Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine einfache zelluläre Fraktionierung für die subzelluläre Trennung der zytoplasmatischen und nukleare Proteine im menschlichen frisch- und Gefrierfleisch intestinalen Biopsien durchführen.
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Methodenartikel
Subzellulären Fraktionierung von frischen und gefrorenen Magen-Darm-Proben
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Dieses Protokoll soll menschliche Darmgewebe erhalten durch Endoskopie in Kern- und zytoplasmatischen Fächer für die Lokalisierung Analyse spezifischer Proteine oder Proteinkomplexe in verschiedene Gewebe Staaten (z. B. gesunde fraktionieren vs. Krankheit). Diese Methode ist nützlich für die Fraktionierung von beiden frischen und gefrorenen Darm Gewebeproben; Es ist leicht zugänglich für alle Laboratorien und nicht zeitaufwendig.
Einleitung
Proteine an nahezu alle biologischen Funktionen innerhalb einer Zelle und Abweichungen in Struktur, Menge oder Lage zu einem pathogenen Szenario führen kann. Fraktionierung Beispielmethoden Gewebe sind ein sinnvoller Ansatz zur Verringerung der Komplexität der Krankheit im Zusammenhang mit Protein-Analysen. Einige Studien Protein Lokalisierung Informationen verwenden oder ein Protein aus einem spezifischen zellulären Fach zu bereichern, so ein Protokoll für reproduzierbare Fraktionierung von intakten Proteinen sinnvoll, bestimmte biologische Fragen zu beantworten. Bestimmung der subzellulären Lokalisierung von Proteinen und Überwachung ihrer Substruktur Umverteilung o....
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Protokoll
Diese Studie wurde vom Cruces University Hospital Ethics Board genehmigt und Analysen wurden durchgeführt, nach Einwilligung aus allen Fächern bzw. deren Eltern.
1. Biopsie Sammlung
Hinweis: Gewebeproben aus der distalen Zwölffingerdarm des Patienten während der Routinediagnostik Endoskopie Verwaltung Biopsien dieses Bereichs zwischen 2 und 10 mg Gewicht erhalten. Biopsiert Gewebe ist ein komplexes Gewebe bestehend aus verschiedenen Zelltypen, einschließlich der epitheliale, Immun- und endotheliale Zellen. Klinischen Gastroenterologen durchführen der Endoskopie folgenden klinischen Leitlinien.
- Ort der B....
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Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt eine Hämatoxylin-Eosin Färbung eines intestinale Biopsie-Sektion mit intakten Zotten und Krypta Strukturen.
Repräsentative Ergebnisse der nuklearen und zytoplasmatischen Fraktionierung unter Verwendung dieses Protokolls sind in den Abbildungen 2 und 3gezeigt. Im Experiment gezeigt in Abbildung 2, ein frisches (Fh) und .......
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Diskussion
Das hier beschriebene Protokoll wird für die Kern- und zytoplasmatischen Fraktionierung von intestinalen Biopsien verwendet. Der gereinigten Proteine sind nicht denaturiert und kann verwendet werden, nicht nur in der western-Blot Analyse wie in Abbildung 2 und 3 , aber auch in Tests erfordern Native gefaltete Proteine wie Immunopräzipitation, elektrophoretische Mobilität Verschiebung Assay (EMSA) dargestellt oder Native Polyacrylamid Gelelektrophorese (PAGE).
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Autoren erkennen die Hilfe von Ander Lopez und Miren Telletxea für video aufnehmen und bearbeiten. ACR ist von einer Ikerbasque Gemeinschaft und ein Forschungsprojekt von Asociación de Celiacos Madrid (ACM) finanziert. JRB wird finanziert durch Projekt ISCIII-PI16/00258 und kofinanziert von der Europäischen Union EFRE/ESF "A Way to Europa machen". IST ein Projekt Forschungsstipendium 2015111068 der baskischen Gesundheitsministerium finanziert. IRG und AJM werden durch predoctoral Gemeinschaft Zuschüsse aus der UPV/EHU und das baskische Department of Education unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase- und Phosphatase-Inhibitoren | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA Assay | Thermo Scientific | 23227 | Proteinquantifizierungskit |
| Einweg-Kunststoffstößel | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce Homogenisierer | VWR | 431-0100 | |
| Mikrozentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
Referenzen
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).
- Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. Global, quantitative and ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
