Methodenartikel

Übung Messhöhen in Drosophila Melanogaster mit der rotierenden Bewegung Quantifizierung System (Anforderung)

DOI:

10.3791/57751

⸱

27. Mai 2018

 , 
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die rotierende Bewegung Quantifizierung System (REQS) induzieren können Übung in Drosophila Melanogaster durch Rotation während der Messung gleichzeitig der Höhe der Aktivität von den Tieren durchgeführt. Hier präsentieren wir Ihnen ein Punkt-für-Punkt-Protokoll Details wie Aktivität der Tiere erleben rotatorische Bewegung Behandlungen mit der REQS. zu messen

Zusammenfassung

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Drosophila Melanogaster ist eine neue Modellorganismus für die Übung Biologiestudium. Bisher, zwei wichtigsten Übung Systeme der Power Tower und die Treadwheel beschrieben. Allerdings hat eine Methode zur Messung der Menge an zusätzliche tierische Aktivität induziert durch die Übung Behandlung gefehlt. Die rotierende Bewegung Quantifizierung System (REQS) füllt dieses Bedürfnis bietet ein Maßstab für die tierische Aktivität für Tiere, die rotatorische Bewegung zu erleben. Dieses Protokoll beschreibt, wie Sie die Anforderung verwenden, um tierische Aktivität während der rotatorischen Bewegung beurteilen und zeigt den Typ der Daten, die generiert werden können. Hier zeigen wir, wie die Anforderung verwendet wird, um die Stamm-geschlechtsspezifische Unterschiede in Übung induzierte Aktivität zu messen. Die Anforderung kann auch zur Bewertung der Auswirkungen der verschiedenen anderen experimentellen Parameter wie Alter, Ernährung oder Bevölkerung Größe auf Übung induzierte Aktivität. Darüber hinaus kann verwendet werden, um die Wirksamkeit der verschiedenen Übung Trainingsprotokolle zu vergleichen. Wichtiger ist, bietet es Gelegenheit zur Übung Behandlungen zwischen Stämmen, so dass des Forschers um gleiche Mengen von Aktivität zwischen Gruppen bei Bedarf zu erreichen zu standardisieren. So die Anforderung ist eine bemerkenswerte neue Ressource für Übung Biologen mit dem Drosophila-Modell-System arbeiten und ergänzt bestehende Übung Systeme.

Einleitung

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Neuerdings haben Forscher der Fruchtfliege Drosophila Melanogaster verwenden, um Übung Biologie zu studieren. D. Melanogaster wurde eine genetische Modellsystem für über 100 Jahre1,2. Drosophila-Forschung hat jedoch nicht nur Genetik, sondern auch eine Vielzahl von anderen Disziplinen wie Verhaltensbiologie, Neurobiologie und Physiologie3Beitrag geleistet. Im Jahr 2009, der Power Tower war das erste Trainingsgerät für Drosophila beschrieben4. Der Power Tower nutzt die Tiere negative Geotaxis Antwort. Wenn Sie gestört, Drosophila neigen dazu, an der Spitze von ihrem Gehege zu bewegen. Diese Antwort ist gut etabliert und ist die Grundlage für die beliebte "RING" (schnelle Iterative Negative Geotaxis5) Assay, der verwendet wird, um Steigfähigkeit und/oder körperliche Fitness in Drosophila zu schätzen. Der Power Tower verwendet einen mechanischen Arm mit einer Motoreinheit, immer wieder eine Reihe von Tiere in ihren Gehegen zu heben durch mehrere Zoll und zurück auf den Boden ablegen, die negative Geotaxis Reaktion (Tinkerhess Et Al. 20126 induzieren Geben Sie eine Video zur Veranschaulichung der Verwendung von der Power Tower). Längere Behandlung auf den Power-Tower damit erhöht sich die Menge der körperlichen Aktivität (laufen oder fliegen) führen Sie die Tiere im Vergleich zu unbehandelten Kontrolltieren und über Zeit führt zu einer verbesserten Performance in den RING-Assay für körperliche Fitness4. So zeigte diese Arbeit die Machbarkeit der Verwendung von Drosophila als Modell für die Übung Biologie.

Erweitern das Repertoire des Tools für Drosophila Übung Forschung im Jahr 2016, beschrieben Mendez und Kollegen ein zweites Drosophila Trainingsgerät, Treadwheel7. Ähnlich wie bei der Power Tower, nutzt die Treadwheel negative Geotaxis Antwort von Drosophila. Jedoch wird diese Reaktion durch kontinuierliche Rotation des die Tiergehege, anstatt durch Anheben und fallen lassen wie in der Power Tower induziert. Diese induktionsmethode ist sanfter und ermöglicht eine mehr Ausdauer orientierte Übung Regime, die physischen Trauma vermeidet, die während des Trainings in der Power Tower auftreten können (siehe Katzenberger, R. J. Et Al. 20138 für die Auswirkungen der wiederholte körperliche Trauma auf Drosophila Gesundheit). Ähnlich wie bei der Power Tower4, Übung Umgang mit Tieren auf der Treadwheel führt zu einer Vielzahl von physiologischen Reaktionen, einschließlich Änderungen der körperlichen Fitness, Triglyzeride und Körper Gewicht7. Damit stehen zwei komplementäre Methoden für Drosophila Biologen studieren Übung.

Eine Einschränkung der Power Tower und die Treadwheel ist die Unfähigkeit zur Messung der Aktivität durch die Übung Behandlung induziert. Analyse der Video-Aufnahmen aus dem Treadwheel gezeigt, dass gab es erhebliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Drosophila Stämme in auf die Übung Behandlung7 Reaktion. Konkret untersucht die Stämme unterschieden sich in wieviel zusätzliche Aktivität der Tiere wenn durchgeführt7angeregt. Diese Beobachtung veranlasste uns, eine dritte Übungssystem, die rotierende Bewegung Quantifizierung System (REQS), zu entwickeln, die uns tierische Aktivität während der Drehung-induzierte Übung9messen können. Die REQS nutzt eine handelsübliche Activity monitoring-Einheit, die auf einem rotierenden Arm Übung durch Rotation in die Treadwheel stimulieren installiert ist. Erste Arbeit mit der Anforderung bestätigt, dass genetisch verschiedenen Drosophila Stämmen — und Geschlechter - können deutlich unterschiedliche Reaktionen auf die rotierende Stimulation und die Menge der Übung induzierten entspricht somit nicht unter verschiedenen Genotypen9 . Dadurch ermöglicht die REQS jetzt Drosophila Biologen, Messen Sie die Menge der Übung induziert durch die Behandlung eröffnen vielfältige neue Forschungsansätze im Feld Bewegung.

Hier beschreiben wir im Detail die Anforderung für die Quantifizierung der rotatorischen Bewegung verwenden. Die REQS rotatorische Bewegung induziert und misst gleichzeitig die Aktivität der Tiere behandelt werden. Die Anforderung ist in der Lage, eine Vielzahl von Trainingsprogrammen, reichen vom einfachen 2 h kontinuierliche Übung Regime demonstriert hier zu komplexeren Intervall Trainingsmethoden wie beschrieben von Mendez und Kollegen7und Stimulation ist einstellbar über Drehzahl (zwischen ca. 1-13 Umdrehungen pro Minute). Je nach Aktivität Monitor verwendet, um die Anforderung zu produzieren ist diese Methode für die Analyse der einzelnen fliegen oder große Populationen von Tieren. Aufgrund dieser Vielseitigkeit bietet die REQS Drosophila Forscher mit einer Reihe von Möglichkeiten zu studieren, zum Beispiel, andere Übung Regime, Diät Interventionen oder Auswirkungen der Bevölkerungsdichte.

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Protokoll

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Die Anforderung besteht aus einem Drosophila Aktivitäts-Anzeige (Quellenangaben, siehe Tabelle of Materials) montiert auf einem rotierenden Arm, der von einer Motoreinheit (Abbildung 1) gesteuert wird. Die Aktivitäts-Anzeige bestimmt, wie oft in einer bestimmten Zeitspanne, die das Array von Laserstrahlen sezieren der Mitte des Rohres Assay unterbrochen wird. Detaillierte Zeichnungen und eine detaillierte Charakterisierung finden Sie unter unseren vorherigen Veröffentlichung9. Während unser System das LAM25H Gerät verwendet, kann die Anforderung angepasst werden sowie anderen Drosophila Aktivitäts-Anzeige-Einheiten.

1. Testen das Setup der REQS

  1. Auslastungstests fliegt in Glasröhren Probe durch Betäuben der Tiere mit CO2 oder andere gewählte Verfahren für Handhabung, verschieben sie in das leere Rohre und verschließen der Rohre.
  2. Angeschnittene Ärmel Glasröhren Probe in die Schlitze des Referats Activity Monitor einfügen. Sichern Sie die Rohre Gummi O-Ringe (17-18 Gauge) und/oder Gummibänder auf beiden Seiten des Gerätes, um die Rohre zu gewährleisten bewegen sich nicht während der Rotation:
    1. Schieben Sie einen o-Ring über der Probe-Tube und positionieren Sie den o-Ring in der Nähe der Mitte des Rohres. Die Probe Schlauch durch einen Schlitz in der Aktivitätsanzeige von vorne und zentrieren Sie ihn.
    2. Den o-Ring zu bewegen, je nach Bedarf und sorgen dafür, dass sobald die Probe Rohr zentriert ist, so nah an den Monitoreinheit möglichst der o-Ring geschoben wird. Fixieren der Probe Tube durch Ausrutschen einen zweiten o-Ring über die Glasröhre von hinten, den o-Ring so nah an den Monitoreinheit möglichst wieder in Bewegung.
  3. Drehrichtung der REQS durch Umklappen der Power-Schalter auf der Vorderseite des Geräts zu initiieren. Passen Sie die Drehzahl mit dem Regler auf der Vorderseite des Gerätes auf die gewünschte Geschwindigkeit (4 u/min (Umdrehungen pro Minute) in diesem Beispiel).
    Hinweis: In diesem Beispiel die Drehzahl wurde gewählt, um eine zuvor veröffentlichten Studie7entsprechen. Da unterschiedliche Drehzahlen in verschiedenen tierischen Aktivität, führt bei der Initiierung einer neuen Studie, kann die Optimierung der Drehzahl für die spezifischen Versuchsanordnung (Genotyp, Länge der Übung Kampf usw.) erforderlich sein.
    Hinweis: Es ist darauf zu achten, dass die Rohre richtig positioniert sind, so dass sie nicht entlang der Unterseite des Referats REQS während der Rotation ziehen.
  4. Testen Sie die Verbindung auf das Datenerfassungssystem durch Öffnen der DAMSystem308-Software und sicherzustellen, dass die Verbindung Licht grün für mehrere Umdrehungen bleibt mit Drosophila Aktivitäts-Anzeige-Einheit ausgestattet. Die Software startet Aufzeichnung von Daten in eine Textdatei "MonitorX" (X ist die Nummer der Einheit, wenn mehrere Monitore verwendet werden) sofort nach Einleitung. Aufnahmefrequenz kann im Register "Einstellungen" eingestellt werden; Wir halten in der Regel in 5 min Abständen.
  5. Untersuchen Sie die Textdatei erzeugt durch die DAMSystem308 Software zu gewährleisten, dass die Datenverbindung ordnungsgemäß funktioniert. Probleme mit der Verbindung führen, Ausschnitte, Zeitpunkte, wo 0 Aktivität, für alle Positionen in der Anforderung aufgezeichnet wird (siehe Vertreter Ergebnisse und Tabelle 2). Treten Ausschnitte passen Sie Datenverbindungen zu den rotierenden Telefonbuchse an, wie diese Verbindung während der Rotation, lose oder verdreht werden kann. Wir finden, dass die Stabilisierung der Verbindung mit Klebeband hilft, um dieses Problem zu vermeiden.

2. Vorbereitung der Tiere

Hinweis: Alle Tiere wurden angehoben und unter Standardbedingungen im Inkubator (25 ° C, Luftfeuchtigkeit von 60-70 %, 12 h Hell/Dunkel-Zyklus) auf Melasse/Maismehl Medien10getestet.

  1. Richten Sie zwei Wochen vor dem geplanten Experiment Fläschchen mit kontrollierten Viehdichte ein, die experimentelle fliegen zu sammeln; in der Regel richten wir Fläschchen mit 7 Männer und 10 Frauen. Mit einem gesunden bestand aus einem einzigen Fläschchen können ca. 15 Jungfrau Männer und 15 Frauen über eine 4-Tage-Zeitraum gesammelt werden. Passen Sie die Anzahl der Fläschchen eingerichtet, basierend auf der Anzahl von Tieren, die für den Test benötigt; ein typischer Test in unserem Labor enthält 10 10 Jungfrau Männchen und Weibchen pro Genotyp (100 Männer und 100 Frauen).
    Hinweis: Nicht-Jungfrau fliegen können abhängig von der spezifischen experimentellen Frage verwendet werden. Wenn längerfristige Experimente mit nicht-Jungfrau Tieren durch, können Kriechende Larven mit genauen Aktivitätsüberwachung stören.
  2. Entfernen Sie die Eltern fliegen eine Woche nach dem Einrichten der Fläschchen.
  3. Ab 10. Tag nach der Einrichtung der Vials, Native fliegen aus dem Fläschchen zu sammeln und nach Geschlecht getrennt aufbewahren.
  4. Sammeln Sie genügend Tiere für das Experiment und das Alter als, 3 Tage in diesem Beispiel erforderlich.
    Hinweis: Wir betäuben in der Regel die Tiere mit CO2 für das Handling. CO2 ist bekanntermaßen tierische Aktivität für längere Zeit nach der Behandlung auswirken (z. B. siehe Bartholomew Et Al. 201511). Beeinträchtigt die CO2 -Effekt mit geplanten nachgeschalteten Tests oder Analysen, verwenden Sie eine andere Anästhesie-Methode z. B. Eis Anesthetization.

3. Datenerhebung mit der REQS

  1. Betäuben Sie die Tiere für die Übung Quantifizierung Studie mit CO2 oder eine andere Methode der Anästhesie verwendet werden. In Gruppen unterteilen Sie, je nach Bedarf und laden Sie die Gruppen von Tieren in die leere Glasröhrchen die Aktivitäts-Anzeige; in diesem Beispiel werden 10 Tiere gleichen Alters pro Glasrohr mit 10 Wiederholungen für jede Tierart (Sex/Genotyp) geladen. Unbedingt beachten, welche Tierart in jedem Röhrchen geladen wird.
    Hinweis: Für längere Experimente kann Lebensmittel in den Probe-Rohren aufgenommen werden. In diesem Fall ist es wichtig, dass das Essen sicher ist und nicht werden, während der Rotation verdrängt wird.
  2. Laden Sie die Glasröhren Assay in REQS Gerät und sichern Sie sie mit der O-Gummiringe. Arbeiten mit mehreren Sex/Genotyp wird mit einem randomisierten Block-Design oder Randomisierung der Position der Tiere in der Anforderung jede mögliche Positionseffekte beseitigen. Randomisierung kann durch Zuweisung jedes Fläschchen eine Zufallszahl, z. B. von einer Web-basierten Zufallszahlen-Generator (z. B. https://www.randomizer.org/) oder in einer Tabellenkalkulation, und bestellen dann die Fläschchen basierend auf die Zufallszahl erreicht werden.
  3. Legen Sie die Anforderung in den Brutkasten Sicherstellung konstanter Temperatur, Feuchtigkeit und Licht Bedingungen. Stellen Sie sicher, dass die Daten-und Netzkabel richtig angeschlossen sind.
  4. Lassen Sie die Tiere aus der Narkose zu erholen und an die neue Umgebung für 1 h zu akklimatisieren.
  5. Beginnen Sie das Experiment durch die Einleitung der Rotation der Anforderung mit der gewünschten Geschwindigkeit.
    Hinweis: Eine weitere Möglichkeit ist, zunächst Basisdaten Aktivität von den Tieren vor der Einleitung der Rotation, gefolgt von Aufnahme Bewegungsstufen in Reaktion auf die rotierende Stimulation sammeln.
  6. Initiieren Sie Datenerhebung durch Öffnen der DAMsystem308-Software (einfaches Öffnen der Software initiiert Datenerhebung). Daten werden in einer Text-Datei im eingestellten Intervall (hier: 5 min); geschrieben. Ändern Sie ggf. Intervalleinstellungen im Reiter "Einstellungen" (siehe Punkt 1.4).
  7. Um sicherzustellen, dass die Daten erfolgreich auf den Computer übertragen werden, öffnen Sie die Textdatei, die von der DAMsystem308-Software generiert, nachdem ein oder zwei Zeitintervalle sind vergangen, und bestätigen Sie, dass Daten in die Datei geschrieben werden. Schließen Sie und öffnen Sie diese Datei, um Daten aus keine zusätzliche Zeitpunkte zu sehen. Sammeln Sie Daten für den gewünschten Zeitraum; in diesem Beispiel 2 h.
    Hinweis: Öffnen Sie nicht den Inkubator zur Zeit der Assay wie die Tiere sehr empfindlich auf Störungen reagieren und werden wahrscheinlich mit einer erhöhten Aktivität reagieren.
  8. Am Ende der Übung Test beenden Sie Datensammlung durch die Schließung der DAMsystem308-Software, dann schalten Sie die REQS. Herausnehmen Sie die Tiere aus der Glasröhren Assay und reinigen Sie der Rohre. Die Tiere können wieder in Essen Fläschchen verschoben werden, wenn wiederholt Maßnahmen in den verschiedenen Altersstufen erforderlich sind.
    Hinweis: Wenn Todesfälle während der Übung Regime auftreten, sollte es aufgezeichnet werden, wie das Vorhandensein von Toten fliegen Aktivität zählt auswirken kann. Nach unserer Erfahrung mit der DGRP2 Fliegenschnüre12,13trainieren Sie im 4 u/min für 2 h nicht in alle Todesfälle führen, aber schwächere Stämme vielleicht anders reagieren.

(4) Datenanalyse

  1. Öffnen Sie die txt-Datei mit der Bezeichnung "Monitor1" produziert von der DAMSystem308-Software.
  2. Überprüfen Sie die Datendatei für alle Probleme, die möglicherweise während der Datenerfassung (verpasste Zeitpunkte, etc.; aufgetreten sind ( Tabelle 1). Falls erforderlich, zu zensieren die Datei von Datenpunkte am Anfang und Ende der Aufnahme entfernen.
  3. Mit Hilfe der statistischen Software Ihrer Wahl (z.B. R), die erfassten Daten analysieren. Statistiken Sie deskriptive und Varianzanalyse (ANOVA) Effekte wie Geschlecht und Genotyp, untersuchen durchzuführen Sie, wenn die Daten normalverteilt sind. Wenn die Daten nicht normalverteilt sind, verwenden Sie nicht-parametrischen Methoden wie Kruskal-Wallis-Tests, um Gruppen zu vergleichen. Die erforderlichen spezifischen Analysen werden auf die spezifische Fragestellung und das experimentelle Design abhängen.

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Ergebnisse

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Die Ausgabe von einem einzelnen Lauf mit der Anforderung ist eine Datentabelle, produziert von der DAMSystem308-Software, die "Monitor1.txt" (für ein Beispiel siehe ergänzende Datei 1) standardmäßig beschriftet werden. Ein Auszug aus dieser Tabelle ist in Tabelle 1dargestellt. Jede Spalte enthält die Daten aus einer einzelnen Assay Rohr, während die Zeilen die Aktivität gemessen in jedes Zeitintervall von Beginn des Experiments (oben) bis zum Ende (unten ...

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Diskussion

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Wie die repräsentativen Ergebnisse zeigen, ist die Anforderung in der Lage, präzise Messung der Aktivität der Ausübung Drosophila. Die Anforderung ist flexibel und erlaubt es den Forschern, eine Vielzahl von Fragestellungen im Zusammenhang mit Übung Biologie oder Übung Interventionen anzugehen. Es gibt zwei wichtige Schritte im Protokoll zum markieren. Erstens ist es wesentlich für den Versuchsaufbau des REQS um sicherzustellen, dass die Datenübertragung von der Anforderung an die DAMSystem308 ordnungsgemäß funktioniert....

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Die Arbeit wurde von Award Nummer P30DK056336 von der nationalen Institut von Diabetes und und Nierenerkrankungen des Verdauungssystems durch einen pilot Zuschuss aus der Ernährung und Adipositas Research Center an der University of Alabama at Birmingham NCR unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Drosophila-Aktivitätsmonitor TrikineticsLAM25HREQS Komponente
Telefonkabel EntwirrerUvitaluv20170719REQS Komponente
Fläschchenverschlüsse (Flugs)Genesee Scientific49-102Drosophila Kulturzubehör
Fläschchen & nbsp;Genesee Scientific32-120Drosophila-Kulturzubehör
Drosophila-Kulturnetz CarolinaBiological Supply173090Drosophila-Kulturzubehör
MaismehlPepsico43375Drosophila-Medien
MelasseGolden BarrelBLA-GALDrosophila-Medien
AgarApex Bioresearch66-103Drosophila-Medien
Inaktive TrockenhefeGenesee62-106Drosophila media
TegoseptApex Bioresearch20-258Drosophila media
PropionsäureGenesee Scientific20-271Drosophila media
Scientific

Referenzen

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Schlagwörter

Drosophila MelanogasterExercise QuantificationRotating Exercise Quantification SystemActivity MonitoringRotational ExerciseExercise BiologyGenetic PathwaysStatistical AnalysisIncubator ConditionsData Collection

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