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Methodenartikel

Gesundes Gehirn-Hypophysen-Scheiben für Elektrophysiologische Untersuchungen der Hypophysen Zellen in Teleost Fische

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DOI:

10.3791/57790

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16. August 2018

 ,  , 
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der Artikel beschreibt eine optimierte Protokoll für machen lebensfähigen Gehirn-Hypophysen Gewebe Scheiben schneiden, mit den teleost Fische Medaka (Oryzias Latipes), gefolgt von elektrophysiologischen Aufzeichnungen von Hypophysen Zellen mithilfe der Patch-Clamp-Technik mit der perforierten Patch Konfiguration.

Zusammenfassung

Elektrophysiologische Untersuchungen der Hypophysen Zellen wurden in zahlreichen Wirbeltierarten, aber nur sehr wenige in den teleost Fischen durchgeführt. Unter diesen sind die klare Mehrheit an dissoziierten Primärzellen durchgeführt worden. Um zu einem besseren Verständnis der wie teleost Hypophysen Zellen, in einem mehr biologisch relevante Umfeld Verhalten, veranschaulicht dieses Protokolls lebensfähige Gehirn-Hypophysen-Scheiben mit kleinen Süßwasserfische Medaka (Oryzias Latipes) vorzubereiten. Machen die Gehirn-Hypophysen-Scheiben, wurden pH-Wert und Osmolalität aller Lösungen auf Werte in Körperflüssigkeiten von Süßwasserfischen Leben bei 25 bis 28 ° c eingestellt Nach Vorbereitung der Scheibe veranschaulicht das Protokoll führen elektrophysiologische Aufnahmen mit perforierten ganze Zelle Patch-Clamp-Technik. Die Patch-Clamp-Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, mit noch nie da gewesenen zeitlicher Auflösung und Empfindlichkeit, so dass die Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von intakten ganze Zellen bis auf einzelne Ionenkanäle. Perforierten Patch ist einzigartig, da es hält die intrazelluläre Umwelt intakt zu verhindern, dass sich regulatorische Elemente in das Zytosol durch die Patch-Pipette-Elektrode-Lösung verdünnt wird. Im Gegensatz dazu wurde bei der gesamten Zelle Bauform es beobachtet, dass Medaka Hypophysen Zellen schnell ihre Fähigkeit verlieren, Aktionspotentiale abzufeuern. Unter den verschiedenen Perforation-Techniken veranschaulicht dieses Protokoll zu Perforation der gepatchten Membran mit Fungizid Amphotericin b.

Einleitung

Die Hypophyse ist ein wichtiger endokrine Organ bei Wirbeltieren unterhalb des Hypothalamus und posterior, die Optik Chiasmus. Es produziert und sondert sechs bis acht Hormone aus der spezifischen Zelltypen. Hypophyse Hormone bilden ein Zwischenprodukt zwischen Gehirn und periphere Organe und fahren zahlreiche essentielle physiologische Prozesse einschließlich Wachstum, Fortpflanzung und Regelung der Homöostase. Ähnlich wie bei Neuronen, endokrinen Zellen der Hypophyse sind elektrisch erregbare mit der Fähigkeit, spontan Aktionspotentiale abzufeuern 1. Die Rolle der diese Aktionspotentiale ist Zelle angewiesen. In verschiedenen Zelltypen der Säugetier-Hypophyse können Aktionspotentiale der intrazellulären Ca2 + ausreichend für ein verzögerter Freisetzung des Hormons 2erheben. Darüber hinaus erhält die Hypophyse stimulierende und hemmende Informationen aus dem Gehirn, das das Membrane Potential der Zellen 3,4,5,6betrifft. In der Regel stimulierende Eingang erhöht die Erregbarkeit und oft beinhaltet die Freisetzung von Ca2 + von intrazellulären speichern sowie erhöhte Frequenz 7feuern. Verstehen, wie die Zelle nutzt die Ionen-Kanal-Komposition und passt sich diese Signale aus dem Gehirn ist Schlüssel zum Verständnis der hormonsynthese und Freigabe.

Die Patch-Clamp-Technik wurde in den späten 1970er Jahren von Sakmann und Neher 8,9,10 entwickelt und weiter verbessert, indem Hamill 11, und ermöglicht detaillierte Untersuchungen der elektrophysiologischen Eigenschaften von Zellen bis auf einzelne Ionenkanäle. Darüber hinaus kann die Technik verwendet werden, für das Studium von Strom und Spannung. Patch-Klemmung ist heute der Goldstandard für die Messung von elektrophysiologischer Eigenschaften der Zelle. Vier wichtige Konfigurationen von dicht-Patch-Clamp-Technik wurden entwickelten 11; der Zelle angebracht, Inside-Out, die außen-Out und die gesamte Zelle Patch. Die drei ersten Konfigurationen sind in der Regel für einzelne Ionen-Kanal Untersuchungen verwendet. Für die vierte, von der Zelle-attached Konfiguration wird ein Loch in der Zellmembran mit Sub-atmosphärischen Druck hergestellt. Diese Konfiguration ermöglicht auch Untersuchungen der Ionen-Kanal Zusammensetzung der ganzen Zelle 12. Eine Einschränkung dieser Technik ist jedoch, dass zytoplasmatischen Moleküle durch den Patch Pipette Lösung 13 (Abb. 1A), was sich auf die elektrische und physiologischen Reaktionen der untersuchten Zellen verdünnt werden. In der Tat können einige von diesen Molekülen eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion des Signals oder bei der Regulierung der verschiedenen Ionenkanäle spielen. Um dies zu vermeiden, Lindau und Fernandez 14 eine Methode entwickelt, wo eine Pore-forming Verbindung zu den Patch-Pipette hinzugefügt. Im Anschluss an die Zelle-attached Konfiguration wird die Verbindung in der Plasmamembran unter den Patch integrieren und langsam Perforieren die Membran Erstellung elektrischen Kontakt mit dem Zytosol (Abbildung 1B). Mehrere verschiedene Antimykotika wie Nystatin 15 und Amphotericin B 16oder Tenside wie Saponin Beta-Aescin 17,18 können verwendet werden. Diese Verbindungen erstellen Poren groß genug, um monovalente kationen und Cl– Diffusion zwischen dem Cytosol und die Patch-Pipette unter Beibehaltung der cytosolischen Ebenen von Makromolekülen und größeren Ionen wie Ca2 + 15zu ermöglichen, 16.

Die Herausforderung der Verwendung von perforierten Patch ist der potenziell hohen Reihenwiderstand. Vorwiderstand (R-s) oder Zugang Widerstand ist der Gesamtwiderstand über die Patch-Pipette im Verhältnis zum Boden. Während Patch-Clamp-Aufnahmen, die R-s werden parallel mit Membran-Widerstand (Rm). Rm und Rs in Parallele Arbeit als Spannungsteiler. Mit dem hohen R-s, fällt die Spannung über die R-s geben Fehler in den Aufnahmen. Der Fehler wird mit größeren Strömungen erfasst größer geworden. Darüber hinaus ist der Spannungsteiler auch frequenzabhängig einen Tiefpass-Filter, was sich auf die zeitliche Auflösung zu schaffen. In der Tat kann der perforierten Patch nicht immer zulassen Aufnahmen von großen und schnellen Strömungen wie die Spannung Na+ Strömungen Gated (für detaillierte Messwerte Referenz 19 Siehe) Rs kann auch während der Patch-Clamp-Aufnahmen, wieder führt zu Veränderungen in den aufgenommenen Strom variieren. So können Fehlalarme in Situationen auftreten wo Rs während der Zulassungsantrag ändert.

Die Elektrophysiologie auf das geschnittene Gewebe wurde erstmals von Andersen-Lab, elektrophysiologische Eigenschaften der Nervenzellen im Gehirn 20zu studieren. Die Technik ebnete den Weg für detaillierte Untersuchungen der Einzelzellen sowie Zellezelle Kommunikation und Zelle Schaltungen in einem mehr intakten Umwelt. Eine ähnliche Technik für die Herstellung von Hypophyse Scheiben wurde von Guérineau Et Al. 1998 eingeführt. 21. es war jedoch nicht vor 2005 wurde dieser Gehirn-Hypophysen Slice-Vorbereitung für Patch-Clamp-Studien in teleost 22erfolgreich eingesetzt. In dieser Studie berichteten die Autoren auch die Verwendung von perforierten Patch-Clamp-Aufnahmen. Allerdings wurden bei weitem die meisten elektrophysiologischen Untersuchungen der Hypophysen Zellen bei Säugetieren, und nur eine Handvoll anderer Wirbeltiere, einschließlich teleost Fische 1,2,22,23 durchgeführt . Im umkonstruiert wurden fast alle Studien am primären dissoziierten Zellen 24,25,26,27,28,29,30 durchgeführt. .

In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für die Zubereitung von gesunden Gehirn-Hypophysen-Scheiben aus dem Modell Fisch Medaka. Der Ansatz stellt mehrere Vorteile im Vergleich zu primären dissoziierten Zellkulturen. Zuerst werden die Zellen in einer relativ geschützten Umgebung im Vergleich zu Zelle Kulturbedingungen getrennt erfasst. Zweitens erlauben Slice Vorbereitungen uns indirekte Wege vermittelt durch Zell-Zell-Kommunikation- 22, das ist nicht möglich in dissoziierten Zelle Kulturbedingungen zu untersuchen. Darüber hinaus führen wir elektrophysiologische Aufnahmen auf die erhaltenen Gewebe-Scheiben mit perforierten ganze Zelle Patch-Clamp-Technik mit Amphotericin B als die porenbildner durchzuführen.

Medaka ist eine kleine Süßwasserfische aus Asien, vor allem in Japan gefunden. Physiologie, Embryologie und Genetik von Medaka wurden für mehr als 100 Jahren 31ausgiebig untersucht, und es ist eine häufig verwendete Forschungsmodell in vielen Laboratorien. Für dieses Papier von besonderer Bedeutung ist die deutliche morphologische Organisation der Hypothalamus-Hypophysen-Komplex in teleost Fische: während in Säugetiere und Vögel der Hypothalamus Neuronen ihre Neuro-Hormone regulieren Hypophyse endokrine Zellen freigeben in das Portal die mediane Eminenz ist eine direkte nervöse Projektion des Hypothalamus Neuronen auf die endokrinen Zellen der Hypophyse in teleost Fische 32. Deshalb sorgfältig durchgeführte Gehirn-Hypophysen Schneiden von besonderer Bedeutung in Fisch, ermöglicht es uns, elektrophysiologische Eigenschaften der Hypophysen Zellen in einem gut erhaltenen Gehirn-Hypophysen-Netzwerk und insbesondere wie Hypophysen Zellen untersuchen Steuern Sie ihre Erregbarkeit und damit Ca2 + Homöostase.

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Protokoll

Alle Tier Handhabung wurde entsprechend den Empfehlungen für die Pflege und das Wohlergehen der Versuchstiere an der Norwegian University Life Sciences und unter der Aufsicht der autorisierte Ermittler durchgeführt.

1. Vorbereitung der Instrumente und Lösungen

Hinweis: Alle Lösungen sollten steril sein. Sorgfältige Augenmerk auf den pH-Wert und die Osmolalität (Osmol/kg Wasser) aller Lösungen, die sorgfältig die extrazellulären Umwelt der untersuchten Arten angepasst werden sollte. pH-Wert und Osmolalität sollte mit präzisen elektronischen Geräten wie pH-Meter und Gefrierpunkt XR angepasst werden.

  1. 500 mL der extrazellulären Lösung ohne Ca2 + zu machen (Ca2 + gratis EG): 150 mM NaCl, KCl, 1,3 mM MgCl2, 5 mM 4 mM Glukose, 10 mM Hepes.
    1. Lösen Sie 4,38 g NaCl, 186,37 mg KCl, MgCl2, 360,32 mg Glucose und 1,19 g HEPES in 450 mL hochreinen 61,89 mg (0,055 uS / cm bei 25 ° C, der Widerstand von 18,2 MOhm) H2O in ein Becherglas mit einem magnetischen Rührer.
    2. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,75 mit NaOH.
    3. Übertragen Sie die Lösung in eine Volumetrische 500 mL-Flasche. Füllen Sie den volumetrischen Kolben mit hochreinen H2O bis 500 mL.
    4. Mischen Sie die Lösung gut vor der Messung der Osmolalität. Passen Sie auf 290 – 300 mOsm mit Mannit. Filter zu sterilisieren die Lösung mit Wasser Vakuumsystem und 0,2 µm-Filter.
  2. 500 mL der extrazellulären Lösung (EG) zu machen: 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, 4 mM Glukose, 10 mM Hepes.
    1. Lösen Sie 4,38 g NaCl, 186,37 mg KCl, 147,01 mg CaCl2, 61,89 mg MgCl2, 360,32 mg Glucose und 1,19 g HEPES in 450 mL hochreines H2O in ein Becherglas mit einer magnetischen Rührwerk auf.
    2. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,75 mit NaOH.
    3. Übertragen Sie die Lösung in eine Volumetrische 500 mL-Flasche. Füllen Sie den volumetrischen Kolben mit hochreinen H2O bis 500 mL.
    4. Mischen Sie die Lösung gut vor der Messung der Osmolalität. Passen Sie auf 290 – 300 mOsm mit Mannit. Filter zu sterilisieren die Lösung mit Wasser Vakuumsystem und 0,2 µm-Filter.
  3. 500 mL der extrazellulären Lösung mit 0,1 % Rinderserumalbumin (EG mit BSA) zu machen: 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, 4 mM Glukose, 10 mM Hepes.
    1. Lösen Sie 4,38 g NaCl, 186,37 mg KCl, 147,01 mg CaCl2, 61,89 mg MgCl2, 360,32 mg Glucose und 1,19 g HEPES in 450 mL hochreines H2O in ein Becherglas mit einer magnetischen Rührwerk auf.
    2. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,75 mit NaOH.
    3. Übertragen Sie die Lösung in eine Volumetrische 500 mL-Flasche. Füllen Sie den volumetrischen Kolben mit hochreinen H2O bis 500 mL.
    4. Mischen Sie die Lösung gut vor der Messung der Osmolalität. Passen Sie auf 290 – 300 mOsm mit Mannit. Filter zu sterilisieren die Lösung mit Wasser Vakuumsystem und 0,2 µm-Filter. Fügen Sie 50 mg BSA.
  4. 250 mL der intrazellulären Lösung (IC) zu machen: 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, 20 mM Saccharose.
    1. Lösen Sie 1,54 g KOH, KCl 327,75 mg, 595,75 mg HEPES und 1,712 g Saccharose in 450 mL hochreines H2O in ein Becherglas mit einer magnetischen Rührwerk auf.
    2. Stellen Sie den pH-Wert auf 7.2 mit (N-Morpholino) Ethan Sulfo (MES) Säure.
    3. Übertragen Sie die Lösung in einem 250 mL volumetrischen Kolben. Füllen Sie den volumetrischen Kolben mit hochreinen H2O bis 250 mL.
    4. Mischen Sie die Lösung gut vor der Messung der Osmolalität. Passen Sie auf 280 – 290 mOsm (niedriger als EG 10 mOsm) mit Saccharose. Filter zu sterilisieren die Lösung mit Wasser Vakuumsystem und 0,2 µm-Filter.
  5. Machen Sie 100 mL 2 % niedrig schmelzende Agarose-Lösung in Ca2 + und BSA frei EG (2 g niedrig schmelzende Agarose in 100 mL Ca2 + gratis EG). Lösen Sie mit Hilfe einer Mikrowelle auf und legen Sie die geschmolzene Agarose in einem Wasserbad bei 40 ° C. Lassen Sie sie abkühlen, bis 40 ° C vor dem Gebrauch auf das Gewebe erreicht.
    Hinweis: EG, Ca2 + kostenlose EG bei 4 ° C für mehrere Wochen, wenn steril und IC-Lösungen bei-20 ° C, für mehrere Monate gelagert werden kann. Agarose pro Woche bei 4 ° C gelagert werden und durch kurz Mikrowelle 3 – 5 Mal wiederverwendet werden kann. Übermäßige Wiederverwendung führt zur Verdunstung und Veränderung der Agarose und Salzkonzentration und Qualität.
  6. Agar-Brücke zu machen:
    1. Erhitzen Sie 7,5 mm lange Borosilikatglas Kapillaren mit Außendurchmesser (Außendurchmesser) 2 mm und Innendurchmesser (ID) 1,16 mm mit dem Bunsenbrenner auf einen fokalen Punkt ca. 1/3 von einem Ende bis das Glas beginnt zu beugen. Entfernen Sie das Glas von der Flamme und lassen Sie das Glas mit einem Winkel von etwa 120 Grad (Abb. 2A) beugen.
    2. Schmelzen Sie 2 % Agar in normalen EG ohne Glukose mit Hilfe einer Mikrowelle, und während die Agarose Flüssigkeit zu füllen ist das vorgefertigte Glas-Kapillare mit Kapillarität zwingt, indem eines der Enden des Glases in die Flüssigkeit und warten einige Minuten. Brücken bis zur Verwendung bei 4 ° C im EG ohne Glukose zu speichern.
  7. Bereiten Sie Borosilikatglas mit Glühfaden Patch Pipetten mit einem geeigneten Pipette Abzieher vor. Finden Sie die Pipette Puller Handbuch der gewünschten elektrodenwiderstand zu erhalten.
    Hinweis: Die Verjüngung der Pipette sollte so kurz wie möglich sein. Kurze Pipette Kegel wird mit 4 – 6 ziehende Schritte erreicht. Der elektrodenwiderstand sollte zwischen 2 und 6 MΩ je nach Größe der Zellen.
  8. Zur Vermeidung von Bewegung des Gewebes während der Patch-Clamp-Experimenten Mantel der Oberfläche der Aufnahme Kammer mit 0,1 % der Polyethylenimine (PEI) in Borat-Puffer.
    1. Bereiten Sie 500 mL Borat Puffer (25 mM):
      1. Lösen Sie 4,768 g Na2B4O710 H2O in 450 mL von hochreinen H2O in ein Becherglas mit einer magnetischen Rührwerk auf.
      2. PH-Wert auf 8,4 mit HCl anpassen.
      3. Übertragen Sie die Lösung in eine Volumetrische 500 mL-Flasche. Füllen Sie den volumetrischen Kolben mit hochreinen H2O bis 500 mL und 0,2 µm-Filter die Lösung mit Wasser Vakuumsystem sterilisieren.
    2. Endnutzung eine 1 %-Stammlösung von PEI (1 mL 50 % PEI auf 49 mL 25 mM Borat Puffer) und eine 0,1 % PEI Verdünnung durch Verdünnung 10 µL der Stammlösung 1 % in 100 µL Puffer Borat vorbereiten.
    3. 2 mL 0,1 % PEI auf dem Glas des Inhabers Scheibe und lassen Sie die Beschichtung für 1 Minute inkubieren. Dann kurz waschen Sie das Glas zweimal mit 5 mL des hochreinen H2O und lassen Sie Luft bis zum Gebrauch trocknen.
  9. Amphotericin B Lösungen vorzubereiten.
    1. Machen Sie 60 mg/mL Stammlösung durch Auflösen von 3 mg Amphotericin B Pulver in 50 µL Dimethyl Sulfoxid (DMSO) in einer 1-mL-Tube vor Licht geschützt werden. Strudel mit der maximalen Geschwindigkeit für 30 s und für 15 min zum Homogenisieren beschallen. Speichern Sie Aliquote in 3 – 5 Röhrchen bei-20 ° C und verwenden Sie einer Teilprobe pro Tag.
      Hinweis: Wenn Vorratslösung Amphotericin B nicht klar und gelb ist Farbe, sondern milchig (noch gelb) nach 15 – 20 min. Beschallung stellen eine neue Stammlösung.
    2. Machen Sie IC-Lösung mit Amphotericin B durch pipettieren 2 mL des IC in ein sauberes Glasgefäß mit mehr als 10 mL Fassungsvermögen. 8 µL der Stammlösung Amphotericin B in die Pipette Lösung und Mischen von pipettieren. Wickeln Sie das Becherglas mit Aluminiumfolie und Platz auf dem Eis bis zur Verwendung und erneuern Sie alle 3 h.

2. Präparation und Schneiden mit Vibratome

  1. Bereiten Sie die Dissektion Werkzeuge vor sezieren, darunter eine scharfe und eine starke Zange mit einer Schere. Reinigen Sie die Werkzeuge (Gewebe-Halter, Bürste, Zange) mit Ethanol und stellen Sie sicher, dass sie nur zu Zwecken der Dissektion und nie in Kontakt mit festen Gewebe verwendet werden. Halten sie in einem separaten Feld zur Vermeidung von Kontaminationen.
  2. Den Fisch in kaltem Eiswasser für 1 min einschläfern.
  3. Befolgen Sie die nachfolgenden Schritte aus, um schnell die Medaka Gehirn und Hypophyse mit scharfen Zangen zergliedern (verwenden Sie nicht mehr als 3 min).
    1. Halten die Fische mit der starken Zange schwere die beiden Sehnerven hinter den Augen mit einer Schere oder Pinzette scharf.
    2. Öffnen Sie die dorsalen Teil des Schädels aus der hinteren an der vorderen Seite durch Brechen der Schädelknochen Schritt für Schritt mit starker Zange.
    3. Der Schädel auf der einen Seite mit starker Zange abziehen.
    4. Schwere des Rückenmarks mit einer Schere oder scharfen Zange.
    5. Sanft, das Rückenmark mit der Zange greifen, das Gehirn vom hinteren zum vorderen flip und legen Sie sie in eine Schüssel mit eiskaltem Ca2 + Kostenlose ec
  4. Füllen Sie eine 1,5 – 2 cm3 Metallform mit flüssige Agarose und legen Sie es auf dem Eis.
  5. Kurz bevor die Agarose (bei ca. 25 – 30 ° C) erstarrt, sanft greifen Sie das Gehirn durch das Rückenmark mit der Zange, trocknen Sie die Zange mit einem Stück feines Papier und legen Sie das Gewebe in der Agarose. Mischen Sie schnell die Agarose um die Spuren der EG Links rund um das Gewebe zu verdünnen und das Gewebe zu orientieren und lassen die Form auf dem Eis für ein paar Sekunden bis die Agarose härtet.
    Anmerkung: Es ist wichtig für diesen Schritt schnell sein. Die Agarose erstarrt schnell wie die Metallform durch das Eis abgekühlt ist.
  6. Schneiden Sie ein Quadrat von Agarose, enthält das Gewebe mit einer Skalpellklinge und Vibratome Probenhalter mit Chirurgie (ungiftig) Kleber aufkleben.
  7. Füllen Sie die Küvette der Vibratome erhalten (Gehirn-Hypophyse) Probenhalter mit eiskalten Ca2 + kostenlose EG.
  8. Probenhalter in der Vibratome und schneiden Sie die Agarose-Block um parasagittalen Abschnitte von 150 µm, mit hoher Frequenz und niedriger Drehzahl für den Schnitt zu machen. Sammeln Sie die ausgewählten Abschnitte zu und legen Sie sie in die Patch-Clamp-Aufnahme-Kammer mit 3 mL eiskaltes Ca2 + kostenlose EG
  9. Legen Sie die Raster-Harfe (Abbildung 2B) auf dem Gewebe.
    Hinweis: Die Harfe wird zusammen mit der Beschichtung stabilisieren das Gewebe und verhindern, dass es während der Patch-Clamp-Aufnahmen bewegt.
  10. Nachdem die Harfe vorhanden ist, ändern Sie die Ca2 + freie EG Mitte in der normalen EG mit Ca2 + und BSA. Lassen Sie die Gewebe 10 min ruhen.

(3) perforiert, Patch-Clamp und elektrophysiologische Aufnahmen

  1. Vor Beginn des Experiments, Chlorid Silber Draht Elektroden mit den folgenden Schritten: zunächst ein feines Schleifpapier (p180) verwenden, um die Silberdraht-Elektroden reinigen. Zweitens mit 2 mL 70 % igem Ethanol spülen. Drittens: Tauchen Sie die Drähte in 2 mL, 2 – 5 % Chlor für 10 min. Zu guter Letzt spülen Sie mit 2 mL, hochreine H2O.
  2. Legen Sie die Aufnahme Kammer mit der Gehirn-Hypophysen-Scheibe in den Mikroskoptisch und suchen Sie den Zielbereich (Hypophyse) mit 10 X-Objektiv und Inspizieren Sie die Zellen mit 40 X Objektiv.
    Hinweis: Wenn die Vorbereitung erfolgreich ist, sollte sehr wenige Rundzellen sichtbar sein. Diese Runde Zellen sind in der Regel beschädigte Zellen, die aus dem Gewebe lösen werden.
  3. Legen Sie die Erdung Elektrode durch die 2 % Agar-Brücke in das EG-Bad.
  4. Suchen Sie eine gesunde Zelle mit 40 X Objektiv.
    Hinweis: Eine gesunde Zelle sollte fest an das Gewebe Slice und nicht aufgerundet und losgelöst von der Scheibe.
  5. Einstellen des Verstärkers in Voltage-Clamp (VC; Abbildung 4A Nummer 1) Modus. Offenen testen die Dichtung Fenster und drücken Sie das Bad Konfiguration (Abbildung 4 b Punkt 1 und 2. Nutzen Sie ein 5-mV Pulse Pipette Widerstand (Abbildung 4 b Ziffer 3) zu überwachen.
  6. Abgleich der Patch PIPETTENSPITZE mit Antimykotika kostenlose IC-Lösung vor dem Hinzufügen der IC-Lösung mit Amphotericin B mit einer Mikro-Füller-Spritze (siehe Abbildung 3).
  7. Fügen Sie einen leicht positiver Luftdruck in der Patch-Pipette mit 1 mL Spritze.
    Hinweis: Dadurch wird eine kleine Flüssigkeitsstrom aus der Patch-Pipette, die Vermeidung von Kontaminationen der Spitze.
  8. Einmal in der Badewanne, bewerten Sie den Patch Pipette Widerstand zu und stellen Sie sicher, dass keine Partikel an der Spitze der Pipette (Abbildung 4) verbunden sind.
    Hinweis: Ein kleines Stück Klebeband ist auf den Monitor Anzeige der video-Aufnahme-Form das Sichtfeld angebracht. Dies macht die Positionierung der Patch Pipette relativ Zelle einfacher wenn das Ziel nicht auf die Zelle richtet.
  9. Führen Sie die Patch-Pipette auf die Zelle mit Mikromanipulatoren.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Pipette ist sauber von der Suche nach kleinen Teilchen, die an der Spitze der Pipette angebracht haben können. Plötzliche Änderungen im Widerstand möglicherweise auch eine Folge der Partikel in der Pipettenspitze stecken.
  10. Passen Sie die Pipette, wenn wenige Mikrometer über der Zelle damit die Spitze der Pipette die Zelle 1/3 von der Mitte der Zelle, berühren wird, wie in Abbildung 5dargestellt. Wenn die Zelle berühren, lassen Sie den Druck und gelten Sie die sanfte Saugwirkung um eine Dichtung zu machen.
    Hinweis: Die Zeit aus der Patch-Pipette betritt das Bad zu einem erfolgreichen Dichtung sollte so kurz wie möglich gehalten werden. Nicht mehr als 1 – 1,5 min zur Vermeidung von Amphotericin B erreichen die Spitze der Pipette und Leck in die Wanne.
  11. Sofort wechseln Sie zum Fenster " Patch " in der Patch-Clamp-Software (Abbildung 4 D Punkt 1) und haben Sie eine Holding Potential zwischen-50 und-60 mV (Abbildung 4 Punkt 2). NULL heraus aus der Glaspipette (Abbildung 4 Punkt 3) die schnelle Kapazität zusammensetzt.
  12. Wechseln Sie in die Zelle -Fenster in Patch-Clamp-Software (Abbildung 4E Punkt 1 und 2) und starten Sie die Überwachung Zugang Widerstand, Ra, erscheint im Fenster. NULL, die Kapazität der Membran in der Verstärker-Software (Abbildung 4E Punkt 3) nach ausreichender Zugang.
    Hinweis: Ausreichender Zugang dauert 10 bis 30 min (Abbildung 4E Punkt 2). Ein guter Zugang zur aktuellen Klemme Aufnahmen sollte unter 20 M liegen.
  13. Wechseln Sie zur zangenstromwandler, IC, in Verstärker Software-Fenster (Abbildung 4F Punkt 1). Passen Sie die schnell-kapazitive Ströme im Fenster Klemme der Verstärker Software (Abbildung 4F Punkt 2 und 3) auf den gleichen Wert wie in 3.12. Überprüfen Sie die Membran Potenzial (Abbildung 4F Punkt 1).
    Hinweis: Wichtig ist, wenn das Membranpotential seicht ist (typische über-35 mV) die Zelle beschädigt werden. Die Aufnahme abbrechen und eine neue Zelle zu finden.
  14. Nach der Suche nach einer gesunden Zelle (fest des Gewebes mit Membranpotential unter-40 mV), beginnen die experimentelle Aufnahmen wie in des Herstellers Protokoll 33,34.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll zeigt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll wie zuverlässige elektrophysiologische Aufnahmen aus Zellen der Hypophyse (Gonadotrope), mit einer Medaka transgene Linie [Tg (Lhb- HrGfpII)], wo Zellen das Ziel (Gonadotropine Lh-Produktion) mit grün fluoreszierenden Proteins (GFP) beschriftet sind.

Zunächst wurden die elektrophysiologischen Untersuchungen mit ganz-Zell Konfiguration durchgeführt. Jedoch wurden s...

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Diskussion

Elektrophysiologische Aufnahmen mit der Patch-Clamp-Technik auf Gehirn-Hypophysen Scheiben benötigen sorgfältige Optimierung. Gut optimierte Protokolle für Leben-Zelle Untersuchungen insbesondere umkonstruiert beschränken sich die meisten Publikationen mit Protokollen auf Basis von Säugetier-Systemen. In diesem Zusammenhang ist es wichtig, die Tatsache, dass mehrere physiologische Parameter wie pH-Wert und Osmolalität kennen nicht nur Arten angewiesen, aber auch sehr stark abhängig ob der betreffende Organismus lebt auf ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben

Danksagungen

Wir danken Frau LourdesCarreon G Tan für ihre Hilfe, die Aufrechterhaltung der Medaka Anlage und Anthony Peltier für die anschaulichen Zahlen. Diese Arbeit wurde von NMBU und der Forschung Rat von Norwegen, Grantnummern 244461 (Aquakultur-Programm) und 248828 (Digitalleben Norwegen-Programm) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
VibratomeLeicaVT1000 S
Chirurgischer KleberWPIVETBOND3M Vetbond Tissue
Adhesive Klingen aus rostfreiem StahlCampden Instruments752-1-SS
MetallformenSAKURA4122
StahlharfeWarner Instruments64-1417
PBSSIGMAD8537
Hochreine LMP AgaroseInvitrogen166520-100
Patch-PipettenSutter InstrumentBF150-110-10HPBorosilikatglas mit Filament Außendurchmesser:1,5 mm, Innendurchmesser:1,10 mm
Mikroskop SlicescopeScientificapro6000
P-Clamp10Molecular Devices#1-2500-0180Software
Digitizer Digidata 1550A1Molecular DevicesDD1550
Verstärker Multiclap 700B Kopftisch CV-7BMolecular Devices1-CV-7B
GnRHBachem4108604H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH Trifluoracetatsalz 
PipettenabzieherSutter InstrumentP-1000
Amphotericin BSIGMAA9528porenbildendes Antibiotikum
PolyethyleniminSIGMAP314350% PEI Lösung
MikrofilerSpritze WPIMF28/g67-5
Glas für dieAgarbrücke Sutter InstrumentBF200-116-15Borosilikatglas mit Filament Außendurchmesser:2,0 mm, Innendurchmesser:1,16 mm Feuerpolierte
Micro-Manager SoftwareOpen Source Mikroskopie Software
optiMOS sCMOS KameraQimaging  01-OPTIMOS-R-M-16-C
UltraschallgerätElmaD-7700 singen
NaClSiGMAS3014
KClSiGMAP9541
MgCl2SiGMAM8266
D-GlucoseSiGMAG5400
HepesSiGMAH4034
CaCl< sub>2SiGMAC8106
SaccharoseSiGMA84097
D-MannitolSiGMA63565
MES-SäureSIGMAM0895
BSASIGMAA2153

Referenzen

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