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Methodenartikel

Beurteilung der Widerstandsfähigkeit gegen Tyrosin-Kinase-Inhibitoren durch eine Befragung von Signal Transduction Bahnen durch Antikörper-Arrays

7.2K Aufrufe

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DOI:

10.3791/57779

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19. September 2018

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1Lawrence J. Ellison Institute for Transformative Medicine, Center for Applied Molecular Medicine, University of Southern California

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Antikörper-Arrays zu Veränderungen im Signalwege in verschiedenen zellulären Modellen zu identifizieren. Diese Veränderungen, verursacht durch Medikamente/Hypoxie/ultra-violet Licht/Strahlung oder durch Überexpression/Herabregulation/Knockouts, sind wichtig für die verschiedenen Krankheitsmodelle und können angeben, ob eine Therapie wirksam werden oder Mechanismen der Drogen identifizieren kann Widerstand.

Zusammenfassung

Krebspatienten mit einer aberranten Regulierung der Protein-Phosphorylierung-Netzwerke sind oft mit der Tyrosin-Kinase-Inhibitoren behandelt. Annähernd 85 % Response-Raten sind häufig. Leider werden Patienten oft durch eine Änderung ihrer Signalwege Transduktion refraktär gegenüber der Behandlung. Eine Implementierung der Expression profiling mit Microarrays kann insgesamt mRNA-Ebene Änderungen erkennen und Proteomics erkennen die allgemeinen Änderungen im Protein-Ebene oder erkennen die Proteine beteiligt, aber die Aktivität der Signaltransduktion Wege können nur durch Vernehmung Post-translationalen Modifikationen der Proteine hergestellt werden. Infolgedessen ist die Fähigkeit, festzustellen, ob eine medikamentöse Behandlung erfolgreich ist oder ob Widerstand entstand, oder die Fähigkeit, Änderungen in der Signalwege charakterisieren eine wichtige klinische Herausforderung. Hier bieten wir eine ausführliche Erläuterung der Antikörper-Arrays als ein Werkzeug, das systemweite Änderungen in verschiedenen Post-translationalen Modifikationen (z.B. Phosphorylierung) identifizieren kann. Einer der Vorteile der Verwendung von Antikörper-Arrays enthält ihre Zugänglichkeit (ein Array entweder ein Experte für Proteomics oder teure Ausrüstung erfordert keine) und Geschwindigkeit. Die Verfügbarkeit von Arrays, die Ausrichtung auf eine Kombination von Post-translationalen Modifikationen ist die größte Einschränkung. Darüber hinaus möglicherweise unvoreingenommene Ansätze (Phosphoproteomics) besser geeignet für die neuartige Entdeckung, während Antikörper Arrays ideal für die am weitesten verbreitete zeichnet sich Ziele sind.

Einleitung

Die klinische Umsetzung von gezielten Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKI) hat Krebsbehandlung umgewandelt, indem Ärzte mit wirksame Instrumente, um die spezifische Proteine gezielt diese Fahrt neoplastische Transformation. Diese Verbindungen hemmen oder blockieren die Phosphorylierung von Proteinen gezielt durch Tyrosin-Kinasen1,2. TKIs wurden teilweise entwickelt, weil genetische Veränderungen in verschiedenen wichtigen Gene Signalisierung ausreichen, um Laufwerk Krebs Initiierung und Progression [z. B.epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), protoonkogenproduktes Tyrosin-Protein Kinase Src (SRC), BCR-ABL und menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2)]3,4. Die Auswirkungen der TKIs auf den Zellzyklus-5 und der molekularen Signalisierung Wege6 stellt eine Transformation von der ungezielte Molekular geführte Krebsbehandlung dar. Der entscheidende Vorteil von TKIs versus Chemotherapie ist die erhöhte Response-Raten und die geringere Gefahr der Toxizität auf gesunde Zellen7. Infolgedessen hat es Aufmerksamkeit auf die Erforschung und Entwicklung neuartiger TKIs erhöht.

Zugang zu den Ergebnissen der Genom-Sequenzierung mit dem Human Genome Project8,9,10 begann und bis heute mit verschiedenen nächsten Generation (NextGen) Krebs Sequenzierung Bemühungen [z.B., The Cancer Genome Atlas (TCGA)11,12]. Dies inspirierte viele experimentelle Methoden, die gleichzeitige informieren über Tausende von Genen und/oder geben unvoreingenommene Schnappschüsse von Genen oder Proteinen, die durch biologische Störungen13moduliert. Da die Verordnung der zellulären Funktion auf mehreren Ebenen aus der Transkription von Genen, die Post-translationale Modifikation von Proteinen und deren Aktivität auftritt wird ein vollständiges Verständnis der Ereignisse steuern die zelluläre Funktion Schließlich erfordern Sie eine Integration von Daten aus verschiedenen biologischen auslesen. Die Fähigkeit, die Boten-RNA (mRNA) Pegel Tausender Gene mit einer einzelligen gen Auflösung überwachen, hat die Möglichkeit, Rückschlüsse auf die Genfunktion und Interaktionen im Maßstab des gesamten Genoms machen erhöht. Die Interpretation der Gen-Expression-Arrays werden jedoch immer von Natur aus unvollständig ohne die Integration von anderen Ebenen der Verordnung: nämlich die proteingehalte Ausdruck, die Protein Modifikation Staaten und das Post-translationale Protein Änderungen (Phosphorylierung, Ubiquitylation, Methylierung, etc.). Hier beschreiben wir die Nützlichkeit des Antikörper-Arrays als Mittel zur Post-translationalen Modifikationen wichtiger Signalisierung Komponenten in Abhängigkeit von verschiedenen Bedingungen in einem einzigen Experiment14,15, zu befragen 16.

Phospho-Antikörper-Arrays können eingesetzt werden, zu unterscheiden und zu Änderungen in den Signal Transduction Bahnen16zu analysieren. Diese können durch eine genetische Veränderung oder Behandlungen von Zelllinien mit Kinase-Inhibitoren, Chemotherapeutika, Belastungen durch Glukose Entbehrung, Hypoxie oder Serum Hunger entstehen. Note, Resistenzen oder ein bestimmtes Gen kann up- oder Herabregulation auch Änderungen im Signal Transduction Bahnen17führen.

Resistenzen, entstehen beispielsweise durch Mutationen des Drug Targets Empfindlichkeit zu vermeiden. Bei Lungenkrebs, bekannt EGFR-Mutationen Rendern den Krebs zu bestimmten TKIs stoßunempfindlich, aber anfälliger für andere. Bei der Mutation17kann Alternative Signalwege aktiviert werden. Als eine breitere Anwendung zur Identifizierung der Transduktion Signalwege Widerstand und Hypoxie usw.beteiligt Phospho-Antikörper Arrays bieten einen besseren Einblick in und folglich zu verstehen, die Mechanismen beteiligt.

Technologien, die Bewertung der Protein Änderungen darstellen einen wichtigen Bestandteil der Systembiologie, weil sie oft eine regulatorische Funktion, z. B. Modulation der Aktivität eines Enzyms oder die physikalischen Wechselwirkungen zwischen Proteinen dienen. Die Bedeutung der Post-translationalen Modifikationen wird durch die Rolle des Protein-Phosphorylierung in fast alle extrazellulären ausgelöste Signal Transduction Bahnen18dargestellt. Traditionell, konnte die Identifizierung der Kinasen oder über den Status der Phosphorylierung von Proteinen auch von Western-Blot Analyse ermittelt werden, vor allem, wenn die Forscher nur 1 – 5 Ziele interessiert ist. Aber Western Blots sind sehr wählerisch und Vorkenntnisse voreingenommen sein können und möglicherweise verpassen wichtige Ziele als Ergebnis. Antikörper-Arrays bieten eine Medium-Durchsatz Auslesen der mehrere Ziele durch das Einbetten von verschiedenen Aufnahme-Antikörper [Pan-spezifische phosphorylierten Tyrosine(s), Anti-Ubiquitin usw.]auf einer festen Matrix (z.B., Glas oder Nitrozellulose). Sekundärantikörper geben Auskunft über bestimmte Proteine in einem Sandwich-basierte ELISA-Format (Abbildung 1). Dieser Assay wird leistungsfähiger und relevant wie mehr Ziele von Interesse sind oder der Vorkenntnissen nur15 ist. Die Phospho-Arrays sind breiter einsetzbar, da sie können Phosphorylierung sowie allgemeine Mengen des Proteins eine breitere Palette von Zielen in einem Experiment zu vergleichen und eine deutlich bessere Quantifizierung über Massenspektrometrie bieten. Dieses Verfahren gilt nicht für die Identifizierung von neuen oder bisher unbekannten Phosphorylierung Websites.

Große Massen Spektrometrie-basierte Proteomics könnte eingesetzt werden, um spezifische Phosphorylierung Standorte von Proteinen19. Obwohl diese Technik Tausende von Post-translationalen Veranstaltungen auflisten kann, erfordert es teuer Instrumentierung, engagierten experimentellen Pipelines und eine rechnerische Expertise, die außerhalb der Reichweite der meisten Forscher sind.

Antikörper-Arrays bieten eine gleichzeitige Anzeige auf verschiedenen Protein Auslesen16. Diese dürfen Änderungen im Protein Ubiquitylation (Ubiquitin Array) oder Phosphorylierung. Der entscheidende Vorteil dieser Array-Technologie ist, dass es wichtige Rückmeldungen auf den biologischen Zustand verschiedener biologischer Signalwege zugeordnet wichtige zellenparameter (Protein p53, 53 kDa, Rezeptor-Tyrosin-Kinasen und intrazellulären Signalwege) bietet gleichzeitig. Darüber hinaus ist es möglich, verschiedene Arraytypen um das Eindringen von einem Assay (z.B., Apoptose und Ubiquitin und Phosphorylierung) erhöhen zu kombinieren. Diese Fähigkeit, mehrere Arrays um verschiedene Post-translationalen Änderungen in mehreren Proben gleichzeitig in einer Zeit und Kosten wirtschaftlicheren Weise zu bewerten, die nicht spezielle Instrumente oder Know-how erfordert zu kombinieren ist ein wesentlicher Vorteil im Fall der Antikörper-Arrays.

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Protokoll

(1) Proteingewinnung

  1. Platte 5 x 106 Zellen auf einer 10 mm Gewebekultur Platte (oder Kolben) in einer Gewebekultur-Haube. Zählen der Zellen zum Zeitpunkt der Beschichtung mit einem automatischen Zelle Zähler oder Hemocytometer. Alternativ, schätzen Sie die Zellzahl.
  2. Spülen Sie die Zellen gewachsen auf 10 mm Platte (oder Kolben) gründlich 3 X 10 ml von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH = 7,4). Achten Sie darauf, alle PBS zu entfernen, bevor Sie Hinzufügen des Lyse-Puffers.
    Hinweis: Die Lyse-Puffer wird in der Regel mit dem Kit bereitgestellt. Wenn dies nicht der Fall ist, verwenden Sie dann eine Tests testpuffer (RIPA) oder jeder anderen Zelle Lysis Puffer mit einem Cocktail von Phosphatase, Protease-Inhibitoren.
  3. Lösen Sie 1 x 107 Zellen/mL von Zellen in der Lyse Puffer durch die Zellen die richtige Menge an Puffer hinzu und Schaben die Zellen mit einer Zelle-Spachtel in die Lyse-Puffer. (z.B.für HeLa-Zellen und MiaPaCa-2, verwenden 600 µL pro 10 cm Platte).
  4. Pipette lysate rauf und runter (ca. 10 X) und überträgt es auf eine neue 1,5 mL Tube.
  5. Inkubieren Sie die Lysates für 30 min bei 4 ° C, vorzugsweise auf einer Wippe/Shaker. Drücken Sie die lysate durch eine Spritze mit einer Nadel 27 G für 10 X um eine ordnungsgemäße Störung der Cell membrane(s) zu gewährleisten. Beschallen Sie alternativ die lysate. Die Lysates bei-20 ° C zu speichern oder sofort verwenden.
  6. Lysate bei 14.000 X g bei 4 ° C für 15 min zentrifugieren und übertragen des Überstands auf eine saubere 1,5 mL-Tube.
  7. Die Menge des gesamten Proteins durch Bicinchoninic Säure-Assay (BCA)20 oder ein Äquivalent wie Lowry oder Bradford quantitate und weiter mit mindestens 50 – 400 μg. Verwenden Sie die Proteine sofort oder Aliquote und Einfrieren bzw. Lagern sie bei-70 ° C (vermeiden Sie mehrere Gefrier-tau-Zyklen).

(2) menschliche Creatinphosphokinase Array

  1. Bringen Sie alle Reagenzien auf Raumtemperatur, bevor Sie beginnen (für ca. 1 h).
    Hinweis: Alle Reagenzien und Kunststoff Verschleiß sind im Kit enthalten.
  2. Alle Reagenzien-frisch (Array-Puffer) vor Beginn der Verfahren im Anschluss an die Anweisungen des Herstellers zubereiten (abhängig von der Wahl der Ziele/Arrays, die Anleitung könnte leicht variieren).
  3. Rekonstruieren Sie die Erkennung Antikörper Cocktails in 100 μl deionisiertes Wasser oder folgen Sie den Anweisungen des Herstellers sie für 1,5 mL Reagenzglas zur Verfügung gestellt differieren sollten.
  4. Bereiten Sie 1 x Waschpuffer durch Verdünnung 40 mL 25 x Waschpuffer in 960 mL entionisiertem Wasser zu und mischen sie durch invertieren.
    Hinweis: Die Kristalle lösen sich bei Raumtemperatur. Der Puffer kann Vergilben im Laufe der Zeit aber wird immer noch funktionieren.
  5. Pipette 1 mL der Array-Puffer 1 in jede Vertiefung eines 8-Brunnen Multi-Fach (oder 2 mL in ein 4-gut Multi-Fach).
  6. Entfernen Sie mit einer flachen Spitze Pinzette die Array-Membranen zwischen den Schutzfolien zu und legen Sie sie in die Vertiefungen. Stellen Sie sicher, dass die Zahlen auf der Membran nach oben gerichtet sind.
    Hinweis: Beim untertauchen verschwindet der Farbstoff auf der Membran.
  7. Die Schale mit einem Deckel abdecken und auf einen rockigen Plattform Shaker für 60 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    Hinweis: Dies ist die Membran Blockierungsschritt.
  8. Während der Inkubationszeit bereiten Sie die Proteinproben. Fügen Sie 50 – 100 μg des Gesamt-Protein. Verdünnen Sie die lysate, mit einem maximalen Volumen von 334 μL mit Lyse Puffer zu einem Endvolumen von 1 mL.
    Hinweis: 50 – 100 μg des gesamten Proteins genügt in der Regel.
  9. Abzusaugen Sie Array-Puffer 1 sorgfältig und inkubieren Sie die Membranen mit 1 mL der Proben über Nacht bei 2 – 8 ° C auf einem schaukelnden Plattform-Shaker.
    Hinweis: Nicht Touch/Kratzer die Membranen.
  10. Waschen Sie am nächsten Tag das Array durch sorgfältig jedes Array entfernen und platzieren es in einzelne Kunststoffbehälter (ca. 8 x 11 cm2) mit 20 mL 1 X Waschpuffer. Waschen Sie die Membranen 3 x 10 min auf einer rockigen Plattform in 1 x Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  11. Pipette 20 μL des rekonstituierten Antikörpers cocktail aus Schritt 1 x Array Puffer 2 2,3: 1 mL. Geben Sie 1 mL dieser Lösung in jeder 8-verwendet werden.
  12. Entfernen Sie vorsichtig die Membranen von der Rinne waschen. Tupfen Sie die untere Kante auf das Küchenpapier entfernen überschüssigen Waschpuffer und übertragen Sie sie zurück in das Fach mit den Antikörper-Cocktails. Das Tablett mit dem Deckel abdecken und 2 h bei Raumtemperatur auf einem schaukelnden Plattform inkubieren. Spülen Sie die gebrauchte Tabletts mit dH2O und trocknen Sie sie zur späteren Verwendung.
  13. Sorgfältig entfernen Sie jedes Array und legen Sie sie wieder in die saubere individuelle Kunststoffbehälter (ca. 8 x 11 cm2) mit 20 mL 1 X Waschpuffer. Waschen Sie sie 3 x 10 min mit der Waschpuffer auf einer rockigen Plattform bei Raumtemperatur.
  14. Verdünnen Sie Streptavidin-HRP (versehen mit dem Kit) oder Streptavidin-fluoreszierenden Farbstoff (für mehr quantitativen Nachweis) 1:1,000 1 x Array Puffer 2 im Reagenzglas 15 mL.
  15. Die Membranen in die 8-Wohlen-Teller mit der Lösung von HP zurück und inkubieren sie 30 min bei Raumtemperatur auf einem schaukelnden Plattform (wenn mit Fluoreszenz, wickeln Sie das Fach in Alufolie zu jeder Lichteinfall zu vermeiden).
  16. Entfernen Sie den überschüssigen Puffer, indem man die Membran zwischen 2 Stück 5 mm 3 M Papier. Brüten Sie für die Bildgebung mit einem x-ray Film/Chemolumineszenz Imager die getrockneten Membranen mit einer HRP-Erkennung-Lösung (mischen Sie die zwei Chemolumineszenz Lösungen 1:1) für 3 min und legen Sie die Membran in eine klare Plastikfolie Beschützer.
    Hinweis: Getrocknete Membrane(s) können auch in einen fluoreszierenden Imager erkennt das Fluoreszenzsignal gestellt werden; minimieren Sie die Belichtung auf die Membrane vor Bildgebung. Vermeiden Sie für eine Quantifizierung der x-ray Film oder Imager Dateien Überbelichtung. Die meisten Chemilumineszenz/fluoreszierend Imager haben eine Funktion, eine Sättigung des Signals zu vermeiden.

(3) Datenanalyse

  1. Downloaden Sie ImageJ, Bildverarbeitungs-Programm21, und installieren Sie die Software.
  2. ImageJ durch Doppelklick auf das "ImageJ-Symbol"zu öffnen. Wählen Sie das Bild analysiert werden, indem Sie auf "Datei" in der Menüleiste, dann wählen Sie "Öffnen" aus dem Dropdown-Menü und Durchsuchen Sie die Computerdateien für das Bild von Interesse. Klicken Sie auf die Datei, um es zu öffnen.
  3. Invertieren Sie das Bild für die Analyse (schwarze Flecken auf dem weißen Hintergrund, weiße Flecken auf schwarzem Hintergrund) durch Klicken in der Menüleiste auf "Bearbeiten" und wählen Sie 'Invert' aus der Drop-Down-Menü.
  4. Wählen Sie das "ovale Symbol" aus der Symbolleiste (die zweite Option in der ImageJ-Symbolleiste). Zeichnen Sie eine Kreis/Oval durch Klick auf das Bild (schwarzes Kreuz) und bewegen Sie die Maus. Passen Sie die Größe/Form des Kreis/Oval, die Punkte auf den Dot-Blot einzukreisen.
  5. Klicken Sie auf "Analysieren" in der Menüleiste und wählen Sie dann "Maßnahme" aus dem Dropdown-Menü automatisch ein neues Fenster mit den Werten des ausgewählten Bereichs (Bereich, Mittelwert, Minimum und Maximum) geöffnet.
  6. Bewegen Sie die Kreisfläche durch Ziehen des Kreises von der Mitte (setzen Sie den Punkt des Pfeil rechts in der Mitte) und legen Sie sie um den nächsten Messbereich (Punkt). Alle Spots von Interesse, die positive Kontrolle, die negativ-Kontrolle und den Hintergrund für die Analyse zu messen.
    Hinweis: Die negative-Kontrolle ist der PBS, der Hintergrund ist ein Teil der Membran ohne irgendwelche Flecken (irgendein Teil tun wird) und die Positivkontrolle ist eine Kontrolle des Herstellers.
  7. Wählen Sie die negative PBS-Spots und subtrahieren Sie den Wert von jeder Stelle. Durchschnitt der Intensität für jedes Paar doppelte Punkte, jeder Rezeptor-Tyrosin-Kinase (RTK) darstellt. Jede durchschnittliche Intensität kann auf das Steuerelement, das die Falte Änderung berechnen beziehen.

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Ergebnisse

Um die Wirkung von TKI-Resistenz auf Transduktion Signalwege in Zelllinien zu untersuchen, wurden vier Proben analysiert. Eine Kontrollprobe (H3255r1) und 3 TKI-resistente Zelllinien (H3255r2-4) (Abbildung 2) bezogen sich auf die vor Ort Antikörper-Vorlage (Abbildung 3). Alle 4 Proben waren bereit, unter Verwendung dieses Protokolls. Für die Demonstration der Analyse der Antikörper-Arrays (Abbildung 4

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Diskussion

Ansätze, die viele biologische anzeigen zu kombinieren sind von Natur aus eine genauere Darstellungen der zellulären Maschinerie in einem Experiment durchgeführt. Das Aufkommen des Phospho-Antikörper Arrays ermöglicht eine schnelle Charakterisierung des Musters der Änderungen, die informativer als der Änderungsstand jeder einzigen Proteins werden kann. Die allgemeine Workflow für die Anwendung des Phospho-Antikörper Arrays basiert auf einer Änderung in Serin, Threonin oder Tyrosin. Dieses Beispiel konzentriert sich auf d...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir sind dankbar für die großzügige finanzielle Unterstützung von Lawrence J. Ellison Institut für Transformative Medizin der USC (ein Geschenk an David Agus). Wir freuen uns über die Unterstützung der Herbst Beemer und Lisa Flashner führt zu der Generation und Veröffentlichung dieses Manuskriptes. Wir danken Laura Ng für ihre administrative Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Odysee SA ImagerLi-Cor BiosciencesFluoreszenz-Imager
1,5 mL RöhrchenEppendorf22363212
ZellschaberFalkon (Corning)353085
Dulbeco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Corning21-031-CVWaschpuffer für die Proteinextraktion
Gewebekulturschale 100 mmTRP93100
ICC Insulinspritze U100Becton Dickinson32941227 G5/8,  1 mL für die Nadelbehandlung von Proteinproben
Protein Profiler ARRAY Forschung & Forschung DARY003BHumanes Phospho MAPK Array
Protein Profiler ARRAY Forschung & Forschung DARY002BHumanes Phosphokinase-Array
Zentrifuge Eppendorf 5430REppendorfTischzentrifuge
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher23225
SpectraMAX M2Molecular DevicesAbsorptions-Reader für die Proteinquantifizierung
IRDye 800CW StreptavidinLi-Cor Biosciences925-32230Streptavidin-Konjugat für den Fluoreszenznachweis
LabGard ES Klasse II, Typ A2 BiosicherheitswerkbankNuAireNU-425-400Gewebekulturhaube
TC20 automatisierter ZellzählerBio-Rad1450102Zellzähler
Halt Protease & Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (100x)Thermo Fisher78446
RIPA-PufferSigmaR0278
SchalldämpferFisher ScientificF60Ultraschallgerät
Rocking Platform ShakerVWR10860-780
ImageJNIH Open Sourcehttps://imagej.net/Welcome
SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64 Bit)Microsoft

Referenzen

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