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Methodenartikel

Mündliche Biofilmbildung auf unterschiedlichen Materialien für Zahnimplantate

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DOI:

10.3791/57756

⸱

24. Juni 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo, 2Department of Restorative Dentistry, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur mündlichen Biofilmbildung auf Titan und Zirkonoxid Materialien für Zahnersatz Aufbauten, einschließlich der Analyse von Bakterienzellen Lebensfähigkeit und morphologische Eigenschaften zu bewerten. Der oralen Biofilm-Analyse dient eine in Situ -Modell mit mächtigen mikroskopiertechniken verbunden.

Zusammenfassung

Implantate und prothetischen Komponenten sind anfällig für bakterielle Kolonisation und Biofilmbildung. Die Verwendung von Materialien, die geringe mikrobielle Haftung bietet kann die Prävalenz und Fortschreiten der periimplantären Erkrankungen reduzieren. Angesichts der Mundmilieu Komplexität und oralen Biofilm Heterogenität, Mikroskopie, die Techniken benötigt werden, die eine Biofilm-Analyse der Oberflächen der Zähne und Dentalmaterialien aktivieren können. Dieser Artikel beschreibt eine Reihe von Protokollen für den Vergleich von mündlichen Biofilmbildung auf Titan und keramische Werkstoffe für prothetische Aufbauten sowie die Modalität in oralen Biofilmen Analysen auf morphologische und zellulärer Ebene umgesetzt. Das Modell in Situ , mündliche Biofilmbildung auf Titan und Zirkonoxid Materialien für Zahnersatz Widerlager zu bewerten, wie beschrieben in dieser Studie bietet eine befriedigende Erhaltung des Biofilms 48 h, so bekunden, methodische Angemessenheit. Multiphoton-Mikroskopie ermöglicht die Analyse eines Vertreters der Bereich des Biofilms auf der Testmaterialien gebildet. Darüber hinaus ermöglicht den Einsatz des Fluorophore und die Verarbeitung der Bilder multiphoton Mikroskopie mit die Analyse der bakteriellen Lebensfähigkeit in einer sehr heterogenen Bevölkerung von Mikroorganismen. Die Vorbereitung der biologischen Proben für Elektronenmikroskopie fördert die bauliche Erhaltung der Biofilm, Bilder mit guter Auflösung und keine Artefakte.

Einleitung

Bakterielle Biofilme sind komplex, funktionell und strukturell organisiert mikrobielle Gemeinschaften, gekennzeichnet durch eine Vielfalt an mikrobielle Spezies, die eine extrazelluläre, biologisch aktiven Polymer-Matrix1,2zu synthetisieren. Die bakterielle Adhäsion zu biotischen und abiotischen Oberflächen ist eine Formation von der erworbenen Häutchen, hauptsächlich bestehend aus Speichel Glykoproteine1,3,4vorangestellt. Schwache physikalisch-chemischen Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen und das Häutchen sind zunächst etabliert und gefolgt durch stärkere Wechselbeziehungen zwischen bakteriellen Adhesins und Glykoprotein-Rezeptoren von der erworbenen Häutchen. Mikrobielle Vielfalt allmählich durch die Coaggregation der sekundären Kolonisatoren an die Rezeptoren der bereits angeschlossenen Bakterien bilden eine gemischte Gemeinschaft1,3,4, 5.

Homöostase der mündlichen Mikrobiota und seine symbiotische Beziehung mit dem Host ist wichtig für die Erhaltung der Mundgesundheit. Die Dysbiose in oralen Biofilmen erhöht das Risiko für die Entwicklung von Karies und Parodontitis2,5. Klinische Studien zeigen eine Ursache-Wirkungs-Beziehung zwischen der Akkumulation von Biofilm auf den Zähnen oder Zahnimplantaten und die Entwicklung von Gingivitis oder periimplantären Mukositis6,7. Das Fortschreiten des entzündlichen Prozesses führt zu Periimplantitis und dem damit verbundenen Verlust der Implantat-8.

Implantate und prothetischen Komponenten sind anfällig für bakterielle Besiedlung und Biofilm-Bildung-9. Die Verwendung von Materialien mit einer chemischen Zusammensetzung und der Oberflächentopographie, die geringe mikrobielle Haftung bietet möglicherweise die Prävalenz und Fortschreiten der periimplantären Erkrankungen9,10reduzieren. Titan ist das am häufigsten verwendete Material für die Herstellung der prothetische Aufbauten für Implantate; jedoch keramische Werkstoffe wurden vor kurzem eingeführt und werden immer beliebter als Alternative zu Titan wegen ihrer ästhetischen Eigenschaften und Biokompatibilität11,12. Auch wichtig ist, wurden keramische Werkstoffe mit einem angeblich weniger Potenzial zur Einhaltung von Mikroorganismen, vor allem aufgrund ihrer Rauheit der Oberfläche, Benetzbarkeit und freien Oberflächenenergie10,13verbunden.

In-vitro- Studien haben bedeutende Fortschritte im Verständnis der mikrobiellen Adhäsion auf prothetische Abutment Oberflächen9,14,15,16,17beigetragen. Das dynamische Umfeld der Mundhöhle, zeichnet sich durch seine unterschiedlichen Temperatur und pH-Wert und nährstoffverfügbarkeit sowie durch die Anwesenheit von Scherkräften, ist jedoch nicht reproduzierbar in in-vitro- experimentelle Protokolle18, 19. Um dieses Problem zu überwinden, ist eine Alternative die Verwendung von in Situ -Modellen der Biofilmbildung, die vorteilhafterweise seine dreidimensionale Struktur für ex-Vivo Analyse10,20, bewahrt 21 , 22 , 23 , 24.

Die Analyse der komplexen Struktur des Biofilms auf mündliche Substraten gebildet erfordert den Einsatz von mikroskopiertechniken optisch dichter Materie25anzeigen kann. Multiphoton Laser-scanning-Mikroskopie ist eine moderne Option für Biofilm Strukturanalyse26. Es zeichnet sich durch die Verwendung der nichtlinearen Optik mit einer Lichtquelle in der Nähe der Infrarot-Wellenlänge, gepulst bis Femtosekunden27. Diese Methode ist für die Bildaufnahme der Autofluoreszenz Materialien oder Materialien geprägt von Fluorophore, neben Bildern erzeugt durch nichtlineare optische Signale, die ein Phänomen bekannt als zweite harmonische Generation abgeleitet angegeben. Zu den Vorteilen der multiphoton Mikroskopie ist die große Bildtiefe mit minimalen Zellschäden verursacht durch die Intensität der Anregung Licht27erhalten.

Für eine Rentabilität Analyse des Biofilms auf abiotischen Oberflächen durch multiphoton Mikroskopie die Verwendung von fluoreszierenden Nukleinsäure Farbstoffe mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften und eine Eindringen Kapazität in Bakterienzellen erforderlichen28. Fluorophores SYTO9 (grün-fluoreszierende) und Propidium Jodid (rot-fluoreszierend) können für eine visuelle Unterscheidung zwischen lebenden und toten Bakterien28,29,30verwendet werden. Propidium Jodid dringt nur Bakterien mit beschädigten Membranen, während SYTO9 Bakterienzellen mit einer intakten und kompromittiert Membran tritt. Wenn beide Farbstoffe innerhalb einer Zelle vorhanden sind, hat eine größere Affinität für Nukleinsäuren Propidium Jodid und verdrängt SYTO9, kennzeichnet es rot28,30.

Angesichts der Mundmilieu Komplexität und oralen Biofilm Heterogenität, Mikroskopie, die Techniken benötigt werden, die die Biofilm-Analyse der Oberflächen der Zähne und Dentalmaterialien aktivieren können. Dieser Artikel beschreibt eine Reihe von Protokollen für den Vergleich von mündlichen Biofilmbildung auf Titan und keramische Werkstoffe für prothetische Aufbauten sowie die Modalität in oralen Biofilmen Analysen auf morphologische und zellulärer Ebene umgesetzt.

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Protokoll

Diese Studie wurde von der Institutional Review Board der School of Dentistry von Ribeirão Preto genehmigt, und die freiwilligen Teilnehmer unterzeichnete schriftliche Zustimmung (Prozess 2011.1.371.583).

1. die Biofilmbildung in Situ

  1. Auswahl der Teilnehmer
    1. Wählen Sie anhand der folgenden Einschlusskriterien Patienten: ein gesunder Mensch mit einem vollständigen Gebiss und keine klinischen Anzeichen von Munderkrankungen.
    2. Patienten anhand der folgenden Ausschlusskriterien auszuschließen: Schwangerschaft, Stillzeit, Karies, Parodontitis oder Antibiotika-Behandlung in den letzten 3 Monaten, Raucher oder eine systemische Erkrankung, die den parodontalen Status beeinflussen könnten.
  2. Vorbereitung der intraoralen Gerät
    1. Notieren Sie den Oberkiefer Bogen mittels Alginat Eindruck.
    2. Bereiten Sie Typ IV Stein durch Hinzufügen von 19 mL Wasser, 100 g Steinpulver vor. Gießen Sie die Stein in die Alginat-Form, ein Modell für den Oberkiefer Bogen zu machen.
    3. Entwerfen und fertigen ein Acryl Intraorales Gerät zur Unterstützung der Probekörper (Titan und keramikscheiben).
      1. Fabrizieren Sie remanente Spangen aus NiCr Draht (0,7 mm Durchmesser) mit kieferorthopädischen Zange #139 zu und positionieren Sie sie auf dem Modell. Um die Klammer zwischen den oberen Prämolaren zu positionieren, beugen Sie einem Ende jedes Drahtes so dass sie eine Schleife zu bilden.
        1. Passen Sie die Schleife in der Region von interdental Papillen. In der okklusalen Einfügen einer sanften Krümmung um nicht mit der Ansprechpartner und der Okklusion zu stören. Machen Sie eine 90° am Ende der Klammer für einen Verbleib in Acryl zu falten.
        2. Um die Klammer in der oberen zweiten molaren passen, passen die Krümmung des Drahtes im zervikalen Drittel (vestibulären) Kontur des Zahnes (distal) zu machen und eine 90° am Ende der Klammer für einen Verbleib in Acryl zu falten.
          Hinweis: Um angemessene Aufbewahrung/Stabilität der intraoralen Gerät zu geben, wurden die remanenten Verschlüsse zwischen dem oberen Prämolaren und dem distalen Aspekt der zweiten molaren auf beiden Seiten des Zahnbogens positioniert.
      2. Manipulieren Sie selbsthärtenden Acrylharz gemäß den Anweisungen des Herstellers zu und drücken Sie die Acrylharz zwischen 2 Glasplatten (mit einem 3 mm dicken Abstandhalter dazwischen) während der Phase der Kunststoff eine 3 mm Dicke Platte machen.
      3. Lag die Acrylglasscheibe auf den palatinalen Bereich des Modells, nach der Gerätekonstruktion, und schneiden Sie die überschüssige Acrylharz mit einem Carver vor Polymerisation.
      4. Fabrizieren Sie Wachs Datenträger mit einer metallischen Matrix [10 mm im Durchmesser und 2 mm Dicke (Fläche von 78,5 mm2)] indem man geschmolzene Wachs in die Matrix und warten auf das Wachs zu festigen. In Acrylharz, 2 von ihnen zwischen die Backenzähne und die anderen 2 neben der zweiten molaren 4 Wachs Datenträger manuell einbinden.
      5. Lassen Sie die Acrylharz in einen drucktopf unter 20 Psi Druckluft für 20 min polymerisieren.
      6. Beenden Sie die intraorale Gerät mit einem elektrischen Dentallabor Handstück und Fräser zu und Polieren Sie es mit abrasiven Kautschuk.
      7. Stellen Sie das Gerät für einen korrekten Sitz im Mund mit der oben beschriebenen Ausrüstung.
  3. Vorbereitung der Titan und Zirkonoxid Exemplare
    Hinweis: Proben (n = 14) sind 10 mm im Durchmesser und 2 mm dick und haben eine Fläche von 78,5 mm2.
    1. Polieren der Proben Oberflächen mit wassergekühlten Sandpapers abnehmender Abrasivität (600, 1200 und 2000 Körnung), ca. 20 Minuten.
      Hinweis: Das Polieren der Proben wurde durchgeführt, um die Rauheit der Oberfläche bei 0,2 µm zu standardisieren.
    2. Reinigen Sie und Desinfizieren Sie die Proben und intraorale Gerät mit Spülmittel und Wasser aus dem Wasserhahn, und dann verwenden Sie Ultraschallbad Isopropyl-Alkohol für 15 min. mit saugfähigem Küchenpapier abtrocknen.
    3. Die Exemplare in der intraoralen mündliche Gerät mit etwa 0,1 mL ungiftig Schmelzklebstoff (Abbildung 1) befestigen.
    4. Installieren Sie das Gerät mit den Proben in der Mundhöhle.
      Hinweis: Das intraorale Gerät mit der Proben sollte für 48 Stunden getragen werden. Das Gerät wurde entfernt und gespeichert in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), während der Patient aß und mündliche Reinigung.

2. Bewertung der bakteriellen Lebensfähigkeit

Hinweis: Der Stichprobenumfang n = 10.

  1. Bereiten Sie eine Färbe Lösung durch Zugabe von 3 µL SYTO9 (grüne fluoreszierende Nukleinsäure-Farbstoff) und 3 µL Propidium Jodid (rot fluoreszierende Nukleinsäure-Farbstoff), 1 mL sterilem destilliertem Wasser.
    Hinweis: Bereiten Sie Lösungen vor Licht geschützt werden.
  2. Übertragen Sie die Proben auf einer 24-Well-Platte und waschen Sie sie gründlich mit PBS, nicht-anhaftende Zellen zu entfernen.
  3. Fügen Sie das entsprechende Volumen (1 mL) Fluoreszenzfarbstoff Lösung zur Deckung der Biofilm-haltige Probe. Fügen Sie den Farbstoff sehr sorgfältig damit nicht um den Biofilm zu zerrütten.
  4. Inkubation der Probe für 20-30 min bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt werden.
  5. Vorsichtig waschen der Biofilm-Probe mit sterilem destilliertem Wasser, überschüssige Farbstoff zu entfernen.
  6. Legen Sie die Probe in eine Glasschale unten und durchführen Sie multiphoton Laser-scanning-Mikroskopie der Biofilm-Analyse.
    Hinweis: Die Analyse der Bakterienzellen Lebensfähigkeit erfolgte mit einem multiphoton Mikroskopie-System. Die Fluoreszenz des Propidium Jodid erkannt wurde, mithilfe eines Filters mit einer Anregung/Emissionswellenlänge von 546/680 nm und 477/600 nm für SYTO9. Die Größe der erhaltenen Bilder war 5.16188 x 5.16188 mm, das entspricht 26,64 mm2 Gesamtfläche von jeder Probe (78,5 mm2) oder 33.94 % der Gesamtfläche. Die Bilder wurden von den zentralen Teil der Probe mit einer Auflösung von 1.024 x 1.024 Pixel gemacht. Der Rotkanal und Grünkanal Bilder wurden separat mit Fidschi Software31analysiert. Jede Zelle wurde mit einem Auswahl-Werkzeug ausgewählt und die Intensität der Fluoreszenz durch die integrierte Dichte der Pixel, Subtraktion den Bildhintergrund gemessen wurde.

3. Analyse der chemischen Zusammensetzung der Proben durch Energy Dispersive Spektroskopie (Hg.)

Hinweis: Der Stichprobenumfang n = 3.

  1. Wählen Sie 3 Exemplare von jedem Biofilm-Kostenloses Testmaterial und bewerten Sie die chemische Zusammensetzung in 2 verschiedenen Bereichen von jeder Probe mit einem Rasterelektronenmikroskop, gekoppelt an eine dispersive Energie-Spektrometer mit einem Elektron Lichtstrahl Spannung von 10 kV32.

4. Morphologische Analyse des bakteriellen Biofilms durch Rasterelektronenmikroskopie

Hinweis: Der Stichprobenumfang n = 1.

  1. Den Biofilm durch Eintauchen der Proben in 2,5 % Glutaraldehyd verdünnt in 0,1 M Natrium Cacodylate Puffer, pH-Wert 7,0-7,3, 24 Stunden zu beheben.
  2. Waschen Sie die Probe in PBS-Puffer (pH = 7,6).
  3. Postfix den Biofilm mit 1 % Osmium ausgefällt für 1 h.
  4. Waschen Sie die Probe in PBS-Puffer (pH = 7,6).
  5. Der Biofilm-Proben sorgfältig zu entwässern, halten sie eingetaucht in steigenden Konzentrationen von Ethanol-Lösungen (50 %, 70 %, 90 %, 95 % und 100 %).
    Hinweis: Führen Sie 3-Austausch von Ethanol in einer Konzentration von 100 %. Die totale Austrocknung Schritt dauert etwa 2 h.
  6. Übertragen Sie die Proben auf der kritische Punkt Trockner und machen mehrere Ersetzungen mit Kohlendioxid (CO2) bis die Proben trocken sind.
  7. Die getrockneten Proben aus dem Gerät entfernen und Klebe sie auf das Raster-Elektronenmikroskop-Inhaber.
  8. Sputter-Mantel einer 20 nm Schicht aus Gold auf der Probenoberfläche für 120 s.
  9. Legen Sie die Gold-beschichtete Scheiben in der Raster-Elektronenmikroskop Kammer. Bilder aus 5 verschiedenen Bereichen von jeder Probe, bei 20-30 kV unter Variablen Druck und bei 650 X Vergrößerung12zu erhalten.

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Ergebnisse

Die Dichte Besiedlung des Biofilms nach 48 h in Situ Wachstum wurde in dieser Studie durch den Anteil des Bereichs auf den Titan und Zirkonoxid Datenträgern in Bezug auf die gescannten Gesamtfläche der Probe mit multiphoton Mikroskopie (kolonisierten vertreten. 26.64 mm2). Abbildung 2 stellt die bakterielle Besiedlung Dichte auf der Oberfläche die 3 geprüften Materialien. Eine höhere Dichte von Biofilm wurde beobachtet, auf den Oberflächen...

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Diskussion

In dieser Studie beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um die Biofilmbildung auf Titan und Zirkonoxid Materialien für prothetische Aufbauten, einschließlich der Analyse der Bakterienzelle Lebensfähigkeit und morphologische Eigenschaften zu bewerten. Um dies zu erreichen, wurde eine in Situ -Modell der Biofilmbildung entwickelt, bestehend aus einer intraoralen Geräts in der Lage, Proben von der Testmaterialien unterzubringen und halten sie die dynamische Mundmilieu für 48 h ausgesetzt. Das Gerät wurde als bequ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren danken José Augusto Maulin Mikroskopie Multiuser Laboratory (School of Medicine der Ribeirão Preto), für seine großzügige Unterstützung bei der EDS und SEM Analysen und Hermano Teixeira Machado für seine großzügige technische Hilfe bei der video-Ausgabe.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Hydrogum 5Zhermack DentalC302070
Durone IVDentsply17130500002
NiCr Draht Morelli55.01.070
JET autopolymerisierendes AcrylglasClá ssico
Zahnwachs Clá ssico
Druckbehälter Essencedental
Schleifpapiere Körnung 600NORTONT216
Schleifpapiere 1200 KörnungNORTONT401
Schleifpapiere 2000 KörnungNORTONT402
Metallographische PoliermaschineArotec
IsopropylalkoholSIGMA-ALDRICHW292907
SchmelzklebstoffTECSILPAH M20017
Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability KitInvitrogenL10316
Pipettenspitzen, 10 & Mikro; LKASVIK8-10   
Pipettenspitzen, 1.000 & Mikro; LKASVIK8-1000B   
24-Well-Platte KASVIK12-024
GlasbodenschaleThermo Scientific150680
AxioObserver inverses Mikroskop ZEISS
Chameleon Vision II LaserKohärentes
Objektiv EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Öl DICZEISS440452-9903-000
SDD-Sensoren - X-Max 20mm²Oxford Instruments
Glutaraldehyd-LösungSIGMA-ALDRICHG5882
Natriumcacodylat-Puffer SIGMA-ALDRICH97068 
OsmiumtetroxidSIGMA-ALDRICH201030
Na2HPO4SIGMA-ALDRICHS9638Wird zur Herstellung von phosphatgepufferter Kochsalzlösung
verwendet KH2PO4SIGMA-ALDRICHP9791 
NaClMERK1.06404
KclSIGMA-ALDRICHP9333 
Ethanol absolut für die Analyse EMSUREMERK1.00983
CPD 030 Critical Point DryerBAL-TEC
JSM-6610 Serie RasterelektronenmikroskopJEOL
SCD 050 Sputter CoaterBAL-TEC

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