Method Article

Einzellige Analyse der Immunophenotype und Produktion von Zytokinen im peripheren Blut über Masse Zytometrie

DOI:

10.3791/57780

⸱

June 26th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2OMNI Biomarkers, Development Sciences, Genentech, 3Department of Pediatrics, Division of Allergy and Immunology, University of Colorado School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir einen Einzellige Proteomic Ansatz um Immune phänotypische und funktionelle (intrazelluläre Zytokin Induktion) bewerten Veränderungen in peripheren Vollblut Proben, über Masse zytometrie analysiert.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zytokine spielen eine zentrale Rolle in der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten. Daher wurde die Messung der Zytokin Ebenen der Schwerpunkt von mehreren Studien in einem Versuch, die genauen Mechanismen zu verstehen, die zum Zusammenbruch der Selbsttoleranz und anschließende Autoimmunität führen. Ansätze bisher basieren auf der Studie einen spezifischen Aspekt des Immunsystems (Single oder paar Zelltypen oder Zytokine) und bieten keine umfassende Beurteilung der komplexen Autoimmunerkrankung. Während Sera-basierten Studien Patienten wichtige Erkenntnisse zur Autoimmunität geleistet haben, bieten sie nicht die spezifische zelluläre Quelle der Dysregulated Zytokine entdeckt. Eine einzellige Gesamtkonzept für die Produktion von Zytokinen in mehreren Immunzelle Teilmengen im Rahmen des "intrinsische" Patienten-spezifischen Plasma zirkulierenden Faktoren zu bewerten ist hier beschrieben. Dieser Ansatz ermöglicht die Überwachung des Patienten-spezifischen immun Phänotyps (oberflächenmarker) und Funktion (Zytokine), entweder in seiner Heimat "inneren pathogenen" Krankheit Staat, oder in der Gegenwart von Therapeutika (in Vivo und ex Vivo).

Introduction

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Autoimmunerkrankungen sind eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität 3-8 % der Bevölkerung betroffen. In den Vereinigten Staaten, autoimmune-Erkrankungen gehören zu den führenden Todesursachen bei junge und Mittelalte Frauen (Alter < 65 Jahre)1,2. Autoimmune-Erkrankungen zeichnen sich durch heterogene klinische Präsentation und unterschiedlichen zugrunde liegenden immunologische Prozesse. Das Spektrum der Heterogenität ist über verschiedene Störungen, wie gemeinsame Beteiligung bei der rheumatoiden Arthritis (RA) und neurologische Erkrankung bei multipler Sklerose (MS) vertreten. Dieses Maß an Heterogenität zeigt jedoch auch innerhalb einer einzelnen Störung, wie systemischer Lupus erythematodes (SLE): bei einigen Patienten können mit renal Pathologie präsentieren, während andere leiden an hämatologischen oder gemeinsame Beteiligung3.

Die zugrunde liegenden immunpathogenese in Autoimmun-Erkrankungen spiegelt die klinische Heterogenität, mit Auto - und hyper-Aktivierung von angeborenen und der adaptiven Immunzelle Teilmengen und damit einhergehende Dysregulated Produktion von Zytokinen. Während Zytokine eine zentrale Rolle in der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten spielen, nachweislich verstehen ihre besondere Rolle in den Mechanismus der Krankheit eine Herausforderung sein. Zytokine sind geprägt von Pleiotropie (ein Zytokin kann mehrere Effekte auf verschiedene Zelltypen haben), Redundanz (mehrere Zytokine können die gleiche Wirkung haben), Dualität (ein Zytokin kann pro- und antiinflammatorische Effekte unter verschiedenen Bedingungen haben), und Plastizität (Zytokine können in eine Rolle unterscheidet sich von der "original", je nach Umgebung geformt werden)4,5,6. Folglich können nicht Populationsebene Methoden heterogene zelluläre Reaktionen auf die gleichen "Zytokin-Milieu" unterscheiden. In ähnlicher Weise bieten Studiendesigns, die sich auf einen spezifischen Aspekt des Immunsystems (eine einzelne Zellentyp oder Cytokine), keine Gesamtbewertung aller Elemente in komplexen Autoimmunkrankheit beteiligt. Während Sera-basierten Studien Patienten wichtige Erkenntnisse zur Autoimmunität geleistet haben, bieten sie nicht die spezifische zelluläre Quelle der Dysregulated Zytokine entdeckt.

Vor kurzem haben wir einen einzelligen Proteomic Ansatz zur Bewertung gleichzeitig mehrere Arten von Immunzellen und ihre verschiedenen Zytokin-Störungen im Umfeld des Patienten spezifische "pathogenen" peripheren Blutplasma zirkulierende Faktoren zu erkennen. Die hier beschriebene Workflow zeichnet sich durch die Verwendung von intakten peripheren Vollblut-Proben, im Gegensatz zu isolierten peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs). Peripheren Blut stellt die meisten physiologisch relevante Fahrzeug immun-vermittelte systemerkrankung, einschließlich 1) nicht-mononukleären Blutzellen oft eingebunden in Autoimmunerkrankung (d.h., Neutrophilen Granulozyten und Thrombozyten) und Plasma (2) studieren zirkulierenden Faktoren wie Nukleinsäuren, Immunkomplexe und Zytokine, haben die immun aktivierende Rollen. Erfassen der "inneren pathogenen" Dysregulated Produktion von Zytokinen, peripherem Blut Proben unmittelbar nach der Blutentnahme (T0, Stunde Null), und nach 6 h Inkubation bei 37 ° C (physiologische Körpertemperatur) mit einem Protein-Transport erfolgt Inhibitor bei fehlender exogene anregende Zustand (T6, Zeit 6 h), Produktion von Zytokinen (Akkumulation, T6-T0) erkennen, die die "intrinsische" Krankheitszustandes (Abbildung 1) widerspiegeln würde. Dysregulated Prozesse, die über widerspiegeln oder unter Aktivierung der Signalwege in Immunreaktionen relevant für die Krankheit, periphere Blutproben sind zu studieren (6 h Inkubation bei 37 ° C mit einem Protein-Transport-Inhibitor) mit einer exogenen behandelt Bedingung, die Pathogenese der Krankheit, wie Toll-Like-Rezeptor (TLR) Agonisten bei SLE (T6 + R848, mal 6 h mit 1 µg/mL R848), um die Produktion von Zytokinen zu erkennen, die eine Reaktion auf Nukleinsäuren widerspiegeln würde reflektiert anregend (Vergleich T0 vs. T6 vs. T6 + R848, Abbildung 1). Um immunmodulatorische Effekte von verfügbaren Therapeutika ex Vivo, studieren, wie sie die präzise immun Dysregulated Prozesse für bestimmte Patienten betreffen, werden mit einem JAK Inhibitor bei den relevanten therapeutischen peripherem Blutproben behandelt. Konzentration (hier 5 Umm Ruxolitinib; T6 + 5R, mal 6 h mit 5 Umm Ruxolitinib), zum Erkennen von Änderungen in "intrinsische" Krankheit Staat als Reaktion auf das Medikament (T0 vs. T6 vs. T6 + 5R, Abbildung 1). Ein JAK Inhibitor wurde für diese Studie ausgewählt, weil JAK-Hemmer nachweislich erfolgreich bei der Behandlung von Autoimmun-Krankheiten wie RA

Um gleichzeitig in mehreren Immunzelle Teilmengen, periphere Blutproben von SLE beschriebenen Dysregulated-Prozesse bewerten wurden Patienten und gesunden Kontrollpersonen verarbeitet, wie oben beschrieben und analysiert durch Masse zytometrie. Masse zytometrie, auch bekannt als Zytometrie-Time-Of-Flight, bietet einzellige Analyse von über 40 Parametern ohne Probleme der spektralen7,8,9überlappen. Diese Technik nutzt seltene Erden Metall-Isotope in Form von löslichen Metall-Ionen als Tags an Antikörpern, statt Fluorophore10gebunden. Zusätzliche Details bezüglich der Masse zytometrie technological Platform (d.h., tuning und Kalibrierung, Probe Erwerb) finden Sie im Leipold Et Al. und McCarthy Et al. 11 , 12 High-Dimensionalität der Masse zytometrie ermöglicht gleichzeitige Messung mehrerer Zytokine in angeborene und adaptive Immunzellen Teilmengen mit einzelligen Granularität (Table of Materials).

Aktuelle konventionellen klinischen und Labor-Parameter sind oft nicht empfindlich oder spezifisch genug, zur Erkennung von laufenden Krankheitsaktivität oder die Reaktion auf bestimmte Immunmodulatoren13, reflektieren die Notwendigkeit, das zugrunde liegende Immunsystem besser abzugrenzen Änderungen, die Schübe zu fahren. Angesichts die Allgegenwart der Cytokine Dysregulation bei Autoimmunerkrankung, haben eine Vielzahl von Behandlungsansätzen, die Antikörper oder kleine Molekulare Inhibitoren targeting Zytokine oder signalproteinen beteiligt bei der Regulierung der Produktion von Zytokinen verwenden vor kurzem entstanden. In ihrer grundlegenden Form bietet der hier beschriebene peripherem Blut analytische Ansatz eine Plattform um patientenspezifische Dysregulated Zelle Teilmengen und ihre abnorme Zytokin-Produktion in Autoimmunerkrankung mit systemischen Manifestationen zu identifizieren. Diese Methodik ermöglicht die Personalisierung von therapeutischen Möglichkeiten wie spezifische Dysregulated Zytokine identifiziert werden können, und eine spezifische Behandlung, die Optionen Ex Vivo getestet zu ihrer Fähigkeit, Immunomodulate zu beurteilen Patienten spezifische Krankheit Prozesses.

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Protocol

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Alle hier beschriebene Methoden sind durch die Colorado mehrere institutionelle Review Board (COMIRB) von der University of Colorado genehmigt worden. Alle unten beschriebene Verfahren sollte in einem sterilen Gewebekultur Abzug durchgeführt werden, sofern nichts anderes mit gefilterten Pipettenspitzen und alle Reagenzien gefiltert.

1. Vorbereitung der Reagenzien für die peripheren Vollblut Verarbeitung

  1. Bereiten Sie Ruxolitinib Lager Aliquote (10 – 15 μl/Vial zur Einzelnutzung) bei 10 mM durch Verdünnung der lyophilisierte Reagenz in DMSO gemäß Herstellervorschrift (Shop bei-80 ° C). Halten Sie DMSO Konzentrationen in allen Tests einschließlich unstimulierte Kontrollen unter 0,2 % (Vol/Vol).
  2. Bereiten Sie R848 (Resiquimod) Lager Aliquote (10 – 15 μl/Vial zur Einzelnutzung) bei 1 μg/μL durch Verdünnung der lyophilisierte Reagenz in sterilem Wasser als die gemäß Herstellerangaben. Shop bei-80 ° C.
  3. Bereiten Sie Lipopolysaccharid (LPS) Lager Aliquote (5 μl pro Fläschchen für einmaligen Gebrauch nur) bei 1 μg/μL durch Verdünnung der lyophilisierte Reagenz in sterilem Wasser gemäß Anweisungen des Herstellers. Shop bei-80 ° C.
  4. Bereiten Sie die Zelle Färbung Medien (CSM) mit PBS, 0,5 % BSA und 0,02 % NaN3.
  5. Erwerben Sie und halten Sie den Protein Transport-Inhibitor (PTI) Cocktail (Table of Materials) bereit.
  6. Tauen Sie auf und verdünnen Sie der Ruxolitinib Lager Ampulle (10 mM) 01:10 in sterilen PBS (1 mM). Bei Raumtemperatur in einer Gewebekultur Kapuze beiseite.
  7. Auftauen und verdünnen das R848 Lager Fläschchen (1 µg/µL) 01:10 in sterilen PBS (0,1 µg/µL). Bei Raumtemperatur in einer Gewebekultur Kapuze beiseite.
  8. Auftauen und die LPS Lager Fläschchen (1 µg/µL) 1: 100 in sterilen PBS verdünnen (0,01 µg/µL). Bei Raumtemperatur in einer Gewebekultur Kapuze beiseite.
  9. Wärmen Sie sterile RPMI (keine L-Glutamin) im Wasserbad standard 37 ° C (für mindestens 10 min vor).
  10. Verdünnen Sie die Lyse/Fix-Puffer mit 1:5 in gefilterten DdH2O (arbeiten Konzentration) auf die Tischplatte (muss nicht steril sein).
    Hinweis: 1 mL Vollblut benötigt 20 mL arbeiten Konzentration der lyse/Fix-Puffer.
    1. Lyse/Fix Puffer für 5 Bedingungen von 1 mL Vollblut je (mindestens 100 mL) zu machen. Aliquoten 20 mL der Arbeit Konzentration der Lyse/Fix Puffer in 50 mL konische Röhrchen pro Milliliter Vollblut (halten die Lyse/Fix-Lösung bei 37 ° C bis benötigt). Die Bedingungen auf den konischen Rohren mit lyse/Fix Puffer wie folgt zu kennzeichnen: T0 (Zeitpunkt Null), T6 + 5R (6 h mit 5 Zeit Umm Ruxolitinib), T6 + R848 (Zeitpunkt 6 h mit 1 μg/mL R848), T6 + LPS (mal 6 h mit 0,1 μg/mL LPS), T6 (Zeitpunkt 6 h).
  11. Label Runde Unterseite sterile Polystyrol Rohre mit Kappen und 1 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit der selben Nomenklatur wie in Schritt 1.10.

2. Stimulation und Verarbeitung von peripheren Vollblut (Abbildung 1)

  1. Legen Sie den beschrifteten Rundrohre unten Polystyrol aus Schritt 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) auf einem Gestell.
    Hinweis: Die folgenden Schritte sind bei dieser Art von Rohr durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Kappe die Rohre bei der Übertragung zwischen der Gewebekultur Haube und Inkubator zu Sterilität.
  2. Fügen Sie 1 mL von 37 ° C RPMI (keine L-Glutamin) für jedes der Rohre (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6). Das blutsammelröhrchen mehrmals zu invertieren, jedes Rohr 1 mL Vollblut hinzu, und pipette nach oben und unten mehrmals gründlich mit RPMI mischen (Verdünnung mit RPMI verhindert Verklumpung des Blutes während der Inkubationszeit von 6 h).
  3. Hinzufügen von 10 μL der 01:10 Ruxolitinib T6 + 5R. Mischen Sie gründlich, mit einer Pipette P1000. Platzieren Sie die Zahnstange von Rohren im Inkubator bei 37 ° C und beginnen mit der Zeitmessung der Inkubation (T = 0).
  4. Die T0-Probe wie folgt zu verarbeiten.
    1. Der gesamte Inhalt der T0-Röhre in einem beschrifteten konischem Rohr mit 20 mL 37 ° C arbeiten Konzentration lyse/Fix Puffer Pipette. Zur Optimierung der Zelle Erholung spülen Sie das Rohr mit Konzentration lyse/Fix Puffer arbeiten. Durch Umkehrung der konischen Röhre mischen.
    2. Inkubation bei 37 ° C für 15 min zur Lyse und Fixierung ermöglichen. Führen Sie nach Fixierung alle weiteren Schritte auf der Tischplatte. Zentrifugieren Sie Zellen bei 500 X g für 5 min bei Raumtemperatur.
    3. Den überstand abgießen. Aufschwemmen der Zellen in 1 mL Eis kaltem PBS Pellet aufzubrechen, dann füllen mit PBS kegelförmig bis 15 mL Volumen.
    4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Den überstand abgießen. Wiederholen Sie die PBS waschen (Schritte 2.4.3–2.4.4), wenn Pellets rot sind. Aufzuwirbeln Sie die Zellen in 1 mL der CSM, brechen Sie die Tablette, dann übertragen auf die beschrifteten Microcentrifuge Schlauch (Schritt 1.11) für Antikörper Färbung. Nehmen Sie eine 10 µL Probe mit einem automatisierten Zelle Zähler oder Hemocytometer Zellen zu zählen.
      Hinweis: Da alle Zellen zu diesem Zeitpunkt fixiert sind, ist es nicht erforderlich, einen Lebensfähigkeit Fleck aufzunehmen.
    5. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie den überstand, so dass das Pellet in ~ 60 µL Restvolumen. Halten Sie diese Pellet auf Eis, bis Proben von anderen Erkrankungen Verarbeitung abgeschlossen haben.
  5. Bei T = 30 min nach der Gewebekultur Haube Rohr Rack (Schritt 2.3) und führen Sie die folgenden.
    1. Hinzufügen von 10 μL von 0,1 μg/μL R848 T6 + R848. Mischen Sie gründlich, mit einer Pipette P1000.
    2. T6 + LPS 10 μL von 0,01 μg/μL LPS hinzufügen. Mischen Sie gründlich, mit einer Pipette P1000.
    3. T6, T6 und T6 + 5R, LPS (aber nicht zu T6 + R848) 4 μl Protein Transport Inhibitor (bestand bei 500 X) hinzufügen und wieder die Proben in den Inkubator bis T = 6 h. Mischung gründlich mit einer Pipette P1000 alle 2 h.
      Hinweis: R848 ist ein endoplasmic TLR-Agonist und erfordert daher eine zeitliche Verzögerung bei der Addition von Protein Transport Inhibitor, um Zugang zu ihren Ziel-Rezeptor zu ermöglichen.
  6. Bei T = 2 h, 4 μl Protein Transport Inhibitor cocktail (bestand bei 500 X) hinzufügen, die T6 + R848 Rohr. Alle Proben mit einer Pipette P1000 mischen und wieder das Rack in den Inkubator bis T = 6 h.
  7. Mischen der Proben mit einem P1000 noch einmal bei T = 4 h.
  8. Bei T = 6 h, zu verarbeiten, T6, T6 + LPS, T6 + R848 und T6 + 5R Blut Probenröhrchen wie unter Schritt 2.4 für die T0-Probe.
  9. Speichern Sie die Zelle Pellets in CSM Restvolumen bei-80 ° C zu einem späteren Zeitpunkt verarbeiten. Alternativ fahren Sie mit Barcode und Antikörper Färbung ohne zu speichern.

3. Barcode der Blutkörperchen lysiert/behoben

  1. Die lysiert/fixed Zellproben von-80 ° C Lagerung langsam auf Eis Auftauen; maximal 20 Proben kann mit einmaligen Barcodes beschriftet und gebündelt, mit diesem System. Verdünnen Sie die 10 X barcoding Perm Puffer von 01:10 mit PBS; machen Sie genügend Puffer für ~ 3 mL pro Probe.
  2. Füllen Sie einen unsterilen Trog mit dem CSM und eines mit 1 X barcoding Perm Puffer. Fügen Sie 1 mL Eis kalt CSM frisch aufgetauten Proben mischen mit einer Pipette, und übertragen Sie auf die jeweiligen bereits beschriftete Polypropylen Cluster-Röhren.
  3. Nehmen Sie eine 10 μl Probe mit einem automatisierten Zelle Zähler oder Hemocytometer Zellen zu zählen. Die Zellzahlen 1,5 – 2 x 106 Zellen pro Probe in jedem Cluster Röhrchen zu normalisieren: entfernen und entsorgen Sie das Volumen des überschüssigen Zellen über den 2 x 106 Zellen.
  4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 600 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Aufschwemmen der Zellen in 1 mL 1 X barcoding-Perm-Puffer mit einem Mehrkanal-Pipette und Zentrifuge bei 600 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Aus der Überstand abgesaugt.
  5. Line-up der Cluster-Röhren auf einem Gestell in der gleichen Reihenfolge wie auf dem Barcode-Schlüssel angegeben, damit die Probe mit seinen Barcode entspricht. Fügen Sie 800 μl 1 X Barcode Perm Puffer Mehrkanal-Pipette auf alle Proben in den Cluster-Röhren ohne Berührung der Zelle Pellet mit Pipettenspitzen (keine Mischung), Zellverlust zu reduzieren. Das Gestell mit den Cluster-Rohren beiseite.
  6. Entfernen Sie 20-Plex Pd Barcoding Kit Schlauch Streifen von-20 ° C und bei Raumtemperatur Auftauen. 100 μl 1 X barcoding Perm Puffer hinzufügen, mischen und 120 μL der resuspendierte Barcode-Mischung in die entsprechende Zellenproben in den Cluster-Röhren zu übertragen.
  7. Mischen von Mehrkanal-Pipette so, dass es keine Kreuzkontamination zwischen individuell Barcode Proben. Inkubieren Sie Cluster Rohre für 30 min bei Raumtemperatur erlauben die Barcodes, die Zellen zu kennzeichnen.
  8. Zentrifugieren Sie bei 600 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Aspirieren des Überstands, dann in 1 mL der CSM aufzuwirbeln.
  9. Zentrifugieren und Aufschwemmen in CSM wieder wie in Schritt 3,8.
    Hinweis: Jede Probe wird nun mit einem eindeutigen Barcode beschriftet und Proben sind bereit, gebündelt werden.
  10. Zentrifugieren bei 600 X g für 5 min bei Raumtemperatur und den überstand abgesaugt. Mit einer einzigen Pipette und mit der gleichen Spitze, übertragen alle Zelle Pellets in ~ 70 – 80 μl Restvolumen, ein Polystyrol-Röhrchen. Nicht kann die PIPETTENSPITZE Auswerfen; die einzige Pipette mit diesem Tipp beiseite.
  11. Fügen Sie mit einer Mehrkanal-Pipette und neue Tipps hinzu ~ 100 μL CSM jeder ursprünglichen Cluster Tube Zelle Erholung zu maximieren. Übertragen Sie mit der einzigen Pipette mit der Spitze, die beiseite gesetzt wurde alle Zelle Pellets in ~ 100 μL Restvolumen auf das gleiche Polystyrol Rohr.
  12. Oben das Polystyrol Rohr (~ 3 mL) CSM hinzufügen. Graf und Aufzeichnung der Handynummer des gepoolten Barcodes eingestellt. Zentrifugieren bei 600 X g für 5 min bei Raumtemperatur und den überstand abgesaugt. Fahren Sie mit der Färbung der Barcode-Proben am gleichen Tag.
    Hinweis: Es ist normal, ~ 20 – 30 % Zellverlust Barcoding dabei zu erwarten.

4. Färbung des Barcodes feste lysiert/Blutkörperchen und Vorbereitung für die Analyse auf Masse Zytometrie Instrument

Hinweis: Je 1 X Titer der Färbung Antikörper (1 μl des Antikörpers pro 100 μL Färbung Reaktion), kann in der Regel 3 – 4 x 106 Zellen färben. Daher, wenn alle Barcodes Proben in einem Rohr gebündelt sind, muss die Menge des Antikörpers hochskaliert werden. Wenn 20 Barcodes Proben belaufen sich auf 30 x 106 Zellen und jeweils 1 X Titer 3 – 4 x 106 Zellen färben kann, erfordert die Barcode-Probe nur einen 10 X-Titer, im Gegensatz zu beflecken jede Probe individuell, erfordern eine 20 X Menge des Antikörpers (1 X pro einzelne Röhre). Die Konzentration des Antikörpers zu Handynummer sollte sorgfältig für jeden einzelnen Antikörper cocktail (hier nicht behandelt) titriert werden.

  1. Färben Sie die Zellen mit Antikörpern (Table of Materials) für Oberflächen Beflecken und Zytokin-Induktion.
    1. Machen die Oberfläche Färbung cocktail durch die Berechnung des Betrags, um hinzugefügt und Buchhaltung für Pipettier Fehler sein (d. h., wenn 20 Barcodes Proben von 2 x 106 Zellen in jeder Probe Färbung einem 10-fach Titer Fleck ist erforderlich; für Endvolumen Berechnungen, pipettieren Fehler von denen ein 10,5 X Finale Färbelösung auszugleichen Sie).
    2. Fügen Sie 10 X Wert der Oberfläche Volumen zum Barcode Zelle Pellet Färbung. Verringerung des zellverlustes, mit der gleichen Spitze, mischen Sie und Messen Sie die Lautstärke der Oberfläche Flecken und Zelle Pellet.
    3. Basierend auf das Volumen der Zellen und Färbung cocktail, CSM fügen Sie eine Färbung Endvolumen von 50 μL pro Anzahl der Zellproben (d. h., wenn eine Reihe von 20 Proben, 50 μL X 20 = 1 mL ausgeführt hinzu). 30 min bei 4 ° c inkubieren Schütteln Sie die Probe alle 15 min zur Förderung sogar Färbung.
    4. Während der Inkubation Oberfläche Fleck bereiten Sie Perm/Waschpuffer (Table of Materials) durch Verdünnung 01:10 mit gefilterten DdH2O. Prepare Volumen von 2 mL für Permeabilisierung und 5 mL zum Waschen. Halten Sie bei 4 ° C oder auf Eis.
    5. Die Krönung der Oberfläche Beflecken Rohr mit CSM und Zentrifuge bei 600 X g bei 4 ° C für 5 min. Überstands Aspirieren. Aufschwemmen die Barcode-Probe in 2 mL 4 ° C, 01:10 Verdünnung Perm/Waschpuffer. Bei 4 ° C für 20-30 min bis die Zellen voll permeabilize inkubieren.
    6. Bei 600 X g bei 4 ° C für 5 min zentrifugieren und den überstand abgesaugt.
    7. Für intrazelluläre Färbung, Schritte ähnliche Färbung (z. B. für Oberfläche Färbung). Jedoch verwenden die 4 ° C, 01:10 Verdünnung Perm/Waschpuffer anstelle der CSM, machen die gesamte Lautstärke Färbung, so dass die Zellen in einem permeabilizing Umfeld in die intrazelluläre Färbung bleiben.
    8. Fügen Sie der intrazelluläre Antikörper cocktail an die Oberfläche gebeizt und permeabilized Zelle Pellet (Schritte 4.1.2–4.1.17). Bringen Sie die Summe Volumen 50 μL pro Anzahl der Zellproben Färbung. 60 min bei 4 ° c inkubieren Schütteln Sie die Probe alle 15 min darauf sogar Färbung.
    9. Während die intrazelluläre Färbung, bereiten Sie die Intercalator-Lösung: 900 μl des gefilterten PBS + 100 μL des gefilterten 16 % PFA (Endkonzentration von 1,6 % PFA) + 0,2 μl 500 Umm Intercalator Farbstoff (Table of Materials).
    10. Die Krönung der Zelle Pellet + cocktail mit kalten 01:10 intrazellulären Antikörper Perm/Waschpuffer.
    11. Bei 600 X g bei 4 ° C für 5 min zentrifugieren und den überstand abgesaugt. Krönen Sie den befleckenden Schlauch mit CSM. Zählen und Erfassen der Anzahl von Zellen. Bei 600 X g bei 4 ° C für 5 min zentrifugieren und den überstand abgesaugt. Die Zellen in 1 mL Intercalator-Lösung von Schritt 4,9 aufzuwirbeln. Mindestens 20 min bei Raumtemperatur für volle Interkalation inkubieren, oder über Nacht bei 4 ° C (Proben in Intercalator Lösung bei 4 ° C für bis zu 1 Woche vor der Ausführung auf die Masse zytometrie Instrument bleiben).
  2. Bereiten Sie die Zellen für die Masse zytometrie Instrument.
    1. Krönen Sie das Rohr mit 3 mL gefilterte DdH2O und Zentrifuge bei 600 X g für 5 min bei 4 ° C. Aufschwemmen der Zellen in gefilterten DdH2O. Pass 3 mL Suspension durch einen 100 μm-Filter zu entfernen Schmutz oder Aggregate, die potenziell die Masse zytometrie Instrument verstopfen könnten.
    2. Zählen Sie und erfassen Sie der Zelle Nummer nachfiltrierung. Zentrifuge bei 600 X g für 5 min bei 4 ° C
  3. Bereiten Sie die Wulst Kalibrierlösung (Table of Materials) durch Verdünnen es 01:10 in gefilterten DdH2O.
  4. Aufschwemmen der gefärbten Zellen in das erforderliche Volumen von 01:10 verdünnt Wulst Kalibrierlösung Zellkonzentration von ~ 1 x 106 Zellen/mL zu erreichen.
    Hinweis: Für eine CyTOF1 bei 45 µL/min ist das empfohlene Optimum 5 x 105 Zellen/mL; für Helios bei 30 µL/min, 7,5 x 105 Zellen/mL.
  5. Gehen Sie zum Ausführen des Beispiels auf die Masse zytometrie Instrument9.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbildung 1 zeigt den Workflow für die Stimulation und Verarbeitung der peripheren Blutproben, einschließlich Zuweisung von Blut Probe Aliquote, Timing der Zusatz von Stimulation, Protein Inhibitor cocktail, und Inkubation Zeiten bis zur Lyse der Erythrozyten (RBC) und Fixierung. Die Wahl der anregenden Agenten hängt von der Signal- und Cytokine Bahnen, die für die Bewertung ausgerichtet sind. Beispielsweise werden in dem hier beschriebenen Protokoll TLR-Agon...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir eine neuartige, einzellige, Proteomic Ansatz für mehrere Immunzelle Arten gleichzeitig zu beurteilen und ihre verschiedenen Zytokin-Störungen im Umfeld des Patienten spezifische "pathogenen" peripheren Blutplasma zirkulierende Faktoren zu erkennen. Diese Methode setzt peripheren Vollblut sowie die analytische Fahrzeug Masse zytometrie als Instrument für die Bewertung der immunologischen zellulären phänotypische und funktionelle Veränderungen. Die Methode ist leicht anwendbar auf Menschen und Mäusen S...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir möchten Aimee Pugh-Bernard für ihre geistigen Input und hilfreichen Kommentare danken. Diese Arbeit war die Boettcher Stiftung Webb Waring Biomedical Research Award und Award K23-1K23AR070897 von der NIH, Elena W.Y. Hsieh unterstützt. Sie wurde auch von prämiennummer K12-HD000850 von Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health und Human Development and Lucile Packard Foundation für Kinder Gesundheit, Stanford CTSA UL1 TR001085 und Child Health Research unterstützt. Institut der Stanford University.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RuxolitinibSanta CruzSC-364729ALagerbestand: 10 mM; Endergebnis: 5 μ M
R848Invivogentlrl-r848-5Lagerbestand: 1 μ g/μ L; Endergebnis: 1 μ g/mL
LPS-EKInvivogentlrl-eklpsBestand Conc: 1 μ g/μ L; Finale Conc: 0.1 μ g/mL
steril PBSLonza17-516F
Lyse/Fix-PufferBD biosciences558049Lagerbestand: 5X; Final Conc: 1X (verdünnt in ddH2O)
BD Phosflow Perm/Wash Puffer IBD biosciences557885Lager Conc: 10X; Endwert: 1:10 (verdünnt in ddH2O)
RPMIGibco21870-076
Natriumazid (NaN3)Sigma-AldrichS-8032Lagerbestand: >99,9%; Endwert: 0,0002
Proteintransport-Inhibitor (PTI)eBiosciences00-4980-93Lagerbestand: 500X; Final Conc: 1X
DNA IntercalatorFluidigm201192BLager Conc: 500 μ M; Finale Conc: 0.1 μ M
Zell-Färbemedien (CSM)PBS + 0,5 % BSA, 0,02 % NaN3
MaxPar Barcode Perm PufferFluidigm201057Lager Conc: 10X; Final Conc: 1X
20-Plex PD Barcode SetFluidigmS0014Lager Conc: n/a; Endwert: n/a
EQ TM Vier-Element-KalibrierkugelnFluidigm201078Lager Conc: 10X; Endwert: 1X
16% MeOH-freie FormaldehydlösungThermo28908Lagerwert: 16% (w/v); Endwert: 1,6% (w/v)
Sterile Polystyrolröhrchen mit rundem BodenVWR60818-496Lagerwert: n/a; Final Conc: n/a
Polypropylen-Cluster-RohreLight LabsA-9001Lager Conc: n/a; Final Conc: n/a
Helios CyTOF InstrumentFluidigmHeliosAlle Lösungen, die in der CyTOF-Analyse verwendet werden sollen, müssen frei von Metallverunreinigungen sein. ddH2O wird bei der Herstellung von Lösungen verwendet, die einen spezifischen Widerstand von mindestens 18,0 MΩ aufweisen sollten. cm. ddH2O und selbst hergestellte Lösungen sollten in neuen Plastik- oder Glasflaschen gelagert werden, die noch nie autoklaviert wurden.
NameUnternehmen<>Katalognummer<strong>Kommentare
Antikörper für die Massenzytometrie
Oberflächenmarker
CD1cBiolegendL161Masse: 161
CD3BDUCHT1Masse: 144
CD4BiolegendSK3Masse: 174
CD7BDM-T701Masse: 149
CD8BiolegendSK1Masse: 142
CD11bFluidigmICRF44Masse: 209
CD11cBDB-ly6Masse: 152
CD15BDHI98Masse: 115
CD14BiolegendM5E2Masse: 154
CD16eBioscience/ThermoB73.1Masse: 165
CD19Santa CruzSJ25C1Masse: 163
CD21BiolegendBu32Masse: 141
CD27BDL128Masse: 155
CD38FluidigmHIT2Masse: 172
CD45 gesamtBiolegendHI30Masse: 89
CD45RABiolegendHI100Masse: 153
CD56MiltenyiREA196Masse: 168
CD66BDB1.1/CD66Masse: 113
CD86FluidigmIT2.2Masse: 150
CD123Fluidigm6H6Masse: 143
CD278/ICOSBiolegendC398.4AMasse: 156
CD179/PD1BiolegendEH12.2H7Masse: 162
IgDBiolegendIA6-2Masse: 146
IgMBiolegendMHM-88Masse: 151
CXCR5BDRF8B2Masse: 173
HLADRBiolegendL243Masse: 167
Zytokine
IL-1αBiolegend364-3B3-14Masse: 147
IL-1βBiolegende H1b-98Masse: 169
IL-1RASanta Cruz AS17Masse: 157
IL-6BiolegendMQ2-13A5Masse: 164
IL-8BDE8N1Masse: 160
IL-12/IL-23p40Biolegend C8.6Masse: 171
IL-17ABiolegende BL168Masse: 148
IL23p19eBioscience/Thermo23dcdpMasse: 176
MIP1βBDD21-1351Masse: 158
MCP1BD5D3-F7Masse: 170
IFNαMiltenyi LT27:295Masse: 175
IFNγBiolegend4S. B3Masse: 165
PTENBDA2B1Masse: 159
TNFαBiolegendMab11Masse: 166
Hinweis: Wenn der Hersteller als Fluidigm angegeben ist, wurde dieser Antikörper von Fluidigm mit vorkonjugiertem Metall gekauft. Wenn der Hersteller als ein anderer als Fluidigm angegeben ist, wurde dieser Antikörper mit dem MaxPar Multi-Metal Labeling selbst konjugiert. Kit (Fluidigm Cat: 201300) gemäß Herstellerprotokoll.

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