Analyse der AtHIRD11 inneren Unordnung und Bindung in Richtung Metallionen durch Kapillare Gelelektrophorese und Affinität Kapillarelektrophorese

Markus Nachbar; Jorrit Maul; Matthias Stein; Hermann Wätzig

doi:10.3791/57749

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Methodenartikel

Analyse der AtHIRD11 inneren Unordnung und Bindung in Richtung Metallionen durch Kapillare Gelelektrophorese und Affinität Kapillarelektrophorese

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DOI:

10.3791/57749

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22. August 2018

Markus Nachbar¹ , Jorrit Maul¹ , Matthias Stein¹ , Hermann Wätzig¹

¹Institute of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, TU Braunschweig

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll verbindet die Charakterisierung einer Protein-Probe durch Kapillare Gelelektrophorese und ein schnell-Bindung-Screening für geladene Liganden durch Affinität Kapillarelektrophorese. Es empfiehlt sich für Proteine mit einer flexiblen Struktur, wie zum Beispiel intrinsisch ungeordneten Proteine, um irgendwelche Unterschiede für verschiedene Konformere verbindlich festzustellen.

Zusammenfassung

Pflanzen sind stark abhängig von ihrer Umgebung. Höhere Pflanzen entwickeln um stressige Veränderungen (z.B., Trockenheit und hohe Salzgehalt) anpassen, Klassen von intrinsisch ungeordneten Proteinen (IDPs), oxidativen und osmotischen Stress zu reduzieren. In diesem Artikel verwendet eine Kombination von Kapillaren Gelelektrophorese (CGE) und Mobilität Verschiebung Affinität Elektrophorese (ACE) um das Bindungsverhalten von verschiedenen Umformer von IDP AtHIRD11 von Arabidopsis Thalianazu beschreiben. CGE wird verwendet, um die Reinheit des AtHIRD11 bestätigen und Fragmente, posttranslationale Modifikationen und andere Verunreinigungen als Gründe für komplexe Peak Muster auszuschließen. In diesem Teil des Experiments sind die verschiedenen Beispielkomponenten getrennt durch ein zähflüssiges Gel in einer Kapillare durch ihre unterschiedlichen Massen und mit einer Diode Array Detektor erkannt. Danach wird das Bindungsverhalten der Probe gegenüber verschiedenen Metallionen von ACE untersucht. In diesem Fall der Liganden wird hinzugefügt, um die Pufferlösung und die Verschiebung der Migrationszeit wird gemessen, um festzustellen, ob eine verbindliche Ereignis oder nicht aufgetreten ist. Einer der Vorteile der Verwendung von der Kombination von CGE und ACE um zu bestimmen, das Bindungsverhalten des IDP ist die Möglichkeit zur Automatisierung der Gelelektrophorese und Bindung-Assay. Darüber hinaus CGE zeigt eine Untergrenze der Erkennung als die klassische Gelelektrophorese und Ass ist in der Lage, die Art der Bindung eines Liganden in einer schnellen Weise bestimmen. ACE kann darüber hinaus auch auf andere geladene Spezies als Metallionen angewendet werden. Allerdings ist die Verwendung dieser Methode für verbindliche Experimente in seiner Fähigkeit, die Anzahl der Bindungsstellen bestimmen begrenzt. Dennoch kann die Kombination von CGE und ACE angepasst werden, charakterisieren das Bindungsverhalten einer Protein-Probe gegenüber zahlreichen geladenen Liganden.

Einleitung

Pflanzen sind stärker abhängig von ihrer Umgebung als viele andere Lebensformen. Da Pflanzen auf andere Orte übertragen können, müssen sie auf Veränderungen in ihrem Umfeld (z.B., Trockenheit, Kälte und hohe Salzkonzentrationen) einzustellen. Daher entwickelt höhere Pflanzen spezialisierten Stress-Proteine wie Dehydrins, die vielfältige Aufgaben zur Zelle Stressabbau im Zusammenhang mit hohem Salzgehalt zu erfüllen. Diese Proteine binden Wasser und Ionen innerhalb der Zellen, reduzieren oxidativen Stress durch verbindliche Cu^{2 +}-Ionen, und die Interaktion mit Phospholipide sowie die Cytoskeletons. Darüber hinaus binden Zn^{2 +}-Ionen können....