Method Article

Optimierung der Capture-Laser Mikrodissektion für die Isolierung der enterischen Ganglien aus menschlichem Gewebe Tiefkühlfrische

DOI:

10.3791/57762

⸱

June 14th, 2018

 ,  , 
1Vanderbilt University Medical Center

In This Article

Summary

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Das Ziel dieses Protokolls ist, hoher Integrität RNA-Proben von enterischen Ganglien isoliert von fixierten, frisch reseziert menschlichen Darmgewebe mit Laser Capture Microdissection (LCM) zu erhalten. Dieses Protokoll beinhaltet Probenvorbereitung Blitz eingefroren menschlichen Darmgewebe, Kryoschneiden, ethanolische Färbung und Dehydrierung, LCM, und RNA-Extraktion.

Abstract

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Der Zweck dieser Methode ist, hoher Integrität RNA-Proben von enterischen Ganglien gesammelt von fixierten, frisch reseziert menschlichen Darmgewebe mit Laser Capture Microdissection (LCM) zu erhalten. Wir haben fünf Schritte im Workflow identifiziert, die entscheidend für den Erhalt der RNA-Isolate aus enterischen Ganglien mit ausreichend hoher Qualität und Quantität für RNA-Seq. Zuerst, muss bei der Vorbereitung von Darmgewebe jede Probe alle überschüssige Flüssigkeit durch Löschpapier vor der Abflachung der Darmhaut so weit wie möglich im unteren Bereich des großen Basis Formen entfernt haben. Proben werden dann schnell auf einen Brei aus Trockeneis und 2-Methylbutane eingefroren. Zweitens, wenn das Gewebe zu schneiden, ist es wichtig, Cryomolds zu positionieren, so dass Darmabschnitte das vollständige Flugzeug den Auerbach-Plexus parallel, damit die größte Fläche des enterischen Ganglien pro Folie nachgeben. Dritte, während LCM, Polyethylen Napthalate (PEN)-Membran Folien bieten die größte Geschwindigkeit und Flexibilität der ungleichmäßigen Formen der enterischen Ganglien zu umreißen, wenn Enterische Ganglien zu sammeln. Viertens, bieten für deutliche Visualisierung der enterischen Ganglien in Abschnitten, Ethanol-kompatiblen Farbstoffe wie Cresyl violett, ausgezeichnete Erhaltung der Integrität der RNA relativ wässrigen Farbstoffe. Zu guter Letzt für die Gewinnung von RNA aus aufgenommenen Ganglien beobachteten wir Unterschiede zwischen kommerziellen RNA-Extraktion-Kits, die überlegene RNA-Menge ergab und Qualität, beim DNA-Kontaminationen zu beseitigen. Optimierung dieser Faktoren in das aktuelle Protokoll stark beschleunigt den Workflow und enterischen Ganglien Proben mit außergewöhnlichen RNS-Qualität und Quantität ergibt.

Introduction

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Diese Methode soll qualitativ hochwertige RNA-Proben der enterischen Ganglien aus menschlichen intestinalen Gewebe mit Laser Capture Microdissection (LCM) zu erhalten. Das hier beschriebene Protokoll wurde optimiert, um ausreichende RNS-Qualität und Erträge für RNA Sequenzierung (RNA-Seq) bieten und mit frisch reseziert, fixierten, Blitz eingefroren menschlichen Darmgewebe verwendet werden soll.

Funktionelle Magen-Darm- und Darm-Motilität-Störungen betroffen einer von vier Menschen in den Vereinigten Staaten. Das Enterische Nervensystem (ENS), auch bekannt als die zweite Gehirn1, ist oft in der Mitte dieser Störungen....

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Protocol

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Alle hier beschriebenen Protokolle wurden von der Vanderbilt Universität institutionelle Review Board (IRB) genehmigt.

1. Vorbereitung vor der Ankunft der Gewebe

  1. Richtige IRB Genehmigung einholen und mit menschliche Organ Spende Agenturen frisch reseziert, unfixierten Darmgewebe von Spendern zu erhalten, die alle Forschung für das Studium erforderlichen Kriterien zu koordinieren.
    Hinweis: Dieses Protokoll kann für Mäuse und andere Nager-Modelle angepasst werden.
    1. Sofort nach Resektion eines jeden Darm Segments, spülen Sie gründlich das Lumen mit gekühlten PBS oder Gewebe-Speichermedium luminalen Restmaterialien oder Kot ....

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Results

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Wir haben einige Verbesserungen an vorhandenen Protokolle, mit denen die relativ schnelle Erfassung der enterischen Ganglien aus menschlichen Darm Proben mit LCM, Erfüllung der Standards für RNA-Seq. Erstens haben wir optimiert das schnelle Einfrieren von Darmgewebe Segmente in großen Basis Formen an der Oberfläche der Gülle von Trockeneis in 2 MB (Abbildung 1B) platziert. Der beste Erfolg bei Kryoschneiden und anschließende LCM wurde durch V.......

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Discussion

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Dieses Verfahren ermöglicht die effiziente Sammlung von zahlreichen enterischen Ganglien als Quelle abzuleiten RNA für RNA-Seq. Hier haben wir die Prozesse gemäß bestehender Protokolle gleichzeitig maximal RNA Integrität beschleunigt. Da alle Schritte in diesem Verfahren voneinander abhängig sind, ist es wichtig, dass alle Probleme aus dem Beginn der Studie beseitigt werden und dass alle Proben so ähnlich zueinander wie möglich, bereit sind, zuverlässige RNA-FF zu erhalten

Von Beginn des Verfa.......

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Disclosures

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Acknowledgements

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Wir sind dankbar für die Spender und deren Familien, die diese Arbeit möglich gemacht. Wir schätzen auch die Unterstützung des Personals am International Institute of Medicine und Tennessee Spender Dienstleistungen zur Unterstützung koordinieren Sammlung von Gewebe, die in dieser Studie verwendet. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health, NIH OT2-OD023850 EMS2 und Stipendium Unterstützung von NIH T32-DK007673, AMZ. Wir sind dankbar für Mitarbeiter der Vanderbilt translationale Pathologie gemeinsame Ressource für den Zugriff auf die LCM Instrument und Beratung auf Gewebe Vorbereitung. Die Vanderbilt Gewebe Patholog....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 % neutral gepuffertes FormalinSigmaHT501128-4L
2-MethylbutanFisherO3551-4
3-ml-SpritzeBD309628
konische 50-ml-Röhrchen, PolypropylenCorning05-526B
Basisformen 37x24x5mm, EinwegElektronenmikroskopie Sciences5025511
Belzer UW  KühlhauslösungBridge to LifeN.A.
CapSure Macro LCM VerschlüsseArcturus, ThermoFisherLCM0211
Frischhaltefolie, Press' n Siegel     Froh   N.A. 
Cresylviolet AcetateAcros OrganicsAC405760025
SchneidebrettElektronenmikroskopie Sciences63308
Ethanol, 190-fachPharmco-AAPER111000190
Ethanol, 200-fachPharmco-AAPER111000200
Glas Objektträger Fisher12-550-343
Handschuhe, verlängerte ManschetteMicroflex
Kittel, chirurgisch zum EinmalgebrauchKimberly-Clark 19-088-2116
Tablett, 20 L (große Sterilisationswanne aus Polypropylen)Nalgene   1335920B
Kimwipes (groß)Kimberly-Clark 34120
Kimwipes (klein)Kimberly-Clark 34133
Laser-Capture-Mikrodissektionssystem (ArcturusXT)ThermoFisherN.A.
Leica Kryostat Spannfutter, groß  40 mm Southeast Pathology Instrument ServiceN.A. 
LichtmikroskopOlympusCX43
Mikroskopobjektiv (20X)Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17N.A.
Mikroskop-Objektiv (10X)Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/-N.A. 
MolekularsiebeAcros OrganicsAC197255000
Nukleasefreies WasserAmbionAM9937
PicoPure RNA-ExtraktionskitApplied Biosystems12204-01
Pellet StößelKimble Kontes4621973
PEN Membran LCM ObjektträgerArcturus, ThermoFisherLCM022
RNase-freie Röhrchen, 1,5 mLAmbionAM12400
RNaseZAP SigmaSigma-R2020
RNA-Extraktionskit "A" (PicoPure)Applied Biosystems12204-01
RNA-Extraktionskit "B" (RNeasy  Micro Kit)Qiagen74004
RNA-Extraktionsmethode "C" (TRIzol)Invitrogen15596-026
RNA-Extraktionskit "D" (RNeasy PLUS Mini Kit)Qiagen74134
Splash Shield, Einweg-GesichtsschutzFisher17-310
Schere, chirurgisch, 14,5 cm "scharf-scharf"Feinwissenschaftliche Werkzeuge14002-14
Spritzenvorsatzfilter, Celluloseacetat (0,2 μ m)Nalgene   190-2520
Einfriermedium für GewebeAllgemeine Daten GesundheitswesenTFM-5
XyloleFisherX3P1GAL
19010144

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gershon, M. D. The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , HarperCollinsPublishers. 1st edn (1998).
  2. Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse ....

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Laser Capture MicrodissectionEnteric Ganglia IsolationHuman Intestinal TissueRNA Extraction OptimizationPEN Membrane SlidesCresyl Violet StainingCryostat SectioningMyenteric Plexus LocalizationTFM EmbeddingRNA Integrity Assessment

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