Nachweis von Antikörpern, die die zelluläre Aufnahme von Enzym-Ersatz-Therapien mit einem zellbasierte Assays neutralisieren

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine zellbasierte Flow-zytometrie-Methode zur Erkennung neutralisierende Antikörper oder andere Faktoren, die die zelluläre Aufnahme von Enzym-Ersatz-Therapien in einer menschlichen Matrix wie zerebralen spinalen Flüssigkeit (CSF) oder Humanserum stören.

Zusammenfassung

Die Verwaltung der Enzym-Ersatz-Therapien (ERTs) und andere biologische Therapien für Patienten können eine Anti-Drogen-Immunantwort hervorrufen. Die Charakterisierung dieser Anti-Drogen-Antikörper (ADA), besonders jene, die die biologische Aktivität des Medikaments, genannt neutralisierende Antikörper (NAbs) neutralisieren kann ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Auswirkungen dieser Antikörper auf des Medikaments pharmakologischen Profil. Dieses Protokoll beschreibt eine zellbasierte Flow Cytometry Methode um Faktoren erkennen, die die zelluläre Aufnahme von einem Vertreter lysosomale ERT in menschlichen Matrix zu neutralisieren. Das Protokoll besteht aus drei Verfahren: Screening, eine bestätigende Schritt, Titer Assays zu erkennen, zu identifizieren und die relative Höhe der neutralisierenden Antikörpertiter im Thema Proben zu etablieren.

Bei dieser Methode Proben sind gemischt mit dem Fluorophor konjugiert ERT Produkt zunächst inkubiert mit Zellen [z.B.menschlichen T-Lymphozyten (Jurkat-Zellen)], die einen Zelloberfläche kation-unabhängige Mannose-6-Phosphat-Rezeptor (CI-M6PR), zum Ausdruck bringen und Schließlich analysiert mit einem Durchflusszytometer. Eine Probe ohne NAbs führt die Aufnahme der Fluorophor konjugiert ERT Produkt über CI-M6PR, in der Erwägung, dass die Anwesenheit von NAbs wird binden an das Medikament und die CI-M6PR Bindung und Aufnahme stören. Die Menge der Fluorophor konjugiert ERT verinnerlicht durch die Jurkat-Zellen ist Durchflusszytometrie gemessen und als Prozentsatz (%) Signal Hemmung im Vergleich zu der Reaktion, die in der Gegenwart eine repräsentative medikamentennaive Matrix bewertet. Im bestätigenden Schritt sind die Proben vor inkubierten mit ERT konjugiert magnetische Beads, Droge-spezifische Faktoren zum Abbau, die auf das Medikament (z. B. NAbs) vor eine Inkubation mit Zellen zu binden. Proben, die Bildschirm und bestätigen positive für Droge-spezifische NAbs in der Probe, sind dann seriell verdünnt, um eine Antikörpertiter zu generieren. Semi-quantitativen Antikörpertiter können mit Messungen der Arzneimittelsicherheit und Wirksamkeit korreliert werden.

Einleitung

Immunogenität Bewertung ist ein wichtiger Bestandteil der Sicherheit und Wirksamkeit monitoring-Programm für alle biologischen therapeutische Produkte, einschließlich ERTs. Patienten entwickeln eine Immunreaktion, die Arzneimittelsicherheit, Wirksamkeit und pharmakokinetische/pharmakodynamische Profile direkt auswirken kann. Eine Teilmenge von diesen ADA, genannt NAbs, kann hemmen ERT Wirksamkeit auf zweierlei Weise: durch die Hemmung der ERT-Aufnahme in die gezielte Zelle oder durch Hemmung der ERT katalytischen Aktivität. Die hier vorgestellte Methode dient zur Messung NAbs, die die ERT-Aufnahme in Zellen stören. Um die Sicherheit und Wirksamkeit von therapeutischen ERT voll zu überwachen, ist die kontinuierliche Überwachung der NAbs Aufklärung möglichen Korrelationen mit klinischen Ergebnisse oder pharmakodynamische Effekte¹entscheidend.

Plattformen für die Bewertung der NAbs gegen Protein Therapeutics umfassen zellbasierte, enzymatische Aktivität und Ligand-Bindung-Assays¹. Die optimale Test-Plattform wird anhand verschiedener Kriterien ausgewählt: der Wirkmechanismus der therapeutische Produkt, Assay Plattform Empfindlichkeit, Selektivität, Präzision und vor allem seine Fähigkeit, die hemmende Wirkung von nachahmen NAbs in Vivo . Ligand-Bindung-Assays können in bestimmten Fällen sinnvoll sein (z.B.bei eine entsprechenden Zelllinie nicht ermittelt werden kann oder wenn die notwendige Sensibilität in eine zellbasierte Assays erzielt werden kann). Jedoch 2016 Draft FDA-Richtlinien für Industrie-Dokument und andere Industrie akzeptiert White Papers, zellbasierte NAb Assays empfohlen werden, denn sie können besser reflektieren den biologischen Mechanismus der Droge in Vivo^{1,2 , 3}.

Die kritischen Komponenten für die Entwicklung eines Flow Cytometry zellbasierte NAb Assays zählen eine geeignete Zelllinie, die Droge Stimulation, eine Leihmutter positiv-Kontrolle reagiert, NAb, die der ERT, ein Fluorophor konjugiert ERT und biologische Testspezies neutralisiert Matrix^4,5,6. Die Linie Zellenauswahl richtet sich nach der ERT Wirkmechanismus und mehrere Zelllinien sollte während der Assay-Entwicklung-³bewertet werden. In der hier beschriebenen Methode wurden menschliche Jurkat T-Zellen für ihre endogenen CI-M6PR Ausdruck auf der Zelloberfläche und das Fehlen der Antikörper-Fragment-Rezeptoren (FcRs), die wahllos die Fc-Region die meisten Antikörper^{7,8 binden ausgewählt.} . Während der Assay-Entwicklung ist es wichtig, eine negative Kontrolle für die Validierungsstudien und der Patientenprobe testen, wie z. B. Serum von Einzelpersonen, die nicht mit dem Test Artikel¹behandelt wurden gebündelt zu etablieren. Zell-Linien sollte auch entsprechende Matrizen aus verschiedenen Arten für Kontinuität in der Post-marketing, präklinischen und klinische Phasen des Medikament Entwicklung¹tolerieren. Eine weitere Komponente ist die Auswahl der Test positiv-Kontrolle. Die positive Kontrolle für die ERT-Zelle-Aufnahme-Assay wurde gewählt, basiert auf seiner Fähigkeit, die therapeutische binden und neutralisieren die Aufnahme durch CI-M6PR^9,1. Es ist oft schwierig, nützliche oder nachhaltige Mengen von neutralisierenden Antiseren von Versuchspersonen für den Einsatz als Assay Kontrolle, vor allem in seltenen Krankheit Patientenpopulationen²zu erhalten. Alternativen sind Antiseren von hyper-immunisierten Tiere oder Affinität gereinigt polyklonale und monoklonale Antikörper in den Assay relevanten Matrix¹versetzt. Bei der Verwendung einer Spezies-spezifische Matrix, ist es möglich, dass hemmende Faktoren als Antikörper in der Matrix vorhanden die ERT-Aufnahme hemmen können. Ein weiterer wichtiger Bestandteil des Tests ist der Fluorophor konjugiert ERT. Die Auswahl der Fluorophor für die ERT Konjugation sollte für jedes ERT, basierend auf der Assay Bedürfnis nach Helligkeit, pH-Stabilität und mögliche spektrale Überlappung in andere Kanäle auf das Durchflusszytometer ausgewertet werden.

Der hier beschriebene Test ist ein Beispiel für die Messung eine NAb zu einem therapeutischen Protein, wie z. B. eine ERT, die die Zelle über CI-M6PR eingibt. Mehreren ERTs lysosomale speichererkrankungen (LSDs) zu behandeln, nutzen diesen Weg für Zelle Aufnahme und lysosomale targeting, einschließlich Elosulfase Alfa für A Morquio Syndrom, Cerliponase Alfa für CLN2 Batten Krankheit, Agalsidase Alfa für Morbus Fabry, soll und Alglucosidase Alfa für Pompe-Krankheit^10,11. Der Zweck dieser Methode ist, die relativen Pegel der NAbs zu messen, die Droge Bindung und Internalisierung über CI-M6PR stören. Dies erfolgt in mehrstufigen screening, bestätigende und Titer Schritte³. Proben werden zunächst für NAb Positivität überprüft und dann in die bestätigende Schritt positiv bestätigt. Schließlich können Proben, die Bildschirm und bestätigen positive, seriell verdünnt werden, um einen Antikörper-Titer¹zu generieren. Dieser zellbasierte Flow Cytometry Medikament Aufnahme Test bietet eine sensible und mechanistisch relevanten in-vitro- Methode zur Messung der Droge-spezifische NAbs, die pharmakologischen Profil des Medikaments beeinträchtigen können. Wir zuvor die Methode validiert und klinische Proben mit Hilfe dieser Plattform für die Droge Elosulfase Alfa⁸getestet. Hier beschreiben wir die detaillierte Schritt für Schritt-Protokoll, das auf andere therapeutische Proteine oder ERTs angewendet werden kann.

Protokoll

Menschlichen Matrizen wurden aus kommerziellen Quellen mit Genehmigung von ihrer institutionellen Review Board (IRB) gekauft aber als potenziell infektiös behandelt werden. Sicherzustellen Sie, dass die Laborumgebung verwendet eine Kultur der Sicherheit¹²beibehält.

(1) vor Beginn des Tests

1. Bereiten Sie ERT konjugiert Streptavidin magnetische Beads gemäß des Herstellers Anweisungen¹³.
2. Qualitätskontrolle-Proben (QCs) vorbereiten: spike einen Positivkontrolle Antikörper (PC) (z. B.eine NAb) in die artspezifische Matrix (z.B., gepoolte CSF oder Serum).
   Hinweis: FDA und EMA Anleitung empfiehlt Assay Validierung und Stückprüfung^1,14einem hohen und einem niedrigen QC vorbereiten.
   1. Zum Beispiel um einen QC bei 10 µg/mL zu erhalten, fügen Sie 10 µL der positiven Lagerwirtschaft 1 mg/mL in 990 µL der entsprechenden Matrix (z.B., CSF) für ein Gesamtvolumen von 1.000 µL.
   2. Aliquoten die QC-Proben in einem Volumen für ein einzelnes verwenden (z. B.50 µL) und Einfrieren der Aliquote bei-60 bis-80 ° C¹.
   3. Aliquoten eine Schnitt-Punkt-Regelung (CC), artspezifische Matrix, die nicht mit den Testartikel (z.B., gepoolte CSF oder Serum) für einen einzigen behandelt (z. B.50 µL) verwenden und Einfrieren der Aliquote bei-60 bis-80 ° C¹.
3. Führen Sie eine Konjugation Reaktion zwischen der Fluorophor und mit einem Protein-Kennzeichnung Kit entsprechend des Herstellers Protokoll¹⁵ERT. Aliquoten die Probe in einem geeignet für ein einzelnes Volume verwenden (z. B.50 µL) und Einfrieren der Aliquote bei-60 bis-80 ° C.

2. Tag 1: Cell Plating und Probenvorbereitung

1. Zellplatte Vorbereitung
   1. Verwenden einer Gewebekultur-Haube und pflegen eine aseptische Umgebung für die folgenden Schritte. Sprühen Sie jedes Objekt, das in der Haube mit 70 % Ethanol platziert werden und erhalten eine saubere Umwelt^16,17,18.
   2. Wärmen Sie die Zelle Wachstumsmedium (z. B.RPMI-1640 mit 10 % fetalen bovine Serum und 1 % Penicillin-Streptomycin) in einem Wasser oder Perlen Bad bei 37 ° C¹⁹.
   3. Anzahl der menschlichen T-Lymphozyten Jurkat Zellen und Platte 100 µL pro Bohrloch bei 7,5 x 10⁵ Zellen/mL in einer 96-Well Rundboden Zelle Kultur Platte geeignet für den Einsatz auf einem Durchflusszytometer, ausgestattet mit einem Teller-Lader.
      1. Z. B. eine Hemocytometer oder eine automatisierte Zelle Zähler zählen die Zellen^20,21.
      2. Sicherzustellen, dass die Zellen verfügen über mindestens 70 % Lebensfähigkeit, bevor Sie fortfahren mit dem Experiment (z.B.Beurteilung der Lebensfähigkeit mit Trypan Blau Färbung)¹⁷.
   4. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO₂ % und 95 % Luftfeuchtigkeit über Nacht für 14 – 20 Uhr.
2. Screening-Probenvorbereitung
   1. Verdünnen Sie das Thema oder assay Kontrollproben serumfreie Medien (z. B.RPMI-1640). In der Beispielmethode hier verdünnter Proben 1: 2,5 RPMI-1640 durch Hinzufügen von 60 µL der Probe zu 90 µL serumfreie Medien. (z. B.8-Strip Röhren). Fahren Sie mit Schritt 3.1 für das Testverfahren zu einem Fluorophore beschriftet ERT vorzubereiten.
      Hinweis: Die Verdünnung von 1: 2,5 wurde experimentell bestimmt und eignet sich optimal für die hier vorgestellte Methode. Optimale Probe Verdünnungen sollten für jede Methode bestimmt werden, die entwickelt wird.
3. Bestätigende Wulst und Probe Vorbereitung
   1. Berechnen Sie die Anzahl der ERT konjugiert Perlen für bestätigende Proben benötigt.
      1. Zum Beispiel für 10 Proben verwenden 10 Proben X 100 µL ERT konjugiert Perlen pro Probe + 30 % Aufschlag zum Ausgleich der Verluste während der Waschschritt = 1.300 µL ERT konjugiert Perlen.
   2. Wirbel die Perlen gründlich. Eine 15 mL konische Rohr zum Waschen die berechnete Anzahl von Perlen hinzufügen.
   3. Waschen Sie die ERT konjugiert magnetische Beads durch Zugabe von 1.300 µL der Kupplung Puffer oder wie vorgeschlagen durch den Hersteller (z.B.mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,1 % Polysorbat 20) nach den Schritten unter¹³.
   4. Wirbel der Röhre gründlich. Platzieren Sie das Rohr in einem magnetischen Rohr Rack für 2 min. Ohne die Perlen vorsichtig Aspirieren und überstand verwerfen.
      Hinweis: Die Lösung schaltet von dunkelbraun zu löschen, wenn Perlen an den Magneten gezogen werden.
   5. Aufzuwirbeln Sie die Perlen mit 1.300 µL Puffer Kupplung. Wiederholen Sie die Wäsche Schritte für eine Gesamtmenge von vier Waschungen.
   6. Nach dem letzten Waschen aussetzen der Perlen in 1.300 µL der Kupplung Puffer (zuvor im Schritt 2.3.1.1 berechnet). Fügen Sie 100 µL pro gut zu einer 96-Well, weiß, Rundboden, unverbindliche Polypropylen Platte nach der Platte-Karte (z.B., eine bestätigende gut pro Probe oder QC; der Probe werden Duplikate, wenn mit der Fluorophore beschriftet ERT inkubiert aufgeteilt werden soll).
   7. Die Platte auf einem 96-Well-Seite umgangen-Magnet und ermöglichen Sie die Perlen, eine Kugel zu bilden. Vorsichtig Aspirieren des klare Überstands und entsorgen.
      Hinweis: Die Lösung von dunklen Braun bis nach ca. 1 – 2 min. auf der Seite umgangen Magnet schaltet. Die erhaltenen Perlen werden "trocken" Perlen genannt.
   8. Wenn die Proben positiv gezeigt und bestätigt wird sind, fügen Sie 100 µL jeder Probe mit und ohne Perlen ERT konjugiert gut in die geeignete/zugewiesen. Die Dichtplatte mit einer Kunststofffolie und schütteln Sie sie für mindestens 60 min. auf einem Dreh Shaker bei ca. 800 u/min bei Raumtemperatur (RT).
      Hinweis: Zuvor vorbereitet und eingefroren, positive und negative QCs und der CC auf jeder Platte aufzunehmen.
   9. Nach der Inkubation die bestätigende Platte auf der 96-Well-Seite umgangen-Magnet und ermöglichen Sie die Perlen, eine Kugel zu bilden.
4. Titer Verdünnung Serie Vorbereitung
   1. Um einen Titer-Serie vorzubereiten, seriell Verdünnen der Probe in der gepoolten Matrix eine ausreichende Anzahl von Zeiten, die vorgegebenen Titer schneiden Sie Punkt¹zu überqueren.
   2. Mischen Sie zum Beispiel 30 µL der Probe zu 60 µL der gepoolten Matrix in einer Verdünnungsreihe 1:3 für insgesamt 8 Verdünnungen (z.B. 8-Strip Röhren). Fahren Sie mit Schritt 3.1 für die Testverfahren Fluorophore beschriftet ERT vorzubereiten.

3. Tag 1: Testverfahren

1. Bereiten Sie die Fluorophore beschriftet ERT in serumfreien Medium (z.B. 60 µL pro Brunnen oder ca. 6 mL/Platte).
   1. Zum Beispiel, um 10 mL von 1 µg/mL vorbereiten Fluorophore beschriftet ERT, fügen Sie 10 µL von Lager 1 mg/mL Fluorophore beschriftet ERT bis 9,99 mL serumfreie Medien (z. B.RPMI-1640).
2. In einer neuen Inkubation Platte (z.B. 96-Well, weiße, Rundboden, unverbindliche Polypropylen-Platte), fügen Sie die vorbereiteten Proben aus Schritt 2.2, 2.3 oder 2.4 und einem Fluorophore beschriftet ERT in einer 1:1 Mischung in doppelte Brunnen (z.B.Transfer 60 µL der einzelnen Probe vorbereitet und fügen Sie 60 µL Fluorophore beschriftet ERT pro Well).
   Hinweis: Eine Beispiel-Experiment-Platte-Karte ist in Abbildung 1zur Verfügung gestellt.

Abbildung 1: Beispiel für ein Experiment Platte Layout. Proben und einem Fluorophore beschriftet ERT wurden bei 2 – 8 ° c über Nacht inkubiert. Steuerelemente wie Qualitäts Kontrolle (WMZ), niedrig-Qualitätskontrolle (LQC) und negative Qualitätskontrolle (NQC) wurden überprüft und bestätigt auf gegenüberliegenden Ecken der Platte auf Platte Gleichförmigkeit zu beurteilen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

3. Mischen Sie die Proben und die Fluorophore beschriftet ERT von oben und unten mehrmals mit einer Mehrkanal-Pipette pipettieren. Wickeln Sie die Platten in die Folie und inkubieren sie über Nacht bei 2 – 8 ° C 14 – 20 Uhr.

(4) Tag 2: Hinzufügen der vorbereiteten Proben zu den Zellen

1. Die Inkubation bei 2 – 8 ° C Probe Inkubation Chicoréeblätter entnehmen und die Platten werden, indem sie in einem Wulst Bad bei 37 ° C für 10 – 15 min warm.
2. Entfernen Sie die Zellen aus dem CO₂ Inkubator. Führen Sie eine Sichtkontrolle der vergoldeten Zellen mit einem inversen Mikroskop um sicherzustellen, dass die Zellen gesund und gleichmäßig verteilt über den Brunnen^17,19erscheinen.
3. Eine Zellplatte nach der experimentellen Platte Karte 100 µL der zuvor gemischten Proben und Fluorophore beschriftet ERT hinzufügen.
4. Setzen Sie die Zelle Platte mit den zusätzlichen Proben wieder CO₂ Inkubator bei 37 ° C. Inkubieren Sie die Platte für 3 h und ± 15 min.
   Hinweis: Dieses Mal war als optimal für die Signal-Rausch-Antwort in der Probe im Labor hergestellt.
5. Zentrifugieren der Zellplatte 6 Minuten bei 320 X g in einer Tischplatte Zentrifuge bei 14 – 18 ° C. Bestätigen Sie die Anwesenheit eines Pellet-Zelle an der Unterseite der Platte Brunnen.
6. Halten Sie die Platte in einem Winkel von 30 – 45°. Entfernen Sie vorsichtig den überstand aus jedem Brunnen ohne zu stören die Zelle Pellet. Fügen Sie 200 µL 1 X DPBS auf die Zelle Pellet in jede Vertiefung zu die Zellen aufzuwirbeln.
7. Wiederholen Sie die Zelle, die Schritte für eine Gesamtmenge von 3 Wäschen waschen. Gehen Sie sofort zu Schritt 5 für die Zelle Lebensfähigkeit Färbung.

5. Tag 2: Handy-Lebensfähigkeit zu beflecken

1. Fügen Sie mithilfe einer Mehrkanal-Pipette 100 µL Arbeitslösung von 1 x Live/Dead Fleck in jede Vertiefung, für eine Emissionswellenlänge unterscheidet sich von der Fluorophore beschriftet ERT ausgewählt und zubereitet nach des Herstellers Anweisungen²².
2. Inkubieren Sie die Platte für 15 min bei RT im Dunkeln. Zentrifugieren Sie die Platte 6 Minuten bei 320 X g in einer Tischplatte Zentrifuge bei 14 – 18 ° C.
3. Entfernen Sie vorsichtig den überstand aus jedem Brunnen ohne zu stören die Zelle Pellet. Waschen Sie die Zellen 1 X mit 1 X DPBS.

6. Tag 2: Fixierung der Zellen mit 1 % Paraformaldehyd

1. Mit einer Mehrkanal-Pipette, 100 µL gekühlt (bei 2 – 8 ° C) 1 % Paraformaldehyd (PFA) verzichten Sie in jede Vertiefung.
2. Versiegeln Sie die Platten und sanft Puls Vortex mischen. Wickeln Sie die Platte in die Folie und legen Sie sie bei 2 – 8 ° C für mindestens 10 min Fixierung ermöglichen.
   Hinweis: Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, spritzt auf die Platte Dichtung.
3. Fügen Sie 50 µL 1 X DPBS in jede Vertiefung mit einer Mehrkanal-Pipette rauf und runter vor der Analyse.

7. die Durchflusszytometrie

1. Legen Sie die Platten auf das Durchflusszytometer mit der Platte Lader und ausführen.
2. Erwerben und die gemessene mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) mit Hilfe der Flow Cytometry Software aufzeichnen (siehe Tabelle der Materialien).
   Hinweis: Siehe Abbildung 2 als Beispiel für die Loader-Einstellungen. Flow Abtastrate, Probenvolumen, Mischen von Volumen, mischen Geschwindigkeiten und Anzahl der Mischungen sind für dieser Assay optimiert. Diese Kriterien können mit der "Pfeile oben" oder "nach unten" neben den Zahlen für jedes Kriterium, abhängig von der Flow Cytometry Erwerb Software²³angepasst werden.

Abbildung 2: Beispiel für die Flow Cytometer Loader Einstellungen. Die Loader-Einstellungen sollte für jede Probe optimiert werden, die entwickelt wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

3. Erstellen Sie eine Cytometer Analyse/Tore/Plots wie in Abbildung 3dargestellt.
   Hinweis: Die Tor-Erstellung und Anwendung können für jeden Flow Cytometry Software²³abweichen.

Abbildung 3: Flow Cytometry Strategie gating. Jurkat-Zellen wurden von der Gesamtereignisse getrennt und von Plotten Forward Scatter (FSC) vs. Side Scatter (SSC) Kanäle und zeichnen ein Tor um die Zielpopulation gesammelt. Unterhemden (Einzelzellen) wurden von Dubletten getrennt oder größere Zelle Aggregate mit dem FSC-Bereich (FSC-A) und FSC Höhe (FSC-H) Kanäle. Lebenden Zellen wurden durch Anspritzung auf Singulett Zellen negativ für eine Rentabilität Fleck gewählt. Der Median Fluoreszenzintensität (MFI) wurde in einzelne, live Jurkat-Zellen gemessen und ist als ein Histogramm dargestellt. Die MFI-Werte der Zellen mit der Droge Aufnahme blockiert (z.B.WMZ) und Zellen mit Kontrolle Beträge der Aufnahme werden angezeigt (rot und blau, beziehungsweise). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

4. Tote Zellen von der Analyse auszuschließen und ca. 10.000 Veranstaltungen²³aufzeichnen.

8. die Datenanalyse

1. Exportieren Sie die Daten (roh MFI), die Analyse-Software (siehe Tabelle der Materialien).
   Hinweis: Je nach der Analyse benötigt, kann die folgenden Daten-Analyse durchgeführt werden mit Analysesoftware.
2. Berechnen Sie den Mittelwert MFI doppelte Wells (QCs und Proben) und der Variationskoeffizient (% CV), die Ausbreitung Variabilität der Duplikate vom Mittelwert zu bewerten.
   
   
   
3. Für Proben und QCs, die in der Probe gezeigt wurden berechnen die Prozent signal Hemmung (% SI) bezogen auf die mittlere MFI von den für die QCs gepoolten Matrix CC.
   
4. Bei Bedarf berechnen Sie die Wiederherstellung Verhältnisse (RRs) für bestätigte QCs und Proben im Verhältnis zu den entsprechenden Bildschirm-Werten.
   

Ergebnisse

Am ersten Tag des Verfahrens einer eingefrorenen aliquoten Jurkat Zellen war aufgetaut und vergoldete und Prüflinge waren vorbereitet. Abbildung 1 zeigt eine Beispiel-Platte-Karte. Am zweiten Tag wurden die Proben mit Jurkat-Zellen vermischt und bei 37 ° C für ca. 3 h 15 min inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen, mit PFA fixiert und auf einem Durchflusszytometer analysiert. Abbildung 2 zeigt Beispiel Flow Cytometer Einstellungen.

Die Durchflusszytometrie gating Strategie wurde entwickelt, um die Menge der Fluorophor konjugiert Droge im Leben einzelner Jurkat Zellen²⁴ (Abbildung 3) messen. Die Zellen wurden aus den Trümmern von zeichnen ein Tor, das schließt zelltrümmer getrennt [in der Regel niedrige forward Scatter (FSC)] und abgestorbenen Zellen [in der Regel high-Side scatter (SSC)], verlassen nur lebenden Zellen für die Analyse²⁵. Einzelzellen wurden dann von zellcluster getrennt, indem man ein Tor, das die hohen FSC-Bereich und die niedrigen FSC Höhe²⁶ausschließt. Die Zellen wurden mit Fleckes Lebensfähigkeit alle Toten oder ungesunden Zellen ohne eine intakte Membran mit der Bezeichnung behandelt, und ein zusätzliches Tor wurde geschaffen, um die abgestorbenen Zellen²²auszuschließen. Die MFI das Leben einzelner Zellen wurde für die Analyse der Fluorophor konjugiert ERT-Aufnahme verwendet. Als Beispiel des Potenzials screening Untersuchungsergebnisse gehemmt die Matrix, gespickt mit einer hohen Menge an Ersatz Anti-Drogen-Antikörper positiv-Kontrolle [z.B.qualitativ hochwertige Steuerung (WMZ)] Fluorophor konjugiert ERT Aufnahme, was zu einem niedrigen MFI von ca. 300 (Abbildung 3). Im Gegensatz dazu sollten Zellen mit der Matrix in Ermangelung der Positivkontrolle Antikörper inkubiert haben eine höhere MFI (MFI = 37.830 in Abbildung 3), zeigt die Aufnahme der Fluorophor konjugiert ERT.

Die Neutralisierung der gewählten Positivkontrolle Antikörper für das Beispiel hier anhand der Mechanismus der Wirkung des Medikaments (d.h. die ERT-Aufnahme durch CI-M6PR). Ein Gremium von Fluorophore wurde auch getestet und für optimale Assay Empfindlichkeit und Dynamikbereich¹verglichen. CypHer 5e wurde aufgrund seiner erhöhten Fluoreszenz bei einem sauren pH-Wert getestet, die für einige ERTs als zusätzliche Maßnahme der lysosomalen Ausrichtung der Droge²⁷relevant sein könnten. Einem grünen Fluoreszenzfarbstoff (z. B. Alexa Fluor 488) und eine dunkelrote Fluoreszenzfarbstoff (z. B.Alexa Fluor 647) wurden ebenfalls untersucht. Ein Beispiel des wie verschiedene Fluorophore führen könnte ist in Abb. 4a und 4 bdargestellt. Im Beispiel hatte Alexa Fluor 647 ERT die beste Leistung durch seine höhere Sensitivität (z.B. die höchsten % SI bei der niedrigsten PC-Konzentration) und breiten Dynamikbereich (~ 3 Größenordnungen).

Abbildung 4: Beispiel ergibt sich aus verschiedenen Fluorophor-ERT Konjugate. (A) während der Assay-Entwicklung sollte eine Positivkontrolle (PC)-Verdünnung-Kurve mit verschiedenen Fluorophor konjugiert ERTs ausgewertet werden. Im Beispiel hier, zwei Fluorophor konjugiert ERTs (Alexa Fluor 488 und CypHer 5e) bei 6,25 µg/mL und ein heller Fluorophor konjugiert ERT (Alexa Fluor 647) bei 1,56 µg/mL wurden im Beisein von steigenden Konzentrationen von positiv-Kontrolle NAbs getestet. (B) dieses Panel zeigt die Kurven von zentrale A dargestellt, mit MFI um zu zeigen, die deutliche Steigerung im dynamischen Bereich mit einem Alexa Fluor 647 konjugiert ERT. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Die beschriebene Methode ist ein mehrstufiger Ansatz zur Erkennung, Bestätigung und ein quasi-quantitative Maß an NAb Titer³Interpolation. Der Assay ist bereit für die Validierung der Parameter einschließlich Assay Sensibilität, Präzision, Selektivität, Spezifität, Droge Toleranz, Robustheit, und Schnittpunkte sollte bewertet werden, je nach gegründet Führungen^1,3 .

Proben wurden bei % SI-Werte, die größer als das Screening Punkt (SCP) schneiden gewonnen wurden potenziell positive in diesem Test berücksichtigt. Die SCP war statistisch festgelegten medikamentennaive Proben aus einer repräsentativen Population Prüf- und Messmöglichkeiten einen relativen Rückgang Signal Intensität (SI)³. Anleitung (zum Beispiel von der FDA) empfehlen, dass die SCP liegt bei^{95 Perzentil der normalverteilten Daten} und Methoden für die Berechnung der SCP wurden¹an anderer Stelle ausführlich beschrieben. Jede Probe, die verringerte sich der Assay-Signal (gemessen als Erhöhung in % SI) auf oder oberhalb der SCP war entschlossen, die potenziell positiv sein, und Proben mit Ergebnissen, die höher als der SCP (ohne ändern oder verringern in % SI) gelten als negativ.

Proben, die positiv (% SI oberhalb der SCP) gezeigt wurden in der bestätigenden Test zu bestimmen, die Spezifität der NAbs, ERT getestet. Die bestätigende Assay wurde durch Pre-Inkubation Proben mit ERT konjugiert magnetische Beads, Droge-spezifische Antikörper oder hemmenden Faktoren zu entfernen durchgeführt. Die RR (das Verhältnis von bestätigenden MFI Screenings MFI) wurde ausgewertet, um festzustellen, dass die Anzahl der NAbs aus der Probe entfernt. Ein RR höher als die berechneten Schwellenwert der Positivität [d.h.die bestätigende Schnittpunkt (CCP)] das Vorhandensein von Anti-Drogen-NAbs angegeben. Wie in der Screening-Test sollte die KPC zunächst festgestellt werden, durch die Behandlung-naiven Proben aus einer repräsentativen Population in der bestätigenden Test Auswertung. CCP stützte sich auf eine statistisch ermittelte 1 % False-Positive-Rate und wurde die Schwelle Benennung einer Probe positiv bestätigt (Abbildung 5)³.

Proben, die geprüft und positiv bestätigt wurden seriell verdünnt und in der Titer-Test zur Bestimmung der relativen Ebene oder Titer von NAbs in jeder Probe getestet. Die höchsten Verdünnung, bei der eine Probe positiv testet, wenn es [z. B. der Titer Schnitt Punkt (TCP)] einen bestimmten Schwellenwert überschritten, ist die Probe Titer (Abbildung 5)^1,3.

Abbildung 5: Beispiel Beispiel Testergebnisse. Diese Platten sind Beispiele der Proben, die geprüft positiv oder negativ durch Screening entweder oberhalb oder unterhalb einer SCP 17,51 % SI. Positive Proben wurden dann in die bestätigende Assay mit magnetischen Beads Medikament konjugiert, die Droge-spezifischen Antikörper aus den Proben vor der Prüfung in der Probe zum Abbau getestet. Proben mit einem Recovery-Verhältnis (RR) größer als die bestätigende Schnittpunkt (d.h., RR = 1,315) galten positiv bestätigt werden. Proben, die positiv bestätigt wurden verdünnt, bis das Signal die Titer Punkt (TCP) überquert, um festzulegen, dass der Titer (Verdünnungsfaktor), zu dem das Ergebnis der Probe der Titer entspricht, Punkt schneiden schneiden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Assay-Wiederholbarkeit und Variabilität wurden über mehrere Tage und mit mehr als einem Analyst getestet. Die QCs waren zunächst in einem Batch vorbereitet und Sub-regelmäñig 1 X einsetzbar. Im Laufe der 3-d durchgeführt zwei Analysten den Test mit mehreren Sets von QCs um die Genauigkeit des Tests zu demonstrieren. In den Beispieldaten angezeigt die % CV der Inter- und Intra-Assay-Präzision für die QCs sind weniger als die FDA-Richtlinien Empfehlung % CV < 20 % (Abbildung 6)¹.

Abbildung 6: Beispiel für QC Präzisionsdaten generiert über drei Tage mit zwei Analysten. Die Präzisionsdaten wurden durch eine Varianzanalyse (ANOVA) mit Hilfe der Formel präsentiert in DeSilva Et Al. berechnet. ²⁸. Intra-Batch (innerhalb läuft) und intercharge (zwischen den Läufen) Statistik ausgewiesen als % CV Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Neutralisierende Antikörper oder andere Faktoren, die die ERT-Aufnahme durch CI-M6PR zu verhindern, haben das Potenzial, ERT Sicherheit oder Wirksamkeit¹auswirken. Daher ist es wichtig, NAbs in Thema Proben mit einem robusten Modell relevant für das Medikament Wirkmechanismus zu bewerten. Wir und andere haben festgestellt, dass die Leistung von einigen Bioassay-Formaten (z.B.Rezeptor Dimerisierung Luciferase Ausdruck, etc.) nicht mit Gesundheit Behörde Empfehlungen für Assay-Präzision, Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit ausgerichtet wird ²⁹. in der hier beschriebenen Methode Bioassay Jurkat-Zellen, die endogene CI-M6PR Ausdrücken werden eingesetzt, um NAbs spezifisch für die lysosomalen ERT Aufnahme zu überwachen. In Kombination mit einem Flow Cytometry auslesen, verwendet dieser Assay eine physiologische Zellmodell mit geeigneten Assay-Präzision, Sensibilität, Reproduzierbarkeit und hohem Probendurchsatz. NAb Erkennung mit einem Flow Cytometry Auslesen auch auf andere Indikationen angewendet wurde. Zum Beispiel wurden Methoden entwickelt, um bereits vorhandene Antikörper gegen Hepatitis E und Adeno-assoziierte Virus (AAV)^30,31.

Wichtige Schritte im Protokoll gehören die Auswahl einer geeigneten Fluorophor, unter Einbeziehung einer LQC, dass Monitore Empfindlichkeit, Test, ein ausreichendes Maß an Zellviabilität, und die strikten Einhaltung des Inkubationszeiten. Im hier vorgestellten Beispiel konjugiert Fluorophore (z.B.Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647 und CypHer 5e), um eine lysosomale ERT, sehr unterschiedlich in ihrer Leistung. Alexa Fluor 647, das auch die hellsten Fluorophor getestet-³²war, wurde für weitere Assay-Entwicklung ausgewählt. Es wird empfohlen, dass mehrere Fluorophore frühzeitig in der Entwicklung des Tests ermöglichen die optimale Empfindlichkeit und Dynamikbereich ausgewertet werden. Assay-Empfindlichkeit bei Stichproben sollten überwacht werden, durch die Einbeziehung einer LQC, die nahe genug an die Empfindlichkeitsgrenze ist, die es in 1 % der Test läuft¹fehl. Zusammen mit den WMZ fungiert die LQC auch als ein System Eignung QC Assay Drift Zeit³verfolgen. Optimale Zellviabilität und Leistung wird durch eine Zellbank der Einweg-Aliquote Vorbereitung und Qualifizierung in neuen zellbanken basierend auf vergleichbare QC Ergebnisse^3,18erreicht. Zelle und Fluorophor konjugiert Medikament Inkubationszeiten sind ebenfalls zentral für eine konsequente Testleistung, da Medikament Aufnahme mit der Höhe der Zeit erhöht, die das Medikament mit Zellen inkubiert wird. Zur Minimierung von täglichen Variabilität Medikament Aufnahme können Beispieldaten auf gepoolten Matrix Kontrollproben auf jeder Platte (z.B. den Schnittpunkt Kontrollproben in die oben beschriebene Methode) normalisiert werden. Ein weiterer wichtiger Faktor bei der Herstellung von konsistenten Daten mit dieser Methode ist die Platte Gleichförmigkeit zu überwachen und zu minimieren mögliche Randeffekte. Ein erstes Experiment gehören die Durchführung des Tests mit einer einzigen QC über die ganze Platte zwar robuster Experimente können, während Assay Validierung (z.B., Präzision und Genauigkeit)^{1 durchgeführt werden}. Dies zeigt die Bedeutung der Platte Karte Layout³³. Wie in der Platte Karte Beispiel dargestellt, platziert Qualitätskontrolle Proben auf beiden Seiten der Platte-Monitor eine Einheitlichkeit, die im Laufe der Zeit mit Levey Jennings Charts³⁴nachverfolgt werden kann.

Während dieser Assay überwacht NAbs und andere Faktoren, die lysosomalen ERT Aufnahme hemmen können, können zusätzliche Experimente durchgeführt werden, um eine Aufnahme-Hemmung durch Antikörper zu bestätigen. Eine Möglichkeit ist, Proben mit dem Protein A/G/L, zu behandeln, die unspezifisch Immunglobulin³⁵bindet. Wenn Proben nach Protein A/G/L Erschöpfung positiv getestet weiter, kann ein hemmender Faktor-Antikörper blockiert die Aufnahme der Droge verantwortlich sein. Die hier beschriebene Methode wurde entwickelt, um Messen Antikörper-vermittelte Aufnahme Hemmung und die positive Kontrolle und andere Tests, die Parameter noch einmal überdacht werden sollte, wenn ein hoher Prozentsatz der Thema Proben mit nicht-Antikörper hemmenden Faktoren gefunden werden.

Der Test kann auch weiter charakterisiert werden, um Fluorophore beschriftet Medikament Verkehre auf die entsprechenden zellulären Fach basierend auf das Medikament Wirkmechanismus zu demonstrieren. Im hier dargestellten Beispiel soll eine ERT CI-M6PR auf der Zelloberfläche binden und Verkehr es zu den Lysosomen. Wir berichteten zuvor die Ergebnisse mehrerer Experimente, die darauf hinweist, dass fast alle das Fluoreszenzsignal in Methode ergibt sich aus Fluorophore beschriftet ERT in den Lysosomen⁸beobachtet. Wir fanden, dass das Fluorophore beschriftet ERT Signal eliminiert wurde nach einer Behandlung der Zellen mit Cytochalasin B, die Verinnerlichung durch die Hemmung der Aktin Reorganisation stört. Auch zeigen Experimente, die mit Trypan blau oder verlangsamte Internalisierung externer Fluorophor abgeschreckt durch die Platzierung von Zellen bei 4 ° C, dass Fluorophore beschriftet ERT schnell verinnerlicht ist und sehr wenig Fluoreszenz aufgrund einer ERT an der Zelloberfläche gebunden ist. Lysosomale targeting wurde bestätigt durch die Visualisierung der Co Lokalisierung von pH-Sensitive Lysotracker Farbstoff mit dem Fluorophor konjugiert Medikament mit der konfokalen Mikroskopie. Eine Besonderheit für die Aufnahme durch CI-M6PR kann auch mit exogenen M6P mit beschrifteten Drogen für Rezeptorbindung konkurrieren überprüft werden. Ähnliche Experimente sollten durchgeführt werden, um die Aufnahme Kinetik und zellulären Lokalisation der Fluorophor konjugiert Drogen in anderen Tests zu überprüfen.

Diese Plattform zellbasierte Assays wurde zur NAbs für Medikamente zu studieren, die CI-M6PR Rezeptor-vermittelte Endozytose nutzen. Wir berichteten vor kurzem Ergebnisse mit dieser Assay-Plattform, die keine Korrelation zwischen der Entwicklung von einem NAb und Droge Wirksamkeit für Elosulfase Alfa^36,37gezeigt. Der Assay für klinische Tests, Parameter, einschließlich Assay Sensibilität, Präzision, Selektivität, Spezifität, Droge Toleranz, Robustheit, Probe zu validieren und schneiden Punkte, sollte nach etablierten Führungen^3, ausgewertet werden ⁴. es sollte auch beachtet werden, für lysosomale ERTs NAbs mit dem Potenzial, durch Bindung in der Nähe des Enzyms katalytische drogetätigkeit stören entwickeln kann. Im Allgemeinen betrachten wir diese Art der NAb, der eine niedrigere Priorität, da die raue sauer und proteolytische Umgebung der Lysosomen nicht günstig für Antikörper-ERT Interaktionen^2,39,40Überwachung. Es ist jedoch möglich, dass proteolytischen beständig NAbs bestehen und den katalytische Teil eines Medikaments⁴⁰hemmen kann. Dieser Assay Monitore Fluorophore beschriftet ERT Aufnahme zu den Lysosomen und eine Einschränkung des Tests ist die Unfähigkeit, proteolytischen beständig NAbs überwachen. Wenn diese Art der NAb basierend auf Sicherheit oder Wirksamkeitsdaten vermutet wird, sollte ein Test, der ERT Aktivität überwacht entwickelt und verwendet, um Proben zu testen.

Die Beurteilung der Immunogenität ist wichtig für das Verständnis der Auswirkungen der NAbs zur Arzneimittelsicherheit und Wirksamkeit. Die Identifizierung von NAbs in der Lage, die Hemmung in Vitro Medikament Aufnahme über CI-M6PR bietet die Möglichkeit für das Verständnis der NAb Aktivität in Vivo. Die hier vorgestellte Methode nutzt eine menschliche Zelllinie, die CI-M6PR um die Einmischung der Fluorophor konjugiert lysosomale ERT zelluläre Aufnahme Messen ausdrückt. Diese Methode wurde bereits verwendet, NAbs für mehrere ERTs lysosomale Speicherkrankheiten behandeln sollen zu überwachen. Dieser Assay-Plattform kann gelten für andere Methoden zur Untersuchung der Auswirkungen der NAbs auf biologischen Therapeutika, die zelluläre Internalisierung für ihre ordnungsgemäße Funktion benötigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,22 &Mikro; m Filtereinheit, 500 mL Vakuumfilterkolben	Corning	CLS430769
96-Well-Kulturplatten mit rundem Boden	Thermo-Nunclon	163320
Sterile Reagenzreservoire	VistaLab	3054-1004
96 Wells weiße Polystyrol-Mikroplatte mit rundem Boden	Corning	3605
96-Well-Polypropylen-Röhrchen, 8-Röhrchen-Streifen	Corning	4408
Magnetisches Bead-Separator-Röhrchengestell	V& P Scientific, Inc	VP 772F2M-1, VP 772F2R-2, VP 772F2R-3
DynaMag -2 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D
DynaMag -96 Magnet mit seitlichem Rand	Thermo Fisher Scientific	12027
BD FACSCanto II Durchflusszytometer	BD Biosciences
BD Hochdurchsatz-Probenehmer (HTS)	BD Biosciences
BioRad TC20 Automatisierter Zellzähler	BioRad	1450103
Mikroplattenschüttler	VWR	12620-928
Galaxy MiniStar Mikrozentrifuge	VWR	C1413
Gewebekultur CO2 Inkubator	Nuaire	NU-4750
Biosicherheitswerkbank	Labcono	Purifier Cell Logic +
Jurkat Cell Line	ATCC	TIB152&Handel;
Alexa Fluor 647 Proteinmarkierungskit	Thermo Fisher Scientific	A20173
Dynabeads M270 Streptavidin	Thermo Fisher Scientific	65306
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin	Thermo Fisher Scientific	21343
RPMI-1640 1x Medium	Life Technologies	A10491-01-500mL
Fötales Rinderserum (FBS)	ATCC	30-2020
Pen-Strep (100x) flüssige Formulierung	Corning	30-002-CI
1x DPBS ohne Calcium und	Magnesium Corning	21-031-CV
4% Para-Formaldehyd	Elektronenmikroskopie Science	15735-85
LIVE/DEAD Fixierbares violettes Flecken-Kit, für 405 nm Anregung	Life Technologies	L34955
Tween 20	Sigma	P1379-100 ml
Rinderserum Albumin	Sigma	3059
Gepoolte humane Matrix (z. B. humanes Serum oder Liquor)	Bioreclamation IVT	Angebot von der Website
anfordern VWR Polyester-Plattenfolie	VWR	60941
Dichtung & Probe Aluminiumfolie	Beckman Coulter	538619