Summary
Bu tek molekül floresans in situ hibridizasyon Protokolü bitkisel büyüme ve mayoz sırasında RNA molekülleri mayası sayısını ölçmek için optimize edilmiştir.
Abstract
Tek molekül floresans in situ hibridizasyon (smFISH) gen ekspresyonu nedeniyle algılayıp bireysel RNA molekülleri saymak için onun yetenek tek kişilik hücrelerde çalışma için güçlü bir tekniktir. Derin-dayandırılmış yöntemleri için tamamlayıcı, smFISH hücre hücre varyasyon transkript bolca ve belirli bir RNA'ın hücre altı yerelleştirme hakkında bilgi sağlar. Son zamanlarda, NDC80 gen ifade mayası mayoz sırasında çalışmaya smFISH kullanmış, hangi iki transkript izoformlarının adlı biri yok ve tüm onun sırası ile uzun izoformu paylaşılan kısa transkript izoformu vardır. Güvenle her transkript izoformu tanımlamak için bilinen smFISH iletişim kuralları en iyi duruma getirilmiş ve yüksek tutarlılık ve kalite tomurcuklanma sırasında alınan örnekleri için smFISH veri elde Maya mayoz. Burada, en iyi duruma getirilmiş bu iletişim kuralı olup kaliteli smFISH veri elde edilir ve bu iletişim kuralı diğer maya suşları ve büyüme koşulları uygulamak için bazı ipuçları belirlemek için kullandığımız ölçütleri açıklanmaktadır.
Introduction
Dinamik, düzenleme, Gen ifadesinin bir organizma gibi çevresel stres, enfeksiyon ve değişiklikler onun yanıt gelişimi metabolizmasında kullanıyor. Transkripsiyon regülasyonu odak çalışmaları RNA bereket ölçen teknolojilerine güveniyor. Böyle bir yöntem tek molekül floresans in situ hibridizasyon (smFISH) olarak adlandırdığı bireysel RNA molekülleri tek hücreler1,2tespiti için kullanılır. Bu yöntem, hücre hücre değişkenlik gen ekspresyonu ölçümü ve hücre içi RNA yerelleştirme belirlenmesi sağlar.
En sık kullanılan smFISH teknikte bireysel bir RNA molekülü tespiti hedef RNA tamamlayıcı ve aynı floresan boyalar için Birleşik birden çok kısa DNA prob (genellikle ~ 48 20-mer probları) gerektirir. Tek bir floresan sonda bağlama sinyali zayıf sonuçlar, ancak tüm probları topluluğu sinyalini sağlamdır. Tek bir sonda hedef kapalı bağlama sergi olsa bile, böyle sinyal çok zayıf olarak hedef RNA molekülü3kıyasla beklendiği için bu özellik sinyal-gürültü oranı büyük ölçüde artırır. İçinde hata algılama RNA molekülleri sayısı sayılır ve çeşitli büyüme koşullarında ve farklı mutantlar arasında göre.
İlk gelişimi beri smFISH gen ifade4,5,6,7 patlama transkripsiyon Uçbirleştirme transkripsiyon uzama1,gibi2, çeşitli yönlerini incelemek için uyarlanmıştır , 8 , 9, hücre içi allelic ifade10,11,12ve RNA yerelleştirme13,14,15. Son zamanlarda, hangi aynı genin iki transkript izoformlarının ifade eğitim için bu yöntemi kullandık kısa transkript izoformu (NDC80ORF) vardır onun tüm sıra uzun izoformu (NDC80luti ile paylaştı )16. İki mRNA izoformlarının benzersiz olarak tanımlamak için biz iki yoklama kümesi kullanılır: bir set NDC80lutibenzersiz sırasını belirli ve diğer küme başka bir floresan boya, Birleşik, iki izoformlarının ortak bölgesine bağlar. NDC80luti RNA colocalized bir yer her iki floresan sinyali ile ise tanımlanan NDC80ORF RNA biri sadece sinyal ortak soruşturma kümesinden içerir. Sayısı beri NDC80ORF transkript sonda hibridizasyon, yüksek verim ve yüksek sinyal gürültü oranı güvenle smFISH noktalar tanımlamak ve hata azaltmak gerekli "çıkarma" yöntemine göre hesaplanır yayma.
Bu kağıt tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaesmFISH gerçekleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı, cep numarası, fiksasyon süresi, sindirim süresi, sindirim arabellek, sonda konsantrasyon ve hibridizasyon içinde smFISH deneyler için kullanılan arabellek en iyi duruma getirilmiş S. cerevisiae geçiren SK1 zorlanma arka için bitkisel büyüme veya mayoz. Ancak, aynı zamanda bu el yazması Not: resim alma ve (2) ek optimizasyon farklı zorlanma arka planlar ve büyüme koşulları için gerektirebilir Protokolü adımları sonra smFISH verilerin kalitesini kontrol etmek için (1 yöntemi.
Protocol
Not: Tüm tamponları ve bu protokol için kullanılan ortamı Tablo 1' de listelenmiştir. Satıcı bilgileri reaktifleri için Malzemeler tablolistelenir.
Gün 1/1-2 gün:
Not: bitkisel kültür için 0.4-0.6 tercih edilen bir ortamda, bir OD600 hücrelerin büyümesine. Segregasyonun kültür için hücreleri (genellikle bir OD600 itibaren 1.85 içinde kültür) tercih edilen bir yöntemle mayoz geçmesi için ikna etmek.
1. örnek fiksasyon ve sindirim
- ~3.5 OD%600 3 formaldehit hücrelerinin toplam düzeltmek.
- Bitkisel kültür için 480 µL % 37 formaldehit 15 mL konik tüpler kültürünün 5.52 mL ekleyin.
- Segregasyonun kültür için 160 µL % 37 formaldehit 2 mL microcentrifuge tüpler 1840 µL kültürünün ekleyin. ~ 5 kat için ters çevir'i karıştırın.
Uyarı: Toksik formaldehit. İdare ve kurumsal düzenlemelere göre atmayın.
- Tüpler bir silindir davul oda sıcaklığında 20 dakika yerleştirin. Segregasyonun örnekleri,-20 dk, oda sıcaklığında sabitleme sonra gecede 4 ˚C sabitleme devam etmek için döner.
Not: Gece fiksasyon tekrarlanabilirlik ve segregasyonun örnekleri için elde edilen smFISH verilerin kalitesini artırır. Fiksasyon zaman optimize edilmelidir. - Örnekler tespit ederken, 200 mM Vanadyl Ribonucleoside kompleksleri (VRC), en az 10 dk 65 ˚C çözülme.
- Sindirim ana karışımda 15 mL Tüp hazırlayın: 1 örnek için arabellek b 425 µL 200 mM (65 ˚C ısındı); VRC 40 µL ile karıştırın. 5 örnekleri için 2125 µL arabellek b 200 µL 200 mm (65 ˚C ısındı) VRC ile karıştırın. Açık kahverengi yeşil VRC eklenmesinden sonra görünür ana karışıma eklemeden önce VRC tam olarak resuspend için girdap ~ 5 s.
Not: VRC eklenmesi sırasında sindirim smFISH sonuçları, tutarlılığını potansiyel olarak ham özü saf zymolyase karışımı tarafından tanıtıldı nükleaz kirletici engelleyerek iyileştirir. Bu adımda gerekli VRC miktarı optimize edilmelidir. - Bitkisel örnekleri için ~ 1057 x g 3 dk de tüpler santrifüj kapasitesi. Segregasyonun örnekleri (sonra gece fiksasyon) için 1,5 dk. Decant 21.000 x g, santrifüj kapasitesi veya süpernatant formaldehit atık için Aspire edin.
Not: Oda sıcaklığında tüm Santrifüjü adımlar gerçekleştirilir. - 1.5 mL soğuk arabellek b hücreleri yukarı ve aşağı pipetting veya tüplerin ters çevirme ve karıştırmak için flicking resuspend. Bitkisel örnekleri 2 mL tüpler için resuspension sonra aktarın.
- 1.5 dakika süreyle santrifüj 21.000 x g de kaldırmak sıvı dökme vakum aspirasyon veya pipetting, ~ 100 µL bırakarak.
- 1.5 mL soğuk arabellek b hücreleri resuspend
- 1.5 dakika süreyle santrifüj 21.000 x g de kaldırmak sıvı dökme vakum aspirasyon veya pipetting, ~ 100 µL bırakarak.
- Hücreleri 21.000 x g de 1,5 dk. aspiratı soğuk arabellek B. santrifüj 1,5 ml sıvı vakum tamamen veya pipetting resuspend.
- Sindirim ana mix ve kısaca resuspend girdap 425 µL hücrelerde resuspend. 100T 10 mg/mL zymolyase 5 µL her tüp için ekleyin.
Not: Girdap önce tüpler için ekleme her zaman zymolyase. Zymolyase ana karışıma eklemek yerine her tüp için ayrı ayrı ekleyin. Her iki adım zymolyase hızlı bir şekilde precipitates çünkü tüpleri arasında sindirim tutarlılığı korumaya yardımcı olmak. - Girdap 2-3 s karıştırmak için. Tüpler silindir davulunun üstündeki yerleştirin ve 15-30 dk 30 ˚C, sindirmek. Bitkisel hücreleri ve erken segregasyonun aşamaları, genellikle ~ 15 dk sürer ve segregasyonun profaz ve segregasyonun bölümler için genellikle ~ 30 dakika sürer.
Not: mikroskobunun her 5 dk 15 dk sonra denetleyin ve saydam olmayan ve Refraktif ~ %80 hücre görünür sindirim durdurur. Şu andan itibaren çok kırılgan hücrelerdir. Hücreleri nazikçe işlemek ve vakum aspirasyon ya da vortexing kullanmayın. - Tüpler ~ 376 x g 3 dk. Kaldır, sıvı tamamen pipetting tarafından santrifüj kapasitesi.
- Yavaşça yukarı ve aşağı 1 - 2 kez için pipetting tarafından arabellek b 1 mL içeren hücreleri resuspend karıştırın.
- ~ 376 x g 3 dk. Kaldır Tampon B sıvı, tüpler santrifüj kapasitesi pipetting tarafından. Yavaşça 1 mL % 70 etanol (RNase free su ile seyreltilmiş) hücrelerde resuspend.
- Oda sıcaklığında 3,5-4 saat için kuluçkaya.
2. hibridizasyon
- Formamide oda sıcaklığına getirmek (50 mL aliquot için ~ 30 dk su banyosunda alır).
Not: formamide şişe şişe formamide oksidasyonunu önlemek için oda sıcaklığına ulaşıncaya kadar açmayın.
Dikkat: Formamide zehirlidir. İdare ve kurumsal düzenlemelere göre atmayın. - % 10 formamide yıkama arabellekte bir 15 mL konik Tüp hazırlayın.
- ~ 376 x g 3 dk. kaldırmak 500 µL % 70 etanol için de tüpler santrifüj kapasitesi pipetting tarafından. Yavaşça yukarı ve aşağı kalan hücreleri resuspend ve sonra hücreleri düşük yapışma tüpler için aktarmak için damlalıklı.
Not: yüksek yapışma borular kullanarak büyük ölçüde hücre kaybı sırasında sonraki yıkar azaltır. - Tüpler ~ 376 x g 3 dk. çıkarmak için de tekrar pipetting tarafından tüm etanol santrifüj kapasitesi.
- 1 mL % 10 formamide yıkama arabellek ve yavaşça damlalıklı aşağı yukarı 2 - 3 kez eklemek hücreleri resuspend.
- Hücreleri hibridizasyon çözüm hazırlarken ~ 20 min için oda sıcaklığında oturmak izin. 1 örnek için 50 µL hibridizasyon arabelleği (Oda sıcaklığı), 200 mm (65 ˚C ısındı) VRC 5 µL ve her sonda (200 nM final) 1 µL karıştırın. 5 örnekleri için 250 µL hibridizasyon arabelleği (Oda sıcaklığı), 200 mm (65 ˚C ısındı) VRC 25 µL ve her sonda (200 nM final) 5 µL karıştırın.
- Hibridizasyon (-20 ˚C dondurulmuş) arabellek formamide oksidasyonu önlemek için tüp açmadan önce oda sıcaklığına çözülme.
- 200 mM VRC, sondalar, eklemeden önce 5-10 s için girdap ekledikten sonra hangi tasarlanmış ve ticari satın ve üreticinin yönergelerine göre yeniden düzenlendi.
- İki problar Co inkübe varsa, 1:10 1 µL ekleyin seyreltme prob #1 stok, hem de 1:10 1 µL seyreltme, son seyreltme yapmak için prob #2 stokunun ~ 1:500 her iki soruşturma için. Olmak en iyi sinyal-gürültü oranı ihtiyaçları için gerekli konsantrasyonu (Ayrıntılar için bkz: tartışma) en iyi duruma getirilmiş.
- ~ 376 x g 3 dk. Kaldır de örnekleri süpernatant tehlikeli atık pipetting tarafından santrifüj kapasitesi.
- Hibridizasyon çözümünün en az 50 µL her tüp için ekleyin. Karıştırmak için tüpler fiske.
- Bir rulo davul üzerinde 30 ˚C, en az 16 saat karanlıkta kuluçkaya.
Gün 2/gün 3
3. yıkama ve görüntüleme
- Formamide oda sıcaklığına getirmek.
- % 10 formamide yıkama arabellek (FWB) 15 mL konik Tüp hazırlayın.
- Tüpler rulo davul kaldır ve ışıktan korumak için bir folyo kaplı kutusuna koyun.
- ~ 376 x g 3 dk. Kaldır de örnekleri süpernatant tehlikeli atık pipetting tarafından santrifüj kapasitesi.
- Yavaşça yukarı ve aşağı pipetting 1 mL % 10 FWB resuspend 2 - 3 kez.
- 30 dk folyo kaplı kutusunda (değil döner) için 30 ˚C, kuluçkaya.
- 3 dk. için çıkarmak süpernatant tehlikeli atık için pipetting tarafından ~ 376 x g de örnekler santrifüj kapasitesi ve ~ 50 µL bırakın.
- Bu arada, DAPI/FWB 15 mL konik tüp içinde hazırlamak: 1 örnek için 1000 µL % 10 formamide yıkama arabelleği 5 mg/mL DAPI 1 µL ile karıştırın. 10 örnekleri için 10 mL % 10 formamide yıkama arabellek 5 mg/mL DAPI 10 µL ile karıştırın. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetting 1 mL DAPI/FWB resuspend 2 - 3 kez.
- 30 dk folyo kaplı kutusunda (değil döner) için 30 ˚C, kuluçkaya.
- Anti-çamaşır suyu reaktifler buz çözme.
- ~ 376 x g 3 dk. Kaldır de örnekleri süpernatant tamamen pipetting tarafından santrifüj kapasitesi. Gerekirse, tüm süpernatant kaldırmak için tekrar santrifüj kapasitesi.
- Hemen görüntüsü değil örnekleri, Pelet GLOX arabellek olmadan enzimler 50 µL içinde resuspend. Damlalıklı aşağı yukarı 3 - 4 kez karıştırmak için.
- Unimaged örnekleri folyo kaplı kutuda 4 ˚C görüntüye kadar hazır tutun. Görüntü hazır olduğunuzda ~ 376 x g 2 min için de örnekler santrifüj kapasitesi ve süpernatant tamamen kaldırmak pipetting göre. Aşağıdaki gibi enzimler ile GLOX içinde resuspend.
- Hemen yansıma örnekleri için 15-20 µL GLOX arabelleği enzimler ile ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı karıştırmak için damlalıklı.
Not: eklendi birim hücre Pelet boyutuna bağlı olarak değişebilir. Biz 15 µL GLOX arabelleği enzimler ile Pelet resuspending tavsiye ve mikroskop hücre yoğunluğu kontrol edin. Hücreleri (çok yoğun hücreleri birbiri topaklanma) varsa, enzimler ile ilave GLOX tampon ekleyin. Hücreleri çok seyrek ise örnek santrifüj kapasitesi ve ~ 5 µL arabelleği kaldırın. - Damlalıklı 5 µL üzerine bir coverslip (18 mm x 18 mm, No. 1) ve koymak bir slayt üzerinde coverslip.
- Coverslip yerleştirildiği bir laboratuvar silin slayt üzerine koy. Yavaşça laboratuvar silme slayt (sıvı tüm dört coverslip kenarlarından çıkıyor görmelisiniz) ayarlamak için tuşuna basın.
- Slayt alüminyum folyo ile kaplı bir kutu içinde mikroskop Oda aktarın.
- Yüksek büyütme (60-100 X) ve yüksek sayısal diyafram ile geniş alanlı floresan mikroskop kullanarak görüntü.
Not: önemli ölçüde tahsil edilecek ışık miktarını sınırlamak gibi smFISH sondalar tarafından yayılan fotonlar maksimum sayıda toplamak için confocal mikroskoplar, tavsiye edilmez. Burada, veri toplanmıştır üzerinde bir 100 X, 1.4 NA amacı ile donatılmış bir mikroskop kullanarak filtre CY5 (EX632/22, EM679/34) görüntüsü 1.3 s, %100 T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, %100 T; ve DAPI (EX390/18, EM435/48), 0.05-0.1 s, %32 - %50 T. Bir parlak alan başvuru yansıması da elde edilebilir. Adım boyu ile 15-25 dilim 0,1-0,2 elde µm, üzerinden tamamen aşağıda görüş alanı tamamen yukarıda, odak tüm sağlamak için RNA noktalar sayılı mı.
4. görüntü analizi
- Balık-quant17 ve StarSearch2gibi yayımlanmış smFISH analiz araçları ile veya deneme tam ihtiyaçlarına bağlı olarak özel programları ile smFISH veri analiz.
Not: Bir iyi analiz boru hattı doğru RNA noktalar ayrı arka plan ve X, Y ve Z (isteğe bağlı) koordinatları ve her yerinde, her hücrede noktaların sayısını yoğunluğu gibi istatistikleri çıkış için bir eşik belirlemek kullanıcılara izin vermelidir ve muhtemelen yanlış algılamaların filtre uygulamak için bir yol olarak parametreleri uygun.
Representative Results
Ne kadar iyi çalıştı smFISH Protokolü (anahat içinde Şekil 1), NDC80 gen açık okuma çerçevesi karo 54 probları bir dizi tasarlanmış değerlendirmek için (Şekil 2A, üst). En sonunda 5' bulunan prob prob 1 adlandırılır; bir sonraki, sonda 2; ve üçüncüsü, yoklama 3, vb. 27 probları garip bir atanan sayı (Probe 1, 3, 5...) tüm CAL Fluor 590 (CF590) floresan boya için; Birleşik ve Quasar 670 (Q670) floresan boya için Birleşik bir çift sayı (Probe 2, 4, 6...), 27 probları atanır. Bu nedenle, bu alternatif sonda kümeleri probları "tek/çift" anılır. Hibridizasyon, her iki prob kümeleri aynı transkript etiket.
Nokta algılama sonra biz smFISH veri kümesi kalitesini yargıç için birkaç ölçümleri kullanılır. Birincisi derecesi ve kalitesini colocalization için tek/çift probları oldu. Bizim durumumuzda, beklenen verilen değer içinde herhangi bir renk olan her diğer (eşleştirilmişŞekil 2C,), 2 piksel yakınına eşleştirilmiş noktalar ve algılama % 95'i daha büyük (Şekil 2A ve 2B), smFISH lekelerin % 88 colocalized sapmaları iki floresan kanallar arasında. Buna karşılık, bir komşu en yakın mesafe az 2 piksel, spot bir çift Algıla olasılığı düşük olduğunu gösteren unpaired noktalar % 10'dan az vardı (Şekil 2C). % 12'si unpaired noktalar eşit iki kanal arasında ayrıldı (Şekil 2B, karşılaştır CF590 yalnızca salt Q670 ile); ve böylece, biz 2.4 kb bir genle için hücre başına 45 transkript sıfıra arasında ifade bir dizi, RNA moleküllerinin ~ %94 doğru floresan her kanalda algılandı. SmFISH Protokolü suboptimal olsaydı, bir smFISH noktalar (colocalized-) iki floresan sinyallerini yalnızca biri ile daha büyük (1) bir kısmını ve/veya (2) çok düşük bir sinyal-gürültü oranı veya sinyal yok hücrelerle hiç gözlemlemek.
Biz sonraki smFISH sinyal algılama RNA molekülleri hücre başına toplam sayısı ile ilgili olarak önyargılı Eğer sordu. Bir nüfus içinde belirli bir RNA her hücrede toplam sayısı bir dağıtım, diğerlerine göre daha fazla RNA molekülleri yataklık bazı hücreler aittir. Bir daha yüksek bir sayı veya RNA molekülleri az sayıda her hücrede mevcut olup iyi smFISH Protokolü sağlam RNA ne olursa olsun olup olmadığını algılamalıdır. Bu, her hücre için test etmek için colocalized sinyalleri smFISH lekeli kısmını ve kesir iki floresan sinyallerini yalnızca biri ile hesaplanır. Toplam noktalar aynı sayıda hücre başına vardı hücreleri gruplandırma sonra biz ortalama kısmını hesaplanan colocalized (eşleştirilmiş) veya (yalnızca CF590 veya salt Q670) lekeler sigara colocalized belirli bir grup ve bu ortalama toplam sayısı bir fonksiyonu olarak Grafiği çizilecek. hücre (Şekil 3) başına noktalar. Noktalar her kategori için kesirler noktalar hücre başına toplam sayısı tüm aralığında benzerdi. Örneğin, toplam 30 noktalar toplamda olanlar karşı hücre başına 20 floresan lekelerin bulunduğu hücreleri karşılaştırma, colocalized noktalar ortalama kesirler benzerdi. Bu sonuç bizim Protokolü (en çok en az 40 ~ moleküller hücre başına) bir hücre aralığı RNA molekülleri tespit olabilir önerdi. Protokol suboptimally işe yaradıysa, biri bir önyargı gözlemlemek olabilir. Örneğin, yalnızca iki floresan sinyallerini biri lekeli kısmını noktalar arttı hücre başına toplam sayısı olarak artırabilir.
Bu en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralını kullanan, biz farklı büyüme ortamlarda bir kinetochore protein kodlar NDC80 Gen ifadesinin inceledi. NDC80 gen iki mRNA izoformlarının ifade eder: uzun undecoded transkript izoformu, NDC80luti, vasıl belgili tanımlık son 5' ile karşılaştırıldığında kısa bir ~ 400 baz çifti uzantılı NDC80ORF pay izoformu, ama her iki transkript Kodlayıcı bölge NDC80 gen (bkz: şematik 4A şekiliçinde). Probları iki set dizayn ettik: CF 590 kümesi benzersiz 5' bölgesinin NDC80luti; için bağlar ve Q 670 küme NDC80luti ortak bölgesine bağlanır ve NDC80ORF. NDC80luti transkript nerede sinyalleri her iki yoklama colocalized, kümeleri ise smFISH noktalar tespit edildi NDC80ORF transkript bu sadece Q 670 gelen sinyal ile vardı. NDC80lutibenzersiz segment büyüklüğü nedeniyle, sadece 20 oligonükleotid probları boyunca önerilen 30 ila 48 probları daha az olan bu bölge, döşeme. Bu yüzden, biz önce Bu sonda set sağlam RNA bizim en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralında tespit olabilir Eğer belirlenir. Floresan her iki kanalı için sinyal-gürültü oranı (SNR, bir nokta nokta yoğunluğu göre çevreleyen piksel varyansını olarak tanımlanan) için her smFISH nokta tespit sinyali karşı Grafiği çizilecek ve bir scatterplot tüm noktalar için oluşturulan Tüm görüş alanı ( Şekil 4A örnek görüntüler) ve araziler Şekil 4Bolarak tanımlanan. İki ayrı nüfus açıkça için her iki Q 670 tespit edildi ve CF 590 sonda (optimize edilmiş, Şekil 4B), ayarlar öne doğru smFISH noktalar (gri alanı içinde) arka plan sinyalini ayrılmış. Suboptimal durumda daha az belirgin (Suboptimal, 4B rakam) böyle ayrılık olduğunu unutmayın.
Biz bu iki prob kümeleri NDC80luti ifade çalışırdım ve NDC80ORFbitkisel büyüme ve mayoz sırasında. Bitkisel hücrelerde Q 670 sonda kümesinden güçlü sinyal algılandı ancak CF 590 sonda Kuzey Blot tarafından gözlem ile (Şekil 5A, bitkisel), kabul sadece kısa izoformu bitkisel büyüme16 sırasında ifade ayarlanmamış . Bu sonuç da CF 590 sonda küme belirli, düşük arka planda bizim en iyi duruma getirilmiş smFISH Protokolü verimli olduğunu düşündürmektedir. Buna ek olarak, her iki prob kümelerinden güçlü sinyal segregasyonun profaz algılandı ve noktalar çoğunluğu sinyal (Şekil 5A, segregasyonun profaz) colocalized. Kuzey blot Analizi (Şekil 5B) ile birlikte, bu gözlem uzun izoformu NDC80luti özellikle mayoz ifade edildi doğruladı. MRNA'ların bu iki tür (dışında DAPI bölgesi) sitoplazmada her iki çekirdek veri18profil oluşturma ribozom ile tutarlı üzerinden verildi Düşündüren tespit edildi.
Yeterli veri bizim veri kümesine içsel biyolojik değişim için doğru bir şekilde hesabına toplanmıştır belirlemek için biz (1) (2) başı hücre colocalized noktalar kesir dahil her hücre istatistikler kullanarak önyükleme çözümlemenin (CF 590 sadece ve Q 670 sadece) iki floresan sinyalden birisi lekeli kısmını. Bu analizde, bir programın rasgele 500 yineleme için 437 quantified hücrelerden bir hücreyi seçtiğinizden. Ardından, ortalama ve bu 500 seçili hücreler ile ilişkili ilgili istatistik varyansını hesaplanmıştır. Bu işlem sonra rastgele iki hücre yerine koymadan tüm hücreleri seçmek için tekrar edilmiş; ve sonra rasgele seçme üç hücreleri, vs. kadar toplam veri kümesi boyutu yarısı ulaştı. ~ 40 hücreleri, bu noktadan sonra çoğu ortalama varyasyon içsel veri yerine undersampling bir artifakı olduğunu düşündüren sonra veri kümesi varyans monoton (Şekil 6, iç metin). Bu etkinin ne zaman biz her yineleme döngüsü (Şekil 6) örneklenmiş hücre sayısı bir fonksiyonu olarak örnek ortalaması tarafından bölünmüş örnek varyans Grafiği çizilecek daha belli oldu. Gösterilen veriler ile varyans değişikliği ~ 60 hücreleri sonra diminishingly küçük oldu. SmFISH deney sayısal hücreleri hücre istikrarlı bir ortalama ve bir plato varyans elde etmek için gerekli en az sayıda aşmalıdır. Bizim durumumuzda biz örnek çoğaltılır başına başına üzerinde 95 hücre sayılabilir. Popülasyon ortalaması yansıtmak için gerekli en az sayıda hücre (~ 60 hücreleri) de aştı toplam hücre (> 400 hücreleri).
Bir ısmarlama Matlab programı16ile medyan 5 için bitkisel hücreleri bulundu NDC80ORF hücre, başına transkript segregasyonun profaz hücrelerde, hücre (iki uçlu Wilcoxon başına 4 transkript için ortanca önemli ölçüde düştü, ancak Sırası Sum testi, p = 0.026) (Şekil 7). NDC80luti transkript hücre başına ortalama sayısı 21 transkript yapıldı ve hücrelerin % 100 NDC80luti transkript dile getirdi. MRNA molekülleri sayısı ayrı bir miktar olduğu için biz bir step-wise, göreli frekans çubuk grafik transkriptleri belirli sayıda hücrelerle kısmını Grafiği çizilecek. Her çubuk grafik en büyük depo aynı yüksekliğe normalleştirilmiş.
Şekil 1: smFISH iletişim kuralı için Flow-chart. Hücreleri formaldehit, oda sıcaklığında 20 dakika veya 4 ˚C ile gecede, bitkisel büyüme örnekleri ve segregasyonun örnekleri için sırasıyla sabittir. % ~ 70-%90 hücre sindirilmiş kadar tampon B üç kez yıkadıktan sonra zymolyase tarafından hücreleri sindirmek. Sindirilir örnekleri arabellek zymolyase kaldırmak için B ile bir kez yıkanmış ve daha sonra % 70 etanol (alkol) ~3.5 saatlerce permeabilized. Hibridizasyon için hazırlamak için örnekleri ilk arabellekte % 10 formamide yıkama (FWB) ~ 20 dakika inkübe. Daha sonra örnekleri ~ 50 µL hibridizasyon başvuruluyor, floresan problar 30 ˚C, karanlık gecede kuluçka için geçerli olan resuspended. Hibridizasyon sonra örnekleri için 30 dk içinde % 10 FWB fazla probları yıkamayı inkübe ve % 10 FWB ile 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DNA leke DAPI) içinde inkübe. Hemen FWB/DAPI kuluçka sonra yansıma örnek için örnek katalaz, Trolox ve glikoz oksidaz ile (GLOX + enz); desteklenen GLOX arabelleği resuspended Oysa diğer örnekleri enzimler olmadan GLOX arabelleğinde resuspended ve 4 ˚C depolanan, ~ 3 saate kadar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: tek/çift probları kullanarak smFISH kalitesini değerlendirilmesi. (A) top: Şematik tek/çift prob kümeleri için. Elli dört oligonükleotid probları NDC80 gen fayans tasarlanmıştır. Tek sayılı probları bir fluorophore (CF590, magenta içinde gösterilir) ve çift numaralı sondaları başka bir fluorophore (Q670, yeşille gösterildiği) ile etiketlenmiş. Alt: Temsilcisi smFISH görüntüleri segregasyonun profaz hücre tek/çift prob kümeleri kullanarak elde. Örnekleri 6 saat sonra hücreler (UB8144) sporulation orta olarak ne zaman bu hücreler segregasyonun profaz tutuklandı bir zaman transfer edildi alınmıştır. DNA (mavi renkle gösterilmiştir) DAPI ile lekeli. Görüntüleri z-yığınlar maksimum yoğunluk projeksiyon gösterilir. Ölçek çubuğu: 5 µm. eşleştirilmiş veya unpaired smFISH noktalar (B) yüzdesini elde tek/çift prob kümesi'ni kullanma. Toplam 428 segregasyonun profaz hücre analiz, iki bağımsız deneylerden Havuzu. Bu şekil Şekil 2' den değiştirilir-şekil ek 4 Chen vd. 16 (C) A toplu yoğunluk fonksiyonu (CDF) eşleştirilmiş noktalar her çifti ile unpaired bir noktaya en yakın komşu arasındaki mesafe arasındaki mesafe. Bir floresan kanaldaki her algılanan spot için en yakın algılanan nokta tanımlamak için "k en yakın komşu" algoritması uygulandığı — ve bu noktaya kadar olan mesafeyi — tamamlayıcı kanaldaki. En yakın komşu karşılıklı yerelleştirmeler eşlenmiş olması kabul edildi ve yeni bir liste eşleştirilmiş, salt CF590 ve sadece Q670 tespitlerde kayıt oluşturuldu. Tespitlerde her kategori için bir CDF çubuk grafik mesafelerin Matlab, doğru şekilde eşleştirilmiş noktalar gerçekten mesafe olmayanlar karşılık gelen bir diğer kanalda spot daha çok daha yakın olduğunu teyit çizildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Toplam RNA bir fonksiyonu olarak eşleştirilmiş ve unpaired noktalar kesirler sayı hücre başına. Algılama ve smFISH lekeler eşleştirme önyargılı Eğer farklı ifade düzeylerinde test etmek için tek tek hücreleri toplam RNA ifade tarafından gruplandırılmış. Eşleştirilmiş, salt CF590 ve sadece Q670 tespitlerde kaba kesirler hücrelerinin her grup için hesaplanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Kalite değerlendirmesi NDC80luti için tasarlanmış probları kullanılarak oluşturulan smFISH veri ve NDC80ORF mRNA'ların. NDC80luti arasında paylaşılan ortak bölgesine (yeşil renkle gösterilmiştir) Q 670 probları melezlemek ve NDC80ORF mRNA'ların, benzersiz 5' bölgesinin NDC80luti için (magenta içinde gösterilmiştir) CF 590 probları melezlemek ise . (A) NDC80luti görüntülerini temsilcisi smFISH ve NDC80ORF segregasyonun profaz içinde alınan küçük suboptimal koşullara karşı en iyi duruma getirilmiş. Suşları UB8144 (koşulu getirilmiş) ve UB1337 (suboptimal koşul) mayoz geçmesi indüklenen ve segregasyonun profaz sırasında sabit. Bu iki suş mayoz ikna etmek için farklı senkronizasyon sistemleri liman, ama her iki sistemi smFISH kalite (veri gösterilmez) etkilemez. Suboptimal durumda hücre zymolyase ile desteklenmiş ve VRC daha düşük bir konsantrasyon içinde melezleşmiştir VRC olmadan sindirmek için 20 dk (hiçbir gecede fiksasyon), oda sıcaklığında tespit edildi. Görüntüleri z-yığınlar maksimum yoğunluk projeksiyon gösterilir. DNA (mavi renkle gösterilmiştir) DAPI ile lekeli. Ölçek çubuğu: 5 µm. sinyal-gürültü oranı (SNR) ve görüş alanı tespit sinyal her smFISH spot olarak görüntüleme (B) Scatterplots sunulan 4A rakam, floresan her iki kanalı için hem de en iyi duruma getirilmiş veya suboptimal koşulları için. En iyi duruma getirilmiş durumda iki popülasyonun smFISH noktalar vardı. Gerçek smFISH noktalar arka plan sinyalini ayıran gri alanı içinde yerleşmişti. Suboptimal durumda bireysel mRNA'ların gözle ayırt etmek zor ve nokta algılama yazılımını çalıştırdıktan sonra gerçek noktalar ile arka plan arasındaki mesafeyi daha az belirgin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: İfade NDC80luti ve NDC80ORF transkript geçici kontrol. (A) NDC80luti görüntülerini temsilcisi smFISH ve NDC80ORF bitkisel büyüme ve mayoz sırasında. Hücreler (UB8144) besin zengin ortam katlanarak büyürken bitkisel örnekleri alınmıştır. Segregasyonun profaz örnekleri 6 saat sonra hücreler (UB8144) sporulation orta olarak ne zaman bu hücreler segregasyonun profaz tutuklandı bir zaman transfer edildi alınmıştır. NDC80luti arasında paylaşılan ortak bölgesine (yeşil renkle gösterilmiştir) Q 670 probları melezlemek ve NDC80ORF mRNA'ların, benzersiz 5' bölgesinin NDC80 için(magenta içinde gösterilmiştir) CF 590 probları melezlemek ise luti . DNA (mavi renkle gösterilmiştir) DAPI ile lekeli. Her hücre kendi Zip1-GFP sinyal, kalem segregasyonun profaz için sahnelendi. Bizim smFISH Protokolü güçlü GFP sinyal daha fazla değişiklik yapmadan korur. Bitkisel büyüme: Zip1-GFP negatif. Segregasyonun profaz: Zip1-GFP pozitif. Görüntüleri z-yığınlar maksimum yoğunluk projeksiyon gösterilir. Ölçek çubuğu: 5 mikron. Bu rakam Chen ve ark. Şekil 2C değiştirilir 16. (B) NDC80ORF, NDC80lutive Ndc80 protein (Ndc80p) seviyesini mayoz (UB4074) sırasında. NDC80luti ve NDC80ORF düzeyleri tarafından Kuzey leke tespit ve Ndc80p düzeyi tarafından belirtilen süre noktalarda anti-V5 immunoblot kararlıydım. Hxk1p, denetim immunoblot için yükleniyor. UB8144 zorlanma gibi aynı zamanda bu zorlanma limanlar pGAL-NDT80 GAL4-ER eşitleme sistemi19,20. Hücreleri sporulation orta olarak 0 saatte aktarılıp pachytene krizinden β-estradiol ek 6 saat sonra serbest bırakılır. NDC80luti transkript sağlam S/segregasyonun profaz içinde Oysa tespit edildi NDC80ORF transkript segregasyonun giriş (0 saat) öncesinde ve sırasında segregasyonun bölümler (7-9 saat) ağırlıklı olarak mevcut. Bu rakam Chen ve ark. Şekil 6J değiştirilir 16 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: Bootstrap gösterilen segregasyonun profaz örnekleri için gerçekleştirilen analiz Şekil 5 . Quantified hücrelerin tümünü havuza alınmış ve hücre belirli bir sayısı (n) rastgele 500 kez örnek. Hücre başına eşleştirilmiş ve unpaired mRNA kısmını ortalama ve % 95 güven aralığı hesaplanır. Bu veriler (gömme) n sayısına her seçim için çizildi. Varyans Plato ne demek istiyorsun, hücreleri (n) örneklenmiş bir fonksiyonu olarak bölünmüş örnek varyans komplo tarafından görüntülenmiştir. Ek veri ölçümleri güven geliştirmek değil gösteren büyük ölçüde hangi numarayı hata (~ 60 hücreleri) monoton, aştı toplam sayısı ölçülen hücreleri (437). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: miktar gösterilen smFISH veri Şekil 5 , grafiği çıkarılan göreli sıklığı histogramlar NDC80luti bir belirli sayıda hücre olarak ve NDC80ORF transkript üç bağımsız deneylerden havuza alınmış verileri kullanarak hücre başına. Kesikli çizgi NDC80luti ortalama sayısını gösterir ve NDC80ORF transkript hücre başına. En fazla bin yüksekliği aynı tüm çubuk grafikler arasında olduğu kadar her çubuk grafik normalleştirilmiş. Toplam 637 hücre sayısı için bitkisel büyüme ve 437 segregasyonun profaz için analiz edildi. İki uçlu Wilcoxon sırası Sum testi NDC80luti için gerçekleştirilen ve NDC80ORF, sırasıyla, bitkisel ve segregasyonun profaz örnekleri karşılaştırma. Bu rakam Chen ve ark. Şekil 2B değiştirilir 16 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Arabellek B (1 L hisse senedi: 1.2 M sorbitol; 0,1 M potasyum fosfat tampon, pH 7.5) | 1 x |
| Nükleaz ücretsiz su | 500 mL |
| Sorbitol | 218.6 g |
| KH2PO4 | 2.18 g |
| K2HPO4 | 14.62 g |
| Nükleaz ücretsiz su | 1 L son hacim için getirmek |
| * Depolamak, 50 mL aliquots içinde 4 ˚C filtre sterilize sonra | |
| Zymolyase 100T (10 mg/mL) | |
| * Aliquots-20 ˚C, mağaza | |
| 1 ml MilliQ su 10 mg zymolyase toz geçiyoruz | |
| E. coli tRNA (10 mg/mL) | |
| * Aliquots-20 ˚C, mağaza | |
| 1 ml MilliQ su 10 mg tRNA toz geçiyoruz | |
| % 70 etanol (50 mL) | 1 x (mL) |
| Saf etanol | 35 |
| Nükleaz ücretsiz su | 15 |
| * Mağaza oda sıcaklığında | |
| Hibridizasyon arabellek (10 mL) | 1 x (mL) |
| % 50 dextran sülfat | 2 |
| E. coli tRNA (10 mg/mL) | 1 |
| 200 mM Vanadyl ribonucleoside karmaşık (VRC) | 0,1 |
| BSA, 50 mg/mL | 0,04 |
| 20 x SSC | 1 |
| Formamide | 1 |
| Nükleaz ücretsiz su | 4,86 |
| * 250-µL veya 500 µL aliquots-20 ˚C, mağaza | |
| % 10 formamide yıkama arabellek (10 mL) | 1 x (mL) |
| Formamide Oda sıcaklığında | 1 |
| 20 x SSC | 1 |
| Nükleaz ücretsiz su | 8 |
| * taze, 20-30'lu için girdap mix yapmak | |
| % 10 glikoz çözüm | |
| * Depolamak, aliquots içinde 4 ˚C filtre sterilize sonra | |
| 1 g glikoz 10 mL su nükleaz ücretsiz olarak dağıtılması | |
| Glikoz oksidaz | |
| * Aliquots-20 ˚C, mağaza | |
| 3.7 mg glikoz oksidaz 50 mM NaOAc, pH 5 1 ml dağıtılması | |
| Anti-çamaşır suyu (GLOX) arabellek, enzimler (1 mL) olmadan | 1 x (µL) |
| % 10 glikoz nükleaz ücretsiz su | 40 |
| 1 M Tris, pH 8.0 | 10 |
| 20 x SSC | 100 |
| Nükleaz ücretsiz su | 850 |
| * taze olun, de aliquots, 4 ˚C saklayabilirsiniz | |
| Enzimler (50 µL) ile Anti-çamaşır suyu (GLOX) tampon | 1 x (µL) |
| Katalaz (girdap hafif, belli oldu kolayca) | 0,5 |
| Glikoz oksidaz | 0,5 |
| 100 mM (etanol içinde çözünmüş) Trolox | 1 |
| GLOX arabellek | 50 |
| * taze her zaman olun, buz üzerinde hazırlamak, 4 ˚C 2-3 saat boyunca saklanabilir |
Tablo 1. Arabellekleri ve medya
Discussion
Burada sunulan Protokolü diğer yayımlanmış smFISH iletişim kuralları2,3,21,22,23türetilmiştir ve özellikle Maya zorlanma arka SK1 için optimize edilmiştir. En iyi duruma getirilmiş parametreler cep telefonu numarasını, fiksasyon süresi, Santrifüjü hız ve süresi, sindirim süresi, sindirim arabellek, sonda konsantrasyon ve hibridizasyon arabellek dahil. Hibridizasyon sıcaklığı ve süresi gibi diğer parametreler optimize edilmemiş. Bu bölümde, bu protokol için herhangi bir Maya zorlanma arka plan ve faiz büyüme koşullarına uyum yardımcı olacak bir kaç not paylaşıyoruz.
Mayası hücre duvarına hücre duvarı sonda penetrasyon engelleyeceğinden mayası yüksek kaliteli smFISH görüntüleri alma karşı büyük bir sorun olduğunu. Hücre duvarı zymolyase tarafından eksik hazım sonda ve sinyal yüksek hücre hücre değişkenlik verimsiz hibridizasyon yol açar. Ancak, aşırı sindirim hücreleri çok kırılgan yapmak, önemli yol kaybı çamaşır adımları sırasında hücre ve görüntüleme için slayt hazırlık sırasında patlama hücre. Böylece, sindirim süresi optimize etmek çok önemlidir. Aynı örnek zaman farklı miktarda sindirerek tarafından pilot smFISH deney tavsiye ediyoruz. ~ %80 hücre refraktif sigara olunca sindirim durdu eğer bizim durumumuzda biz en iyi smFISH veri aldı. Genellikle, aynı büyüme koşulu için farklı genetik mutant suşları ile benzer zamanlama sindirmek. Ancak, sindirim süresi farklı büyüme koşulları ve mayoz mayası içinde farklı aşamalarında arasında karşılaştırıldığında farklıdır. Zamanlama belirlendikten sonra smFISH tekrarlanabilir kalitesidir. Not Ayrıca hafif kusurlu hücre duvarı sentezi ve/veya kompozisyon mutant suşları için sindirimi daha az 15 dk. zymolyase farklı gruplar halinde kullanımı tamamlanabilir sindirim zamanlama değişebilir.
En iyi sonda konsantrasyonu yüksek sinyal gürültü oranı elde etmek için gereklidir. Tasarlanmış ve bizim smFISH sondalar ticari olarak satın aldı. İyi problar (genellikle 20-mers) % %35 45, 2 baz çifti sonda ve düşük olan arasında en az bir boşluk arasında değişen GC yüzdesi olmalıdır. Biz bir web tabanlı sonda tasarımcı üretici probları listesi oluşturmak için kullanılan ve seçim için yeterli probları olsaydı, patlama algoritması Saccharomyces genom veritabanında sondalar fazla 17 baz çifti ile örtüşen ortadan kaldırmak için kullanacağımızı genomik diğer bölgeleriyle. Bu kümedeki tüm yukarıdaki ölçüt (20 probları) memnun probları sayısı daha düşük olduğu için NDC80luti (CF 590) benzersiz bölgesine anneals sonda küme için daha fazla photostable floresan boyalar (CAL Fluor 590) seçtik (~ 25 probları) üretici tarafından önerilen en az sayıda. Üreticinin yönergelerini izleyerek sonda çözüm başlamaktan sonra yaptığımız bir 1:10 seyreltme hisse senedi çözüm oluşturur ve seyreltik çözüm-20 ˚C adlı 5-µL aliquots. Her aliquot yalnızca bir kez kullanıldı. Optimizasyonu için bir seri yapmak gerekir dilutions 1:10 seyreltilmiş çözüm ve test hangi toplama en iyi sinyal-gürültü oranı verir. 1:250, 1:500, 1: 1000 ve 1:2000 özgün stoktan seyreltme dizi yapım tavsiye ediyoruz. Bizim durumumuzda, CF 590 ve Q 670 sonda kümeleri için en iyi sinyal-gürültü oranı 1:500 seyreltme faktörü sonuçlandı.
En iyi fiksasyon zaman da başarılı smFISH mayası için önemlidir. Biz o gece fiksasyon 4 ˚C bulundu yerine, oda sıcaklığında 20 dakika, sabitleme önemli ölçüde tutarlılık ve kalite segregasyonun örnekleri için smFISH sonuçlarının geliştirilmiş. Her ne kadar biz nasıl gecede fiksasyon bitkisel örnekleri etkisi olabilir test etmedim, fiksasyon, oda sıcaklığında bu büyüme durumu iyi çalıştı. Böylece, smFISH Protokolü yeni suşları veya büyüme koşulları için en iyi duruma getirmek için kısa fiksasyon saat oda sıcaklığında ile başlayan ve yüksek sinyal değişkenliği oluşursa fiksasyon zaman artan öneririz.
Diğer yayımlanmış protokolleri3,22,23ile karşılaştırıldığında, sindirim ve VRC daha yüksek bir konsantrasyon hibridizasyon sırasında sırasında RNase inhibitörü VRC bizim protokolünü kullanır. VRC ek olarak aşağıdaki iki adımı gelişmiş tutarlılık smFISH sonuçlarının muhtemelen daha iyi RNA molekülleri (enzim ham özleri saf ve RNase içerebilir zymolyase karıştırmak yanında tanıttı nükleaz etkinliğe karşı koruma kirletici maddeleri). Böylece, bizim iletişim kuralı veya VRC daha yüksek konsantrasyonlarda optimizasyonu için listelendiği gibi VRC miktarı kullanmanızı öneririz.
Hücreleri önemli bir kısmını arabellek B ve formamide yıkama arabellek çamaşır adımları sırasında kaybolabilir. Hücre kaybı azaltmak için Santrifüjü hızını artırmak. Bizim durumumuzda, örneklerimizi sırasında arabellek B cips için yüksek hızlı (21.000 x g) kullanarak önemli ölçüde azaltılmış hücre kaybı yıkar. Ancak, dolayısıyla Santrifüjü hızını değiştirme değil önerilir hücreleri zymolyase sindirim sonra çok kırılgan hale gelir. Bunun yerine, büyük ölçüde yıkama formamide yıkama arabellekte sırasında hücreleri cips yardımcı düşük yapışma tüpler bilimsel ABD üzerinden kullanmanızı öneririz. Genel olarak, bizim iletişim kuralı sürekli hücre verimli görüntüleme için yoğun bir monolayer oluşturabilirsiniz. Genellikle, 7 alanları bakış verim > 130 hücreleri miktar için uygun.
Son olarak, en uygun parametreler için ve görüntü analizi gerekli çıkışları belirlemek önemlidir. SmFISH noktalar algılamak için yayımlanan analiz programları yaygın olarak ham görüntüleri arka plan sinyal kaldırmak için Gauss çekirdek kullanarak filtre ve kullanıcılardan görüntüleri2,17her kümesi için kullanılacak sinyal-gürültü oranı belirlemek ister. Ne yazık ki, şu anda tek bir standart hangi tarafından uygun parametreleri belirlenir değildir ve bu yüzden bazı ampirik bu farklı ayarları test gereklidir. Bu adımların her biri için gerekli parametreleri ayarlamak için bir tekrarlayarak farklı parametre kümesi giriş ve ne kadar iyi her kümesinden elde edilen sonuçları maçlar bu el ile birkaç temsilcisi hücrelerde sayım odasından kontrol gerekiyor. Bir parametre kümesi bulunduktan sonra farklı büyüme koşulları ve genetik arka planlar rağmen elde edilen görüntülerin çoğu için kullanılabilir.
Ayrıca, maksimum yoğunluk projeksiyon smFISH görüntülerin miktar22önce gerçekleştirilen bir test edebilirsiniz. Bu adım nokta algılama algoritması basitleştirir ve önemli ölçüde bazı potansiyel olarak yararlı bilgiler rağmen onların hücre altı yerelleştirme gibi bireysel noktaları hakkında pahasına görüntüleme süresini azaltır. Bizim durumumuzda, mRNA molekülleri NDC80 Gen tarafından üretilen sayısı yeterince düşük noktalar de bu işlendikten sonra (tutanaklar tomurcuklanma içinde3,7Maya için nadir değildir) ayrı kaldık. Colocalization Analizi kritik nerede durumlarda analiz boru hattı colocalization değerlendirmek için her kanaldaki her smFISH spot konumunu belirlemek gerekir. Bağlı olarak özel sorular sordu, her nokta yoğunluğu gibi diğer bilgileri de boru hattı daha ayrıntılı bir çözümleme için elde edilebilir gerekebilir. Anahtar en iyi duruma getirme iletişim kuralında adımlar ve görüntü analiz boru hattı yüksek faiz soru çalışmaya smFISH verilerin kalitesini elde etmek çok önemlidir.
Disclosures
Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Anne Dodson teşekkür ediyoruz ve Stephanie Heinrich smFISH Protokolü en iyi duruma getirme konusunda tavsiye için Xavier Darzacq için analiz platformunda, Haiyan Huang öneriler istatistiksel analizi için yardım edin. Bu eser Mart Dimes (5-FY15-99), Pew Charitable güvenir (00027344), Damon Runyon'un Kanser Araştırma Vakfı (35-15) ve Glenn Vakfı'na EÜ ve bir NSF yüksek lisans araştırma bursu Grant No fon tarafından desteklenmiştir DGE-1106400 Dizayn Merkezi için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA, RNase-free (50 mg/mL) | Ambion | AM2616 | Store at -20 °C. |
| Catalase | Sigma | C3515 | Store at 4 °C for short-term. Vortex before use. |
| DAPI | Sigma | D9564 | Store at -20 °C after reconstitution in water. Protect from light. |
| 50% Dextran Sulfate | Milli Pore | S4030 | Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience. |
| E. coli tRNA | Sigma | R4251 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water. |
| Ethanol (100%, 200 proof) | various | Flammable. | |
| 37% Formaldehyde | Fisher | F79-500 | Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution. |
| Formamide | Ambion | AM9342 | Store at 4 °C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution. |
| Glucose | various | Store at 4 °C after dissolving in nuclease-free water. | |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5. |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | Store at room temperature. |
| Potassium phosphate (monobasic and dibasic) | various | Store at room temperature. | |
| Probe library, diluted in TE, pH 8.0 | Biosearch Technologies | Store at -20 °C in aliquots (5 µL) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light. | |
| Sorbitol | various | Store at room temperature. | |
| 20X SSC | Ambion | AM9763 | Store at room temperature. |
| TE, pH 8.0 | Ambion | AM9849 | Store at room temperature. |
| 1 M Tris, pH 8.0 | Ambion | AM9856 | Store at room temperature. |
| Trolox | Sigma | 238813 | Store at -20 °C in aliquots. |
| 200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | NEB | S1402S | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer. |
| Zymolyase 100T | MP Biomedicals | 08320932 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water. |
| Low-adhesion tubes | USA Scientific | 1415-2600 | Store at room temperature. |
References
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Rahman, S., Zenklusen, D. Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae. Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).
- Gaspar, I., Ephrussi, A. Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).
- Vargas, D. Y., et al. Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing. Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).
- Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing. Mol Syst Biol. 7, 506 (2011).
- Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast. Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).
- Senecal, A., et al. Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
- Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells. Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).
- Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ. Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).
- Ginart, P., et al. Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant. Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).
- Long, R. M., et al. Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA. Science. 277 (5324), 383-387 (1997).
- Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility. Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).
- Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses. RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).
- Chen, J., et al. Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA. eLife. 6, e27417 (2017).
- Mueller, F., et al. FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images. Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).
- Brar, G. A., et al. High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling. Science. 335 (6068), 552-557 (2012).
- Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
- Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).
- Dodson, A. E., Rine, J. Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae. eLife. 4, e05007 (2015).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).
- Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. Imaging single mRNA molecules in yeast. Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).
