Zebrafisch sind eine natürliche Vibrio Cholerae zu hosten und zu rekapitulieren und studieren den gesamten ansteckenden Zyklus von der Kolonisierung Übertragung verwendet werden. Hier zeigen wir wie Sie V. Cholerae Kolonisation Ebenen zu bewerten und Durchfall im Zebrafisch quantifizieren.
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Methodenartikel
Quantifizierung von Vibrio Cholerae Kolonisation und Durchfall bei Erwachsenen Zebrafisch-Modell
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Vibrio Cholerae ist am besten bekannt als das infektiöse Agens, das die menschliche Krankheit Cholera verursacht. Außerhalb der menschlichen Wirt besteht V. Cholerae in erster Linie in der aquatischen Umwelt, wo sie mit einer Vielzahl von höheren Wasserlebewesen interagiert. Wirbeltier Fisch sind dafür bekannt, eine ökologische Gastgeber zu sein und sind eine potenzielle V. Cholerae Reservoir in der Natur. V. Cholerae und teleost Fischarten Danio Rerio, allgemein bekannt als Zebrafisch, stammen aus dem indischen Subkontinent, was auf eine langjährige Interaktion in der aquatischen Umwelt. Zebrafisch sind eine ideale Modellorganismus für viele Aspekte der Biologie, einschließlich Infektionskrankheiten zu studieren. Zebrafisch kann einfach und schnell von V. Cholerae nach Exposition im Wasser kolonisiert. Intestinale Kolonisation von V. Cholerae führt zu die Produktion von Durchfall und die Ausscheidung von replizierten V. Cholerae. Diese Bakterien können ausgeschieden dann weitergehen, um neue Fisch-Hosts zu kolonisieren. Hier zeigen wir wie Sie V. Choleraebewerten-intestinale Kolonisation im Zebrafisch und wie V. Choleraezu quantifizieren-induzierte Zebrafisch Durchfall. Die Kolonisation-Modell sollte Forscher nützlich, die studieren ob Gene von Interesse für Host Kolonisation und/oder Umwelt Überleben von Bedeutung sein können. Die Quantifizierung der Zebrafisch Durchfall sollte sinnvoll, Forscher Darm-Erreger, die Zebrafisch als Modellsystem interessieren.
Einleitung
Vibrio Cholerae ist eine aquatische, gramnegatives Bakterium, das bewirkt, die menschliche Krankheit Cholera sowie sporadische Durchfall1,2 dass. V. Cholerae findet sich in der Umwelt in vielen Bereichen der Welt, oft in Verbindung mit anderen Wasserlebewesen. Diese verknüpfen Organismen gehören Plankton, Insekten Ei Massen, Schalentiere und Wirbeltier Fisch Arten3,4,5,6,7. Mehrere Studien haben V. Cholerae aus Darm-Trakt ....
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Protokoll
Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Wayne State University genehmigt. Diese Methode wurde zuerst in Runft Et Al. beschrieben. 12
1. Bestimmung der intestinalen Besiedlung
Hinweis: Intestinale Kolonisation ist die nützlichste Metrik im Zebrafisch-Modell, wie es verwendet werden kann, um die relative Fitness der verschiedenen V. Cholerae Stämme oder die Auswirkungen von Mutationen oder gen Knockouts zu vergleichen.
- Inokulation von Zebrafisch durch Untertauchen
Hinweis: Di....
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Ergebnisse
V. Cholerae Besiedlung der Zebrafisch-Darm-Trakt
Um ein Beispiel für die typische Besiedlung Ebenen zu bieten, die wir beobachten, geimpft wir 5 x 106 KBE der EL Tor V. Cholerae Pandemiestamm N16961 in 200 mL Wasser in einen Becher mit mehreren Zebrafisch. Nach 6 h von Infektion waren die Fische in frischem Wasser gewaschen und in einen Becher mit 200 mL autoklaviert Infektion Wasser wie im Protokoll be.......
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Diskussion
Der Zebrabärbling ist ein relativ neues Modell für die Untersuchung V. Cholerae aber viel verspricht für die Zukunft Entdeckung der bisher unbekannte Aspekte von V. Cholerae Biologie und Pathogenese11,12,13 . Die Erwachsenen Zebrafisch-Modell hat die Vorteile der beiden natürlichen V. Cholerae Host, die intakt, Reife intestinalen Mikrobiota und ein Umweltmodell enthält. Nachteile des Modells sind die z.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Dank Melodie Neely, Jon Allen Basel Abuaita und Donna Runft für ihre Bemühungen bei der Entwicklung des Zebrafisch-Modells. Die Forschung hier berichtet wurde durch das National Institute of Allergy and Infectious Diseases von den National Institutes of Health unter Award Nummern R21AI095520 und R01AI127390 (zu Jeffrey H. Withey) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Instrument | |||
| Shaker Inkubator | New Brunswick Scientific, Edison, NJ | Excella E25 | |
| Inkubator | NUAIRE, Plymouth, MN | Auto Flow | |
| Spectrophotometer | Thermo, Waltham, MA | Geaesys 6 | |
| Vortex Homogenisator | Minibeadbeater24 | 112011 | |
| Waage | Ohaus, Columbia, MD | Adventurer Pro | |
| Heat Stirer | Corning, Corning, NY | PC-420D | |
| Brenner | |||
| automatisierter Koloniezähler | REVSCI | 120417B | |
| Materials | |||
| 400 ml | Glasbecher Pyrex | ||
| perforierte Deckel | Microtip-Halter mit Löchern aus der Tip-Box | ||
| Einweg-Plastiklöffel | Office Depot, Boca Raton, FL | D15-25-7008 | |
| Aquarium System | Aquaneering, San Diego, CA | ||
| RO Wasserreiniger | Aqua FX | TK001 | |
| Fischnetz | Marina | ||
| Fischfutter | Tetra Fin | ||
| Saline Garnelen | Roter Dschungel Marke | O.S.I. pro 80 | |
| Styroporplatte | |||
| Stecknadeln | |||
| Skalpelle | Fine Scientific Werkzeuge, Foster City, CA | 10000-10 | |
| Pinzette | Fine Scientific Werkzeuge, Foster City, CA | 11223-20 | |
| Vannas Schere | Fine Scientific Werkzeuge, Foster City, CA | 15000-11 | |
| 2 ml Schraubröhrchen | Fisher Scientific, Hampton, NH | 02-681-375 | |
| 1 mm Glasperlen | Bio Spec | 11079110 | |
| Glasperlen zum Verteilen | Sigma, St. Louis, MO | 18406-500G | |
| Petriplatte | Fisher Brand, Hampton, NH | FB0875713 | |
| 1,5 ml Zentrifugenröhrchen | Midsci, Valley Park, MO | AVSS1700 | |
| 50 ml Zentrifugenröhrchen | Corning Falcon, Corning, NY | 352098 | |
| Reagenzgläser | Pyrex | 9820 | |
| Glaspipette | Fisher Brand, Hampton, NH | 13675K | |
| Mikropipetten | Sartorius Biohit, Gö ttingen, Deutschland | m1000/m200/m20 | |
| Tips | Genesee Scientific, San Diego, CA | 24-150RS/24-412 | |
| Chemicals | |||
| Instant Ocean Salze phosphatgepufferte | |||
| Kochsalzlösung | VWR Life Science, Radnor, PA | K813-500ml | |
| Tricain (Ethyl-3-aminobenzoat, Methansulfonat Salz | Sigma, St. Louis, MO | A5040 | |
| 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid | Sigma, St. Louis, MO | 10651745001 | |
| Schiff' s Reagenz | Sigma, St. Louis, MO | 84655-250 ml | |
| periodische | Säure Fisher Scientific, Hampton, NH | 10450-60-9 | |
| Mucin aus Schweinemagen | Sigma, St. Louis, MO | M2378-100G | |
| Rinderserumalbumin | Fisher Scientific, Hampton, NH | 9046-46-8 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Reagenz | Thermo, Waltham, MA | 22660 | |
| LB medium | |||
| Trypton | BD Biosciences, San Jose, CA | 211705 | |
| Teast Extract | BD Biosciences, San Jose, CA | 212750 | |
| NACL | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP358-212 | |
| Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 214010 | |
| TCBS Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 265020 | |
| DCLS Agar | Sigma, St. Louis, MO | 70135-500gm | |
| Software | |||
| Microsoft office | |||
| Prism 5 |
Referenzen
- Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. Cholera. The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).
- Dutta, D., et al. Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India. Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (201....
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Nachdrucke und Genehmigungen
