Summary
프로토콜 개발 larvicides, adulticides 및 endectocides의 새로운 클래스에 대 한 미 숙 하 고 성인 모기에 화학 물질의 독성 평가 대 한 설명 합니다. 프로토콜의 단일-지점 복용량 및 복용량 응답 분석 결과 접촉에 독성을 결정 하기 위해 또는 섭취를 통해 후속 평가에서 여러 화학의 높은 처리량 테스트 가능
Abstract
액션의 새로운 모드와 살충제의 새로운 클래스 Zika, 뎅기열, 말라리아 등 질병 전송 모기의 살충제 내성 인구 제어 필요 합니다. 급속 한에 대 한 분석 실험, 모기 애벌레와 어른에 대 한 unformulated 소설 화학의 높은 처리량 분석 되 게 됩니다. 우리는 단일 지점-복용량 및 복용량 응답 분석 Zika, 뎅기열과 황열병, 말라리아 벡터, Anopheles gambiae 및 북부의 Aedes aegypti 벡터를 작은 분자 화학 물질의 독성 평가에 대 한 프로토콜을 설명 집 모기, Culex quinquefasciatus, 접촉 및 섭취를 통해 예를 들어, 우리는 심 실, G 단백질 결합 된 수용 체의, 애벌레, 성인 국 소 및 성인 혈액 공급 분석 결과 통해 작은 분자 길 항 근의 독성 평가. 프로토콜 살충제 잠재적인 조사 하는 시작 지점을 제공 합니다. 결과 제품 응용 프로그램 및 배달에 대 한 메커니즘을 탐구 하는 추가 실험의 맥락에서 설명 합니다.
Introduction
모기는 인간의 건강에 영향을 세계적으로 전염 성 질환의 원인이 되는 에이전트 전송1. 인간의 건강에 영향을 미치는 세 가지 가장 중요 한 모기 속 Anopheles, Aedes와 Culex있습니다. 종의 Aedes 모기 벡터 Zika, 뎅기열, 황열병 및 chikungunya arboviruses. Anopheles 종 벡터 말라리아 기생충 및 Culex 종 전송 웨스트 나 일 바이러스 및 선 충 filarial2. 세계 보건 기구 (WHO)는 근절의 10 소홀히 열 대 질병 (NTD) 20203 에 의해 불리고 가장 실행 가능한 전략으로 모기 제어 확인. 살충제는 모기를 제어 하 고 질병 전송4,5감소 강력한 도구입니다. 그러나, 출현의 살충제 내성 모기 인구 많은 질병6,,78의 지속적인된 제어 위협. 혁신적인 벡터 제어 협회 (IVCC) 모기 제어9대체 살충제를 개발 하는 첫 번째 전용된 노력을 시작 했다. 행동 (MoA)의 새로운 모드와 새로운 살충제는 누구에 게 목표를 달성 하 고 질병 통제를 달성 필요 합니다. 발견과 소설 MoAs 새로운 살충제 클래스의 개발 전체 유기 체 분석 실험 화학 및 산업 표준10에 비해 신속 하 고 높은 처리량 분석 필요합니다.
여러 분석 repellency 애벌레와 성인 모기 살충제의 독성 평가에 사용할 수 있으며 일부는 소설 공식화 또는 unformulated 화학 물질의 평가 대 한 적합. WHO 프로토콜11 4 탈피 애벌레에 대 한 제품을 테스트 하는 데 사용 하는 연락처 분석 결과 이다. 출판된 연구 또한 Aedes aegypti, Anopheles gambiae와 Culex quinquefasciatus10,12, 의 애벌레를 작은 분자 화학 물질의 독성을 테스트 하는 데 사용 하는 애벌레 분석의 다양 한 설명 13,14,,1516. 센터 질병 통제 및 예방 (CDC) 병 검정에 대 한 치 사 농도 (LC) 및 진단 표준에 비해 치명적인 시간 (LT)의 평가 통해 성인 모기의 필드 잡은 인구에 있는 살충제 저항을 평가 하는 데 사용 됩니다. 상업적인 살충제17복용량 시험 된 WHO 빼앗아 모기 살충제-수태 종이 1 시간에 대 한 유리 튜브 내부에 노출 되는 및 사망률 24 h18평가 성인 모기 살충제 저항을 평가 하는 또 다른 방법은 제공 합니다. 다른 분석 실험 안에 봉인 하 고 기록 모기 최저 장과 죽음 공식 원하는 timepoints19스프레이. 모기 흉부에 국 소 응용 프로그램은 다른 살충제20의 효능을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 리버풀 곤충 테스트 설립 (라이트)21 표준 운영 절차를 사용 하 여성인 모기에 화학의 bioactivity 평가 하. 라이트 성인 국 소 분석 결과 48 h에서 사망률과 성인 모기의 흉부에 테스트 제품의 소량을 적용 됩니다. 분석 결과 개별 모기21당 받은 복용량의 정량화를 수 있습니다. 라이트 tarsal 분석 결과 화학적으로 대우 한 표면에 휴식 하는 성인 모기에 테스트 제품의 독성을 평가 하 고 실내 잔여 살포 (IRS)으로 개발을 위한 잠재력을 가진 화학 물질을 식별 하거나 살충제 처리 모기장 (ITNs)에서 사용 하는 데 사용 제어 하려면 Anopheles 모기.
WHO 및 CDC 분석 실험 소설, unformulated 화학, 테스트에 대 한 제한이 있고 CDC 병 생물 검정의 목표 짧은 시험 기간 (2 시간) 동안 민감성의 평가 독성22,23보다. 또한, 화학 물질의 독성 평가 위한 분석 실험 혈액 식사에 전달 하 고 잠재적인 조직 행동 제품의 개발에 대 한 (즉, endectocides) 부족. 여기, 우리 테스트 Anopheles, Aedes와 Culex성인 및 애벌레에 대 한 여러 가지 유기 용 매 중 하나 또는 물에 용 해 되는 새로운 화학의 mosquitocidal 활동 분석 실험을 설명 합니다. 첫째, 이전에 우리의 그룹10,12,,1316, 설명 하 고 여기 수행 애벌레 분석 결과 보여 줍니다 (1)로 빠르게 단일 지점에서 여러 화학 물질을 평가 하는 화면을 복용, (2) 단일 화학의 치명적인 농도 (예를 들어, LC50, LC75 또는 LC90,)을 확인 하는 복용량 응답 분석 결과. 다음, 우리는 치 사 량 (LD)의 결정에 대 한 두 개의 성인 분석을 설명합니다. 이들 중 첫 번째 긍정적인 통제에 비해 성인 모기에 대 한 몸에 붙이기도 적용, 새로운 화학의 테스트를 위한 라이트 프로토콜의 적응 이다. 두 번째는 혈액 식사를 통해 체계적으로 전달 하는 화학 물질의 평가 대 한 분석 결과 먹이.
Protocol
참고: 다음 프로토콜에서 설명 하는 모든 긴장 및 작업에 필요한 시 약 및 공급 업체는 자료의 테이블에에서 나열 됩니다.
1. 문화 모기의 애벌레와 성인
참고: 살충제 취약 변종 모기의 말라리아 연구 및 시 약 참조 저장소에서 사용할 수 있습니다. 종자는 다음과 같이 권장: Aedes aegypti 리버풀 (LVP) 스트레인, Anopheles gambiae 키 수 무 (KISUMU1) 긴장과 Culex quinquefasciatus 요하네스버그 (JHB) 스트레인.
- 12 h 주/12 h 밤에 계란에서 문화 모기 애벌레 25 c m x 40 c m 플라스틱 쟁반에 28 ° C와 75 ~ 85% 상대 습도 (RH)에 주기 (~ 400 애벌레 트레이 당) Nuss29에 의해 설명 된 대로. 피드 애벌레 지상 햄스터 (A. aegypti 및 An. gambiae) 또는 플레이크 물고기 음식 (C. quinquefasciatus). 애벌레의 분석에 대 한 세 번째 애벌레 (L3) 탈피 단계에서 애벌레를 수집 합니다.
- 위에서 설명한 조건 하에서 insectary에서 20 L 플라스틱 케이지 내부 플라스틱 컵을 전송 pupae에서 성인 모기 후면. 29설명 되어 있는 대로 20% 설탕 해결책에서 모기를 유지 합니다. 3-5 일 포스트 출현에서 성인 수집 합니다.
2. 애벌레 연락처 분석 결과 (단일 지점 복용량 또는 복용량 응답 분석 결과)
참고: 분석 결과 테스트 웰 스에서 DMSO의 최종 농도 1%를 초과 하지 않는 화학 물 또는 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 용 해는 함께 수행할 수 있습니다. 대체 용 매는 옵션을 수 있습니다 하지만 그것은 72 h 게시물 노출에서 10% 사망률 보다 더 먼저 최종 농도 발생 하지 않습니다 확인 필수. 단일 지점 복용량 또는 복용량 응답 분석 결과 분석 결과 수행할 수 있습니다. 후자를 수행 하는 경우 것이 좋습니다 농도 (5 최소)의 범위를 테스트를 걸친 예상된 LC50.
- 그림 1에서 보듯이 분명 24 잘 조직 격판덮개의 우물을 레이블을 지정 합니다.
- 1.5 mL 튜브에 테스트 화학의 재고 솔루션을 준비 합니다.
- 각 화학 분석 균형을 사용 하 여 무게 및 용 해도 특성에 따라 살 균 ddH2O, DMSO 또는 선택의 다른 적당 한 유기 용 매에서 중단 다시 ( 그림 2참조).
참고: 계산 한다 고려 화학의 순도. 예를 들어 99% 순수 화학에 대 한 1%의 솔루션을 얻기 위해 아세톤의 1000 µ L에서 10.1 mg을 디졸브. 파라핀 필름으로 밀봉 하 고-20 ° c.에 저장
- 각 화학 분석 균형을 사용 하 여 무게 및 용 해도 특성에 따라 살 균 ddH2O, DMSO 또는 선택의 다른 적당 한 유기 용 매에서 중단 다시 ( 그림 2참조).
- 평가 되 고 적절 한 용 매를 사용 하 여 재고 솔루션에서 직렬 희석에 따라 준비 테스트 화학의 최종 농도 결정 합니다.
참고: 농도 용 매와 화학의 볼륨 산출 될 수 있다 공식 C1을 사용 하 여 * V1= C2* V2 를 C1샘플 1, C2의 농도 = 샘플 2, V1의 농도 = =의 볼륨 1와 V2= 샘플 2의 볼륨. 그림 2 및 표 1에 표시 된 예에서는 계산을 참조 하십시오.- 원하는 테스트 농도 (표 1B)를 얻기 위해 필요한 10 m m 재고 솔루션 및 직렬 희석을 준비 합니다.
- 조직 문화 테스트 플레이트;의 우물 5 L3 애벌레 전송 넓은 구멍 플라스틱 전송 피 펫을 사용 하 여, L3 유 충은 길이 의해 인식 될 수 있다 (~ 2.5-3.5 m m)와 머리 캡슐의 폭 ~ 0.025 m m24. 부드럽게 1 mL 피 펫으로 물을 제거 하 고 ddH2O의 원하는 볼륨 (아래 참조)으로 바꿉니다. N를 반복 처리 (즉, 20 치료 당 총 애벌레) 당 4 기술 복제를 =.
- 24 잘 테스트 플레이트에 4 개의 복제 우물의 각 테스트 화학의 적절 한 볼륨을 추가 하 고 부드럽게 화학의 균일 한 혼합 되도록 접시 소용돌이. 일정 조건 하에서 테스트 또는 성장 챔버에 접시를 놓고 (예를 들어, 25 ° C와 ~ 75-85 %RH 것이 좋습니다, 그리고 어두운 12 h 빛/12 h 주기 가능한 경우).
참고: 재현성 실험 사이,에 대 한 후속 분석 같은 환경 조건 하에서 수행 됩니다 확인 합니다. - 30 분, 1, 각 잘에서 죽은/무응답 애벌레의 수를 기록 1.5, 2, 3, 24, 48 및 72 h 후 노출 (또는 대체 시간 점) 점수 시트 (표 2). 부드럽게 접시의 측면을 누릅니다. 아무 움직임을 관찰 하는 경우 부드럽게 살 균 이쑤시개와 유 충을 터치 합니다. "죽은" 도청/터치에 응답 하지 않는 애벌레를 점수.
참고: 다른 형태학과 행동 고기 관찰 될 수 있습니다 및 기록 될 수 있습니다. - 원하는 경우, 다음과 같이 수정 된 애 보트의 수식을 사용 하 여 제어 사망률에 대 한 수정.
사망률 (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
여기서 X = 치료 샘플, 그리고 Y % 사망률 컨트롤에서 백분율 사망률 =. - 결과 히스토그램 또는 그래프 패드 프리즘 6 또는 이와 유사한, 같은 선택의 소프트웨어를 사용 하 여 로그 곡선 그래프 그리고 컨트롤에 상대적인 치명적인 농도 (LC) 값을 계산.
- N를 모기의 별도 일괄 처리를 사용 하 여 분석 결과 반복 = 3 또는 더 생물 복제.
3. 성인 국 소 분석 결과 (단일 지점 복용량 또는 복용량 응답 분석 결과)
참고: 성인 국 소 분석 결과 용 매로는 아세톤을 사용 하 여 수행 됩니다. 대체 용 매는 옵션을 수 있습니다 하지만 그것은 먼저 최종 농도 발생 하지 않습니다 확인 필수 48 h 게시물 노출에서 10% 사망률. 단 하나 복용량 또는 복용량 응답 분석 결과 고 치 사 량 (LD)를 결정 하는 데 사용 되는 분석 결과 수행할 수 있습니다. 후자를 수행 하는 경우 것이 좋습니다 농도 (5 최소)의 범위를 테스트를 걸친 예상된 LD50.
- 분석 결과 완료 하는 데 필요한 성인 여성 모기의 수를 결정 합니다.
참고: 단일 화학 포인트 복용량 분석 결과 90 모기 (긍정적인 제어, 아세톤 전용 부정적인 제어를 위한 30 및 30 테스트 화학에 대 한 30)의 최소가 필요 합니다. - 5 일 된 성인 여성 모기에 3 문화 고 흡 인기 (그림 3)를 사용 하 여 별도 20 mL 플라스틱 양동이로 이동.
- 라벨 9 온스 종이 컵과 이름과 테스트 화학의 농도. 10 cm x 10 cm 메쉬 스퀘어와 각 컵에 대 한 고무 밴드를 따로 설정 ( 그림 4참조).
- (예를 들어, 합성 pyrethroid, bifenthrin) 긍정적인 컨트롤로 기존 살충제를 선택 하 고 아세톤에서 1% 재고 솔루션 (10 µ g / µ L)를 준비.
참고: 계산 한다 고려 화학의 순도. 예를 들어 99% 순수 화학에 대 한 1%의 솔루션을 얻기 위해 아세톤의 1000 µ L에서 10.1 mg을 디졸브. 파라핀 필름으로 밀봉 하 고-20 ° c.에 저장 - 위와 같은 절차를 사용 하 여, 테스트 화학의 재고 솔루션을 준비 합니다.
참고: 많은 테스트 화학은 매우 불안 정한, 그리고 솔루션 신선한 생물 검정 수행 됩니다 때마다 만들 수 선호 한다. - 긍정적인 통제의 직렬 희석을 준비 하 고 이전 아세톤으로 씻어 서 20 mL 유리 튜브를 사용 하 여 그림 5 와 같이 재고 솔루션에서 화학 테스트.
- 아세톤과 1 mL 유리 주사기를 제거, 아세톤과와 마이크로-주걱 배달 0.25 µ L의 볼륨 조정에 안전.
- 일괄 10 일, 3-5 일 오래 된 성인 여성 모기는 흡 인기를 사용 하 여 연습장에서 제거 하 고는 냉장고 나 얼음에 4 ° C에서 최대 5 분 동안 anesthetize. 다음으로, 최대 10 분 동안 얼음에 페 트리 접시를 모기 전송.
- 신속 하 게 작업, 정밀한 핀셋으로 단일 여성을 제거 하 고 테스트 솔루션의 0.25 µ L 주사기 마이크로-주걱을 사용 하 여 지 느 러 미 가슴에 적용. 각 모기를 해 현미경을 사용 하 여 관찰 하 여 화학의 배달 받는 테스트 화학의 적절 한 볼륨을 확인 합니다.
- 레이블이 지정 된 종이 컵, 얼음에 모기를 전송 하 고 n를 9 번 반복 = 10 대우 모기. (12 일/12 h 밤 사이클 바람직합니다 h)에 28 ° C와 75 ~ 85 %RH 일정 조건 하에서 플라스틱 욕조 또는 성장 챔버에 전송와 고무 밴드, 보안 메쉬 사각 컵에 모기를 봉인.
- 두 번 n를 얻으려면 위의 실험을 반복 치료 또는 컨트롤 그룹 당 3 기술 복제 (즉, 30 모기 총) =.
- 먼저 테스트 화학 그리고 긍정적인 통제와 단계 3.7-3.10을 반복 합니다.
참고: 다른 유용한 컨트롤 충분 한 모기를 사용할 수 있는 경우를 포함 하는 테스트 화학 또는 용 매에는 영향을 받지 않는 30 마 취 모기의 "빈". - 30 분, 60 분, 2, 24, 48 h 후 노출 "죽은/무응답" 모기의 수를 기록 (또는 대체 시간 점) 점수 시트 (표 3)을 사용 하 여. 누워 한쪽에 또는 뒤에 비행에 무 능력으로 그들은 이동의 부족을 표시 하는 경우 "죽은/무응답" 정의 된 모기를 점수.
- 원하는 경우, 다음과 같이 수정 된 애 보트의 수식을 사용 하 여 제어 사망률에 대 한 수정.
사망률 (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
여기서 X = 치료 샘플, 그리고 Y % 사망률 컨트롤에서 백분율 사망률 =. - 히스토그램 또는 지 수 곡선으로 결과 표시 합니다. 복용량 응답 분석 결과 대 한 LD50, LD75 또는 컨트롤을 기준으로 테스트 화학에 대 한 LD90 값을 계산 합니다.
- 분석 결과 n를 모기의 별도 일괄 처리를 사용 하 여 두 번 이상 반복 = 3 또는 더 생물 복제.
4. 성인 혈액 공급 분석 결과 (단일 지점 복용량 또는 복용량 응답 분석 결과)
- 수집 약 150 4-5 일 오래 된 성인 여성 모기 및 별도 케이지를 이전. 복용량 응답 분석 결과 수행 하는 경우 6 감 금 소를 반복 합니다. 설탕 1-24 h 전에 먹이 분석 결과의 소스를 제거 합니다.
- 화학 (전형적인 재고 솔루션은 물 또는 소금 버퍼에서 80 m m), 순도 대 한 회계, 위에서 설명한 대로 화학의 재고 솔루션을 준비 하 고 그 후 필요에 따라 물/버퍼에 직렬 희석을 준비.
- 원하는 테스트 농도를 defibrinated 토끼 혈액의 960 µ L를 각는 희석 40 µ L를 추가 합니다. 먹이 장치에 멤브레인 필름을 적용 하 고 고무 반지 물개. 혈액 1 mL 피 펫을 통해 전송 하 고 난방 장치에 먹이 장치를 연결 합니다.
- 부드럽게 막 표면으로 갓 면봉으로 성인 모기의 10% 젖 산 솔루션 및 장소 먹이 단위를 했다. 검은 천이나 검은 쓰레기 봉지 케이지를 커버 하 고 모기 한 시간에 대 한 피드를 허용 합니다.
- 테스트 솔루션 및 부정적인 (혈액 전용) 제어의 나머지 부분에 대 한 4.2-4.4 단계 반복 합니다.
- 먹이의 완료, 모기 anesthetize를 5 분 동안 냉장고에서 4 ° C에서 양동이 배치 합니다. 남성 모기와 여성 모기 먹이 비 제거 하 고 계산 하 고 먹이 부분적으로 복 부의 검사에 의해 모기 먹이의 총 수를 기록.
- 부분적으로 완전히 먹인된 여성 모기, 복용량 당 50 혈액 먹이 모기의 최소 목표를 유지 합니다.
- (12 일/12 h 밤 사이클 바람직합니다 h)에 28 ° C와 75 ~ 85 %RH 일정 조건 하에서 플라스틱 욕조 또는 성장 챔버에 양동이 전송.
- 0.5, 1, 1.5, 2, 24, 48에서 죽은/무응답 모기의 총 수를 기록 하 고 72 h (또는 원하는 대로 다른 시간-점) 점수를 사용 하 여 시트 (표 4).
- 3 일 게시물 혈액 먹이, 계란 컵으로 소개 하 고 72 h 동안 달걀을 수집. 치료 해 현미경 당 생산 계란의 총 수를 계산 합니다.
- % 사망률과 통치 각 치료 그룹 및 컨트롤에 대 한 먹이 모기의 총 수의 함수로 계산 합니다. 필요한 경우 수정 된 애 보트의 수식을 사용 하 여 제어 사망률에 대 한 수정.
- (해당 되는 경우는 복용량 응답 분석 결과 수행) 히스토그램 플롯 또는 지 수 곡선으로 독성과 통치 데이터 표시 선택의 소프트웨어를 사용 하 여. 복용량 응답 분석 결과 수행 하는 경우 LD50, LD75 또는 컨트롤을 기준으로 테스트 화학에 대 한 LD90 값을 계산 합니다.
- 분석 결과 n를 모기의 별도 일괄 처리를 사용 하 여 두 번 이상 반복 = 3 또는 더 생물 복제.
Representative Results
그림 6 은 L3 Ae aegypti 도파민 수용 체 길 항 제, 물에 비해 심 실의 5 개의 복용량에 노출 다음의 백분율 사망률 24, 48 및 72 h에 (부정적인) 제어. 이 예제에서 각 시간 포인트에서 수집 된 데이터 일반 로그 곡선을 표시 하 고 애벌레 사망률에 심 실의 복용량-의존 효과 공개. LC50 값은 실험의 시간 동안 감소와 72 h 데이터 (즉, 로그 미적 곡선의 중간점)을 사용 하 여 계산할 수 있다.
그림 7 에 3-5 일 된 성인 여성 Ae aegypti 의 백분율 사망률의 도파민 수용 체 길 항 근, 심 실 및 합성 pyrethroid 비해 400 µ M 복용량 (10 µ g / µ L)에 노출 다음 bifenthrin-긍정적인 제어 (기술 급료; 500 pg / µ L), 아세톤 전용 부정적인 제어 및 치료 모기 (비어 있음). 이 예제에서는 심 실 및 bifenthrin 부정적인 컨트롤에 상대적인 중요 한 성인 사망률을 발생할. 참고 성인 사망률은 아마도 테스트 화학의 대사 해독으로 인해 시간이 지나면서 감소 합니다.
그림 8 표시 3-5 일 오래 된 성인 여성의 백분율 사망률 (왼쪽된 y 축) Ae aegypti 먹이 도파민 수용 체 길 항 제, 심 실, 그리고는 통치의 4 개의 복용량의 치료는 혈액 식사 (오른쪽 y 축; 평균 계란 수 / 여성) 제어 모기에 비해 첫 번째 gonotrophic 주기 게시물 노출 (혈액만 먹이, 부정적인 컨트롤). 데이터는 컨트롤에 상대적인 성인 사망률에 심 실의 큰 영향 없다 하지만 심 실은 크게 높은 복용량 (400 µ M)에서 통치를 증가 입증입니다 공개.
그림 1 . 애벌레 복용량 응답 분석 결과. 이미지 보여주는 애벌레 복용량 응답 분석 결과 24-잘 접시에서 Aedes aegypti L3 유 충을 사용 하 여 수행의 설정.
그림 2 . 표시 설정에 대 한 절차는 (A) 단일 지점 복용량 또는 (B) 복용량 응답 애벌레 분석 결과의 24-잘 접시에 도식. 5 L3 애벌레의 웰 스 전송, 다음 과잉의 물은 부드럽게 제거 피 펫을 통해 하 고 대체 신선 하 고 살 균 ddH2o. 다음, 재고 및 테스트 화학의 직렬 희석 준비는 고 1 mL/잘의 마지막 볼륨에 추가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 성인 모기의 문화. 이미지 표시 20 L 플라스틱 물통 성인 모기의 문화와 흡 인기의 사용에 대 한 모기. 을 제거 하는 데 사용
그림 4 . 4-5 일 오래 된 여성을 사용 하 여 수행 하는 성인 국 소 분석 결과 Aedes aegypti. 화학 다음 치료 또는 용 매, 성인 모기 종이 컵에 배치 하 고 분석 결과의 기간에 대 한 테스트 챔버로 전송 됩니다.
그림 5 . 재고 및 직렬 희석. (A) 재고의 준비에 대 한 절차 및 성인 국 소 분석 결과 대 한 (B) 직렬 테스트 솔루션을 보여주는 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 . 애벌레 연락처 복용량 응답 분석 결과에서 대표적인 데이터. 도파민 수용 체 길 항 제, 24, 48 및 72 h에 심 실에 노출 다음 Aedes aegypti L3 유 충의 % 사망률을 보여주는 애벌레 연락처 복용량 응답 분석 결과에서 대표적인 데이터입니다. 각 데이터 요소 나타냅니다 의미 µ M ± SEM. 데이터 대표 n = 3 생물 복제.
그림 7 . 성인 국 소 복용량 응답 분석 결과에서 대표적인 데이터. 도파민 수용 체 길 항 근, 심 실 (10 µ g / µ L) 3-5 일의 독성을 보여주는 성인 국 소 복용량 응답 분석 결과에서 대표적인 데이터 합성 pyrethroid, bifenthrin (500 pg / µ L) 긍정적인 상대적으로 오래 된 여성 Aedes aegypti 제어)과 부정적인 2, 24 및 48 h. 에서 제어 (아세톤 차량에만) 데이터를 나타내는 n = 3 생물 복제. 오차 막대 표시 SEM.
그림 8 . 성인 섭취 분석 결과에서 대표적인 데이터. 대표적인 데이터 도파민 수용 체 길 항 제, 심 실 100 µ M의 200 µ M와 400 µ M에서의 독성을 보여주는 성인 섭취 분석 결과를 3-5 일 복용 오래 된 성인 여성 Aedes aegypti 와 통치 (평균 총 계란으로 표현에 미치는 영향 세 여성 당 첫 번째 gonotrophic 사이클 동안). 데이터를 나타내는 n = 3 생물 복제 ± SEM.
| A. 3 화학으로 단일 지점 복용량 분석 실험 | |||||
| 화학 | 농도 (400 uM) | ||||
| 심 실 | 심 실 X 98% (분말의 순도) 0.001 g/1 m g X 1 mol /313.86 g X 1 L/0.08 mol X 106 µ L/L X 80 m m 재고: 2 밀리 그램의 물 78.06 µ L =. | ||||
| 직렬 희석: 재고 1: ddH2O 2와 1:4 10 m m를 달성 하기 위해 희석. 잘 포함 하는 ddH2400 µ M/잘의 최종 농도 달성 하기 위해 0의 960 µ L를 10 m m 재고 40 µ L를 추가 합니다. 10 m m 재고 1:2 5 m m, 2.5 m m, 1.25 m m 및 0.625 m m 주식 직렬 희석을 준비 합니다. | |||||
| Cis-(z)-flupenthixol | cis (z) flupenthixol X 98% (의 분말 순도) 0.001 g/1 m g X 1 mol/507.44 g cis (z) flupenthixol X 1 L/0.08 mol X 106 µ L/L X 80 m m 재고: 2 밀리 그램의 물 48.28 µ L =. | ||||
| 직렬 희석: 위에서 마찬가지로입니다. | |||||
| Amitraz | Amitraz X amitraz X 1 L/0.08 mol X 106 µ L/1 L의 0.001 g/1 m g X 1 mol/293.4 g의 80 m m 재고: 2 mg DMSO의 85.21 µ L = (참고: Amitraz는 DMSO에 용 해). | ||||
| 직렬 희석: 위에서 마찬가지로입니다. | |||||
| B. 복용량 응답 분석 결과 | |||||
| 화학 | 복용량 1 | 복용량 2 | 복용량 3 | 복용량 4 | 복용량 5 |
| 400 Μ M | 200 Μ M | 100 Μ M | 50 Μ M | 25 Μ M | |
| 예를 들어, 심 실, cis-(Z)-flupenthixol 또는 amitraz | 40 Μ L | 40 Μ L | 40 Μ L | 40 Μ L | 40 Μ L |
| 10 m m 재고 | 5 m m 재고 | 2.5 m m 재고 | 1.25 m m 재고 | 0.625 m m 재고 | |
표 1입니다. 대 한 예를 들어 계산 Aedes aegypti L3 애벌레 (A) 단일 점을 복용량 분석 결과 (B) 복용량 응답 분석 결과.
표 2입니다. 모기 애벌레 복용량 응답 분석 결과에서 레코드 데이터에 사용 되는 예제 점수 시트. 제어, 물 전용 또는 1 %DMSO 나만 다른 용 매와 물. 작은 분자 적 화학 심 실 등을 테스트 하는 데 사용 하는 일반적인 복용량 있습니다 25 µ M, 50 µ M, 100 µ M, 200 µ M 및 400 µ M.
| 모기 성인 (3-5 일 이전) 국 소 분석 결과 | ||||||
| 시작 날짜: | ||||||
| 탐정: | ||||||
| 종/스트레인: | ||||||
| 시험의 종류: 단일 지점 복용량/복용량 응답 | ||||||
| A. 사망 (제 죽은 모기) | ||||||
| 시간 (시간) | 복용량 1 | 복용량 2 | 복용량 3 | 복용량 4 | 복용량 5 | 제어 |
| 0.5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
| B. % 사망률 | ||||||
| 시간 (시간) | 복용량 1 | 복용량 2 | 복용량 3 | 복용량 4 | 복용량 5 | 제어 |
| 0.5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
표 3. 성인 국 소 복용량 응답 분석 결과에서 레코드 데이터에 사용 되는 예제 점수 시트.
| 분석 결과 섭취 모기 성인 (3-5 일 이전) | ||||||
| 시작 날짜: | ||||||
| 탐정: | ||||||
| 종/스트레인: | ||||||
| 시험의 종류: 단일 지점 복용량/복용량 응답 | ||||||
| A. 번호 모기 먹이 | ||||||
| 복용량 1 | 복용량 2 | 복용량 3 | 복용량 4 | 복용량 5 | 제어 | |
| 먹이 | ||||||
| 안 연 준 | ||||||
| 총 | ||||||
| % 연 준 | ||||||
| % 안 연 준 | ||||||
| B. 사망률 (제 죽은 모기) | ||||||
| 시간 (시간) | 복용량 1 | 복용량 2 | 복용량 3 | 복용량 4 | 복용량 5 | 제어 |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
| C. % 사망률 | ||||||
| 시간 (시간) | 복용량 1 | 복용량 2 | 복용량 3 | 복용량 4 | 복용량 5 | 제어 |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
표 4입니다. 성인 혈액 공급 분석 결과에서 레코드 데이터에 사용 되는 예제 점수 시트. 작은 분자 적 화학 심 실 등을 테스트 하는 데 사용 하는 일반적인 복용량 있습니다 400 µ M, 200 µ M, 100 µ M, 50 µ M.
Discussion
살충제는 말라리아25, 뎅기열 등 Zika26모기 품 어진 질병에 대처 하기 위해 강력한 도구입니다. 광범위 한 살충제 사용 그 저항 화학 제어, 살충제 저항을 하나의 가장 큰 위협 이라고 여겨지는의 개발으로 이어지는 계속 질병 통제 모기 인구를 생산 하고있다. 지난 10 년간은 Anopheles 합성 pyrethroids (SPs) 아프리카7침대 그물에 사용을 저항 하는 종의 인구에 있는 극적인 증가 보았다. 인구 Aedes albopictus 뎅기열의 벡터와 Zika, 플로리다와 뉴저지 저항 organophosphates6에서 보고 되었습니다. 마찬가지로, DDT와 pyrethroids 콜롬비아27,28 Anopheles 고 Aedes 종의 인구에서 문서화 되었습니다. 새로운 larvicides 및 다양 한 orthosteric를 바인딩할 adulticides를 개발 하는 긴급 한 필요가 있다 또는 알려진된 분자 표적 또는에 allosteric 사이트 새로운 목표 (즉, 소설 모아 화학)29,30 을 방해 하 고 최소한의 환경 영향을. 또한 모기 제어31,,3233endectocides 주위 잠재력을 인식을 증가 이다.
같은 제품의 신속한 개발을 촉진 하기 위하여 우리는 모기 애벌레와 어른 두 배달 경로-접촉 및 섭취를 통해 작은 분자 화학 물질의 독성을 평가 하기 위해 설계 된 프로토콜의 일련을 설명 합니다. 시험 된 WHO 및 CDC 병 분석 같은 프로토콜은 일반적인 독성과 기존 insecticidal 공식1,2의 repellency를 평가 하기 위해 사용 합니다. 그러나, 이러한 분석 unformulated 새로운 화학 엔티티 (NCEs)의 분석에 대 한 제한이 및 다 수 화학의 중간 또는 높은 처리량 테스트 의무가 없습니다.
여기는 높은 처리량 분석에 대 한 확장할 수 있는 단일 지점 복용량에 NCEs를 빠르게 평가 하는 표준 애벌레 분석 결과 설명 합니다. 우리는 또한 성인 모기에 작은 분자 화학의 접촉 독성을 평가 하기 위해 라이트21 에 의해 개발 된 분석 결과의 adaption을 설명 합니다. 마지막으로, 우리 NCEs 성인 여성의 모기가 혈액 식사를 통해 전달의 독성을 평가 하기 위해 섭취 분석 결과 설명 하 고 잠재적인 endectocide를 탐험. 이 애벌레와 성인 분석 각각, LC 및 LD 값을 결정 하기 위하여 복용량의 범위에서 수행할 수 있습니다 그리고 하나 이상의 기존 화학 공식에 비해 애벌레와 성인 연락처 분석을 수행할 수 있습니다. 성인 국 소 분석 결과 또한 개별 모기 당 LD 값의 계산을 수 있습니다. 프로토콜은 Anopheles, Aedes와 Culex16,29 의 종을 사용 하 여 수행할 수 있습니다 하 고 원하는 경우 종족, 특정 생물 학적 특성에 맞게 수정할 수 있습니다. 우리의 경험에서는, mosquitocidal 화학은 일반적으로이 3 속16,29일에 걸쳐 광범위 한 활동을 전시 하지만 종족 선택도의 평가 값.
분석 실험은 빠르게 insecticidal 활동에 대 한 여러 화학을 스크린 하는 출발점. 하나 이상의 분석 실험에서 독성을 전시 하는 그 화학 두번째와 분석 실험을 통해 추가 분석에 대 한 선택 수 있습니다. 예로 라이트 tarsal 분석 결과 및 분석34,35먹이 설탕 있습니다. 추가 분석 실험의 선택은 일반적으로 가능한 제품 배달 모드에 통찰력을 제공 하는 결과 함께 예상된 시장 및 응용 프로그램 고려 사항에 의해 결정 됩니다. 여기에 표시 된 대표적인 결과에서 우리가 탐험 심 실, 소설 모아 살충제10,12, 로 가능성에 대 한 평가 포유류와 무척 추 동물 도파민 수용 체의 한 적의 독성 13 , 16. 애벌레와 성인 Ae aegytpi 의 μ g 범위 제안에 larvicidal 및 adulticidal 활동, 및 심 실 기반 화학 시리즈의 탐사에 대 한 근거를 제공 식별 하는 독성을 전시 하는 심 실 높은 힘과 아날로그입니다. 사망 또는 통치에 중요 한 영향을 주지는 Ae aegypti 혈액 식사에 심 실에 노출에서 관찰 되었다. Defibrinated 피에 효과적인 복용량 모기 당 받은 화학 안정성을 알 수 없습니다 하는 동안 분석 결과의 주목할 만한 제한 데이터 제안는 심 실 및 다른 GPCR 활성 화합물 있을 수 있습니다 약간 가능성으로 endectocides에 적어도 unformulated 상태입니다.
분석 실험 사이 생물 학적 변화를 제한 하는 조치는 필수적입니다. 모든 분석 실험은 재현성을 보장 하기 위해 온도 습도, 곤충 성장 챔버에 선호의 표준 조건 하에서 수행 되어야 합니다. 이 데이터에서 중요 한 변화를 선도 다른 실험실 직원에 의해 기록 된, 매우 주관적 일 수 있다 phenotypic 종점 득점을 위한 절차를 표준화 하는 것이 필수적입니다. 애벌레 분석 결과 분석 결과 최종 농도 잘 당 미만 1 %DMSO 같은 유기 용 매를 사용 하 여 수행할 수 있지만, 물에 용 해 되는 화학 물질의 평가에 가장 적합 하다. 당사 성인 국 소 분석 결과를 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, 직렬 희석을 준비 하는 때 급속 하 게 작동 하는 데 필요한 이며 배달 캐리어 (아세톤) 높은 휘발성 증발의 화학 변화를 생산할 수 있습니다으로 복용량을 제공 합니다. 둘째, 관리가 사망률에 기여할 수 있다 마 취의 기간을 제한 하려면 취해야 한다. 또한 아세톤과 같은 용 매 테스트 화학 인 효과와 혼동 하지 말아야 하는 국 소 분석 결과의 처음 몇 시간에서 급속 한 "노크 다운" 효과 생산할 수 있는 주목 한다. 우리 주의 모기 혈액 식사의 볼륨 개인 사이, 받은 성인 섭취 분석 결과에서 성인 복용량의 평가 복잡 하 게 변화 한다. 마지막으로, 분석 결과 데이터 하지 부정적인 컨트롤에 사망률 10%를 초과 하는 경우에 고려 한다.
제품을 공동 성으로 행동은 점점 기존 제품의 유틸리티를 확장 하 고 저항 하는 살충제 유해물 인구15,,1636의 제어를 제공 하는 그들의 잠재력에 대 한 인식 됩니다. 애벌레 분석 formamidine 살충제, amitraz 및 무척 추 동물 octopamine 수용 체14,15를 방해 하는 화학 물질의 다양 한 성분 검사에 사용 되었습니다. 애벌레의 분석 결과 및 설명 성인 국 소 분석 결과 테스트 화학의 조합 사이 시너지 또는 첨가제 효과 평가 적합 합니다. 우리 주의 synergists piperonyl butoxide (PBO) 등이 여기에 설명 된 세 가지 분석 실험의 각에 통합 될 수 있다.
위에 설명 된 분석 물 및 지상파 모기 생활 단계에 대 한 unformulated, 작은 분자 약물의 평가 대 한 표준화 실험 시리즈를 제공합니다. 이 분석 실험은 독성을 평가 하 고 기존에 몇몇 이점을 분석 공통 사용 실험 제공을 특별히 설계 되었습니다. 중요 한 것은,는 분석 자동화 의무가 있으며 평가 시험 화합물의 수천 수 있도록 산업 규모에서 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 분야 새로운 MoAs를 통해 작동 하는 제품의 개발을 고려, 새로운 분자 표적 및 생 화 확 적인 통로의 방해를 통해 포함 하 여 있을 것입니다 사망 등 그 외 여러 phenotypic 끝점 점수 필수 고 마비입니다. 위의 분석 허용 그런 수사, 내일의 매우 혁신적인 insecticidal 기술 향한 단계를 제공 합니다.
Disclosures
저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.
Acknowledgments
저자 H. Ranson, 리버풀 학교 열 대 의학의 분석 결과 개발 및 라이트 프로토콜의 제공에 대 한 감사 및 분석에 관한 조언을 퍼듀 대학교, M. Scharf 디자인.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insecticide susceptible mosquito strains | Malaria Research and Reagent Reference Repository | https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain | |
| Acetone | Mallinckrodt Chemical | CAS 67-64-1 | Use for dilutions and control |
| Amitraz | Sigma-Aldrich | CAS 33089-61-1 | Requires dilution in DMSO |
| Amitriptyline | Sigma-Aldrich | CAS: 549-18-8 | Can be diluted in acetone |
| Bifenthrin | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Synthetic pyrethorid used as positive control |
| Cis-(Z)-flupenthixol | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors |
| Defibrinated rabbit blood | Hemostat | DRB0100 | Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | MKBF2985 | Organic solvent used to disolve amitraz |
| Hemotek membrane feeding system | Hemotek Ltd | Serial no. 1303 | Used for feeding mosquitoes |
| Micro-applicator | Burkard Manufacturing Co. | - | Tool needed for topical application experiments |
| 24-well cell culture plate with lid | Corning Incorporated | 3526 | - |
| Advantage rubber bands | Alliance Rubber Co. | - | Used to seal the paper cups |
| Glass syringe (1 ml) | Becton Dickinson and Co. | 512004 | Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic |
| Disposable scintillation vials (20 ml) | Fisher Scientific | 74505-20 | Glass vials prevent evaporation |
| Tulle fabric, white | Walmart | - | - |
| Paper cups | Dixie Consumer Products LLC. | PF15675/13D | Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays |
| Petri dishes (150 mm) | Corning Life Sciences | - | Used to maintain the mosquitoes "slept" on cold without direct contact with ice |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | Used to sort larvae |
| Stereo microscope | Olympus | SZ6045 | Used to score larval assays and perform micro-applications |
| Tweezers (fine) | Fontax | - | Used to handle adult mosquitoes |
References
- World Health Organization. A global brief on vector-borne diseases. , Available from: www.who.int/about/Licensing/copyright_form/en (2014).
- World Health Organization. Vector-borne diseases. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs387/en (2016).
- World Health Organization. Report by the Secretariat. Neglected tropical diseases; Prevention, control, elimination and eradication. , Available from: http://www.who.int/neglected_diseases/A66_20_Eng.pdf (2013).
- Tolle, M. A., et al.
- Chen, C. D., et al. Dengue vectors surveillance in endemic areas in kuala lumpur city centre and selangor state, malaysia. Dengue Bulletin. 30, (2006).
- Marcombe, S., et al. Insecticide resistance status of united states populations of Aedes albopictus and mechanisms involved. PLoS ONE. 9 (7), e101992 (2014).
- Ranson, H., et al. Pyrethroid resistance in African anopheline mosquitoes: what are the implications for malaria control? Trends in Parasitology. , 1-8 (2010).
- Hemingway, J., Ranson, H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annual Review of Entomology. 45, 371-391 (2000).
- Hemingway, J., Beaty, B. J., Rowland, M., Scott, T. W., Sharp, B. L. The Innovative Vector Control Consortium: improved control of mosquito-borne diseases. Trends in Parasitology. 22 (7), 308-312 (2006).
- Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: Pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D 1-like dopamine receptors. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6 (1), e1478 (2012).
- World Health Organization. Instructions for determining the susceptibility or resistance of mosquito larvae to insecticides. , Available from: http://apps.who.int/iris/handle/10665/69615 (1981).
- Hill, C. A., et al. Re-invigorating the insecticide discovery pipeline for vector control: GPCRs as targets for the identification of next gen insecticides. Pestide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 141-148 (2013).
- Conley, J. M., et al. Evaluation of AaDOP2 Receptor antagonists reveals antidepressants and antipsychotics as novel lead molecules for control of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeautics. 352 (1), 53-60 (2015).
- Ahmed, M. A. I., Matsumura, F. Synergistic actions of formamidine insecticides on the activity of pyrethroids and neonicotinoids against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 49 (6), 1405-1410 (2012).
- Ahmed, M. A. I., Vogel, C. F. A. Synergistic action of octopamine receptor agonists on the activity of selected novel insecticides for control of dengue vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) mosquito. Pesticide Biochemistry and Physiology. 120, 51-56 (2015).
- Hill, C. A., et al. Comparative pharmacological characterization of D1-like dopamine receptors from Anopheles gambiae, Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus suggests pleiotropic signaling in mosquito vector lineages. Parasites Vectors. 9 (1), 192 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for evaluating insecticide resistance in vectors using the CDC bottle bioassay. , Available from: https://www.cdc.gov/malaria/resources/pdf/fsp/ir_manual/ir_cdc_bioassay_en.pdf (2011).
- World Health Organization. Test procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vector mosquitoes. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/250677/1/9789241511575-eng.pdf (2013).
- Geneva: World Health Organization. Guidelines for efficacy testing of insecticides for indoor and outdoor ground-applied space spray applications control of neglected tropical diseases who pesticide evaluation scheme. , Available from: http://www.who.int/iris/handle/10665/70070 2-53 (2009).
- Pridgeon, J. W., et al. Susceptibility of Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus Say, and Anopheles quadrimaculatus Say to 19 pesticides with different modes of action. Journal of Medical Entomolog. 45 (1), 82-87 (2008).
- Liverpool Insect Testing Establishment. , Available from: http://www.lite-testing-facility.com (2018).
- Aïzoun, N., et al. Comparison of the standard WHO susceptibility tests and the CDC bottle bioassay for the determination of insecticide susceptibility in malaria vectors and their correlation with biochemical and molecular biology assays in Benin, West Africa. Parasites Vectors. 6, 147 (2013).
- Owusu, H. F., Jančáryová, D., Malone, D., Müller, P. Comparability between insecticide resistance bioassays for mosquito vectors: time to review current methodology? Parasites Vectors. 8, 357 (2015).
- Savignac, R., Maire, A. A simple character for recognizing second and third instar larvae of five Canadian mosquito genera (Diptera: Culicidae). , (1981).
- Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. eLife. 4, 174 (2015).
- Zaim, M., et al. Alternative insecticides: an urgent need. Trends in Parasitology. 18 (4), 161-163 (2002).
- Fonseca, I., Quinoñes, M. L. Resistencia a insecticidas en mosquitos (Diptera: Culicidae): mecanismos, deteccion y vigilancia en salud publica. Revista Colombiana de Entomologia. 31 (2), 107-115 (2005).
- Fonseca-Gon Alez, I., Qu, M. L., Lenhart, A., Brogdon, W. G. Insecticide resistance status of Aedes aegypti (L.) from Colombia. Pest Management Science. 67, 430-437 (2011).
- Nuss, A. B., et al. Dopamine receptor antagonists as new mode-of-action insecticide leads for control of Aedes and Culex mosquito vectors. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 1-19 (2015).
- Shidrawi, G. R. A WHO Global Programme for monitoring vector resistance to pesticides. Bulletin of the World Health Organization. 68 (4), 403 (1990).
- Sylla, M., Kobylinski, K. C., Foy, B. D. Gates grand challenges explorations award: endectocides for controlling transmission of mosquito-borne diseases. Malariaworld Journal. 4 (5), (2013).
- Foy, B. D., Kobylinski, K. C., da Silva, I. M., Rasgon, J. L., Sylla, M.
- Chaccour, C. J., et al. Ivermectin to reduce malaria transmission: a research agenda for a promising new tool for elimination. Malaria Journal. 12 (1), 153 (2013).
- Olson, D. M., Fadamiro, H., Lundgren, J. G., Heimpel, E. Effects of sugar feeding on carbohydrate and lipid metabolism in a parasitoid wasp. Physiol Entomol. 25, 17-26 (2000).
- World Health Organization. Report of the WHO Informal Consultation. Evaluation and testing of insecticides. , Available from: http://www.who.int/whopes/resources/ctd_whopes_ic_96.1/en/ (1996).
- Huang, Q., Deng, Y., Zhan, T., He, Y. Synergistic and antagonistic effects of piperonyl butoxide in fipronil-susceptible and resistant rice stem borrers, Chilo suppressalis. Journal of Insect Science. 10, 182 (2010).
