Atemwege Inhibitoren ein vollständiges mitochondriale Profil zuordnen. OCR-Messungen nach jeder Injektion von Drogen verwendet werden kann, um die folgenden Parameter zu berechnen im Zusammenhang mit mitochondrialen Gesundheit: Basale OCR bemisst sich zunächst vor jeder Injektion von Drogen Sauerstoffverbrauch musste erfüllen ruht auf ATP-Bedarf einzusch...

Discussion

Fatigue bei Krebspatienten ist ein lähmenden Zustand, ist nicht klar definiert oder¹gekennzeichnet. Diagnose von Müdigkeit setzt ganz auf subjektive Berichterstattung und gibt es keine aktuellen diagnostischen Standard oder Behandlung für diese Bedingung, vor allem auf einen Mangel an Verständnis in Pathobiologie². Beeinträchtigung der Funktion der Mitochondrien ist die vorgeschlagenen Mechanismen, Müdigkeit bei Krebspatienten einer der am meisten therapeutisch Aktionsleist...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CPT Mononukleäre Zellen Vorbereitungsröhrchen	BD Biosciences	362761	Zur Isolierung von PBMCs nach Phlebotomie
RPMI-1640	Corning	10-040	Zur Herstellung von Wachstumsmedien für PBMCs
Fötales Rinderserum (FBS)	Corning	35-010-CV	Zur Herstellung von Wachstumsmedien für PBMCs
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher	15140122	Zur Herstellung von Wachstumsmedien für PBMCs
Cell-Tak	Corning	354240	- und Gewebehaftlösung; ermöglicht das Anhaften von Suspensionszellen an der Oberfläche
Seahorse XF Calibrant Solution	Agilent	103059-000	Zur Befeuchtung von Kartuschen
XFp Fluxpak (Miniplatten und Sensorpatronen)	Agilent	103022-100	Enthält XFp Zellkultur-Miniplatten und Sensorpatronen
XF Basismedium	Agilent	103335-100	Zur Herstellung von XF-Assay-Medien
45% Zellkultur D-(+)-Glukoselösung	Corning	25-037-CI	Zur Herstellung von XF Testmedium
Natriumpyruvatlösung	Corning	25-000-CI	Zur Herstellung von XF-Assay-Medien
L-Glutamin-Lösung	ThermoFisher	25030081	Zur Herstellung von XF-Assay-Medien
Seahorse XFp Mito Stresstest-Kit	Agilent	103010-100	Enthält Oligomycin, FCCP, Antimycin A/Rotenon
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay	ThermoFisher	C35011	Zur Quantifizierung lebender Zellen und zur Datennormalisierung
Seahorse XFp Analyzer	Agilent	S7802AEA	Zur Messung der mitochondrialen Funktion in lebenden Zellen
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (oder jedes andere Instrument, das fluoreszierende Zellen in einer Platte quantifizieren kann)	BioTek	BTCYT5PV	Zur Quantifizierung von lebenden Zellen und zur Datennormalisierung