Differenzierung, Wartung und Analyse der menschlichen Retina Pigment Epithelzellen: eine Krankheit im Gericht-Modell für BEST1 Mutationen

Alec Kittredge; Changyi Ji; Yu Zhang; Tingting Yang

doi:10.3791/57791

Methodenartikel

Differenzierung, Wartung und Analyse der menschlichen Retina Pigment Epithelzellen: eine Krankheit im Gericht-Modell für BEST1 Mutationen

DOI:

10.3791/57791

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24. August 2018

Alec Kittredge¹ , Changyi Ji¹ , Yu Zhang ¹ , Tingting Yang¹

¹Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester, School of Medicine and Dentistry

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir ein Protokoll zur retinalen Pigmentepithels (RPE) Pigmentzellen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen tragen Patienten abgeleitet Mutationen zu unterscheiden. Die mutierten Zelllinien können für Funktionsanalysen einschließlich Immunoblotting, Immunfluoreszenz und Patch-Clamp verwendet werden. Dieser Krankheit im Gericht Ansatz umgeht die Schwierigkeit, native menschlichen RPE-Zellen.

Zusammenfassung

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Obwohl über 200 Genmutationen im menschlichen BEST1 gen identifiziert und mit degenerativen Netzhauterkrankungen verknüpft wurden, bleiben die pathologischen Mechanismen schwer vor allem aufgrund des Fehlens eines guten in Vivo -Modells für das Studium BEST1 und seine Mutationen unter physiologischen Bedingungen. BEST1 kodiert einen Ionenkanal, nämlich BESTROPHIN1 (BEST1), welche Funktionen im retinalen Pigmentepithel (RPE); jedoch ist der äußerst begrenzte Zugang zu nativen menschlichen RPE-Zellen eine große Herausforderung für die wissenschaftliche Forschung. Dieses Protokoll beschreibt die menschliche RPEs Lager BEST1 krankheitsauslösende Mutationen durch induzierte Differenzierung von menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) zu generieren. Da hPSCs selbst erneuerbar sind, dieser Ansatz erlaubt es den Forschern, eine stete Quelle der hPSC RPEs für verschiedene experimentelle Analysen, z. B. Immunoblotting, Immunfluoreszenz und Patch-Clamp, zu haben und bietet somit ein sehr leistungsfähiges Krankheit im Gericht-Modell für BEST1-retinale Bedingungen verbunden. Insbesondere kann diese Strategie angewendet werden, um RPE (Patho) Physiologie und andere Gene von Interesse, die nativ in RPE zu studieren.

Einleitung

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Es ist dokumentiert worden, die mindestens fünf degenerative Netzhauterkrankungen durch genetische Mutationen im BEST1 gen¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,^{6 entstehen} ^, ⁷ ^, ⁸, mit der Anzahl der gemeldeten Mutationen bereits mehr als 200 und noch immer. Diese BEST1-assoziierten Krankheiten, auch bekannt als Bestrophinopathies, fortschreitenden Sehverlust und sogar Blindheit verursachen, und es gibt derzeit ke....

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Protokoll

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1. Differenzierung der hPSC, RPE

Pflegen und Durchgang hPSCs wie oben beschrieben¹⁸.
Hinweis: Alle Zellen (einschließlich hPSCs und hPSC RPEs) werden bei 37 ° C um 5 % CO₂ während der gesamten Dauer der Wachstum und Differenzierung Protokolle angebaut.
Vor der Differenzierung, konfluierende hPSCs für vorbeschichtete 6-Well-Platten aufgeteilt.
1. Zum Beschichten Platten, Basalmembran Matrix für ca. 1 h auf Eis Auftauen, auszusetzen Sondennahrung Matrix bei 4 ° C DMEM Medium eine 01:50 Verdünnung, jedes gut 800 µL beschichtungsmischung hinzu, und mindestens 1 h bei 37 ° c inkubieren

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Ergebnisse

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Der technisch anspruchsvolle Schritt ist die manuelle Isolierung, deren Ziel es ist, eine hohe Reinheit einer differenzierten P₀ hPSC-RPE Bevölkerung zu erreichen. Nach einem erfolgreichen Isolierung > 90 % der Zellen in der P-₀ -Bevölkerung werden wachsen und Reifen Signatur RPE Morphologien (Abbildung 1) angezeigt. Die Existenz des einen geringen Anteil von nicht-RPE oder unreif RPE-Zellen in der P-₀-Bevölkerung ist fast.......

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Diskussion

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Das wichtigste Verfahren für die Krankheit im Gericht Ansatz soll hPSCs mit einer krankheitsverursachenden Mutation auf die richtige Zelle Abstammung zu unterscheiden, die RPE für BEST1ist. So sollte nach jeder Differenzierung Experiment die resultierenden hPSC RPE-Zellen sorgfältig für ihren Reifen Status von RPE-spezifische Morphologien und Protein-Marker¹⁶^,¹⁷^,¹⁸überprüft werden. Zur Minimierung von klonalen Artefakt .......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Dieses Projekt wurde von NIH-Stipendien EY025290, GM127652 und University of Rochester Anschubfinanzierung finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer
Knock-Out (KO) DMEM	ThermoFisher 10829018
KO Serumersatz	ThermoFisher	10829028
Nichtessentielle Aminosäuren	ThermoFisher	11140050
Glutamin	ThermoFisher	35050061
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	10378016
Nicotinamid	Sigma-Aldrich	N0636
Humanes Activin-A	PeproTech	120-14
MEM (eine Modifikation)	Sigma-Aldrich	M4526
Fötales Rinderserum	VWR	97068-085
N1 Ergänzung	Sigma-Aldrich	N6530
Glutamin-Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	G1146
Nichtessentielle Aminosäuren	Sigma-Aldrich	M7156
Taurin	Sigma-Aldrich	T0625
Hydrocortison	Sigma-Aldrich	H0386
Trijod-Thyronin	Sigma-Aldrich	T5516
mTeSR-1 Medium	Stemcell Technologies	5850
Matrigel	Corning	356230
Kollagenase	Gibco	17104019
Trypsin	VWR	45000-664
M-PER Reagenz zur Extraktion von Säugetierproteinen	Pierce	78501
Proteinase-Inhibitor-Cocktail	Sigma-Aldrich	4693159001
RPE65 Antikörper	Novus Biologicals	NB100-355
CRALBP	AntikörperAbcam	ab15051
BEST1 Antikörper	Novus Biologicals	NB300-164
Beta Aktin Antikörper	ThermoFisher	MA5-15739
Alexa Fluor 488-konjugierter Esel Anti-Maus ThermoFisher		A-21202
Ziege Anti-Maus	IgG ThermoFisher	SA5-35521
Ziege Anti-Kaninchen IgG	LI-COR Biosciences	926-68071
Hoechst 33342	ThermoFisher	62249
HEKA EPC10 Patch-Clamp-Verstärker	Warner Instruments	895000
Patchmaster	Warner Instruments	895040

Referenzen

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Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes ....

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