Methodenartikel

Differenzierung, Wartung und Analyse der menschlichen Retina Pigment Epithelzellen: eine Krankheit im Gericht-Modell für BEST1 Mutationen

DOI:

10.3791/57791

⸱

24. August 2018

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester, School of Medicine and Dentistry

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur retinalen Pigmentepithels (RPE) Pigmentzellen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen tragen Patienten abgeleitet Mutationen zu unterscheiden. Die mutierten Zelllinien können für Funktionsanalysen einschließlich Immunoblotting, Immunfluoreszenz und Patch-Clamp verwendet werden. Dieser Krankheit im Gericht Ansatz umgeht die Schwierigkeit, native menschlichen RPE-Zellen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obwohl über 200 Genmutationen im menschlichen BEST1 gen identifiziert und mit degenerativen Netzhauterkrankungen verknüpft wurden, bleiben die pathologischen Mechanismen schwer vor allem aufgrund des Fehlens eines guten in Vivo -Modells für das Studium BEST1 und seine Mutationen unter physiologischen Bedingungen. BEST1 kodiert einen Ionenkanal, nämlich BESTROPHIN1 (BEST1), welche Funktionen im retinalen Pigmentepithel (RPE); jedoch ist der äußerst begrenzte Zugang zu nativen menschlichen RPE-Zellen eine große Herausforderung für die wissenschaftliche Forschung. Dieses Protokoll beschreibt die menschliche RPEs Lager BEST1 krankheitsauslösende Mutationen durch induzierte Differenzierung von menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) zu generieren. Da hPSCs selbst erneuerbar sind, dieser Ansatz erlaubt es den Forschern, eine stete Quelle der hPSC RPEs für verschiedene experimentelle Analysen, z. B. Immunoblotting, Immunfluoreszenz und Patch-Clamp, zu haben und bietet somit ein sehr leistungsfähiges Krankheit im Gericht-Modell für BEST1-retinale Bedingungen verbunden. Insbesondere kann diese Strategie angewendet werden, um RPE (Patho) Physiologie und andere Gene von Interesse, die nativ in RPE zu studieren.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es ist dokumentiert worden, die mindestens fünf degenerative Netzhauterkrankungen durch genetische Mutationen im BEST1 gen1,2,3,4,5,6 entstehen , 7 , 8, mit der Anzahl der gemeldeten Mutationen bereits mehr als 200 und noch immer. Diese BEST1-assoziierten Krankheiten, auch bekannt als Bestrophinopathies, fortschreitenden Sehverlust und sogar Blindheit verursachen, und es gibt derzeit keine wirksamen Therapien. Die Protein-Produkt von BEST1, nämlich BESTROPHIN1 (BEST1), ist ein Ca2 +-aktivierte Cl– -Kanal (CaCC) speziell in das retinale Pigmentepithel (RPE) der Augen5,6, ausgedrückt 8,9. Wichtig ist, einen klinischen Phänotyp BEST1-Folgeerkrankungen ist die reduzierte visuelle Antwort auf lichtreize, namens light Peak (LP) gemessen in der Electrooculogram10,11; LP wird geglaubt, um durch ein CaCC RPE12,13,14vermittelt werden. Um die pathologischen Mechanismen der BEST1 Mutationen besser zu verstehen und darauf hinarbeiten, mögliche Therapien, unbedingt studieren mutierten BEST1 Kanäle endogen in menschlichen RPE-Zellen exprimiert.

Jedoch RPE Zellen direkt vom live-Patienten ist sehr unpraktisch. Obwohl native RPE-Zellen aus Biopsien von menschlichen Leichen und Föten geerntet werden können, schränkt der schwierige Zugang zu diesen Quellen deutlich wissenschaftlichen Forschung. Daher ist es wichtig, alternative RPE-Quellen als das menschliche Auge. Dieser Aufruf wurde durch die jüngsten Fortschritte in der Stammzellenforschung Techniken beantwortet wie funktionale RPE-Zellen können jetzt aus menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs), einschließlich der embryonalen Stammzellen (hESC) unterschieden und pluripotente Stammzellen (HiPSCs), letzteres induzierte durch Umprogrammierung primäre Haut Fibroblasten vom Geber16,17,18generiert wird. Wichtig ist, der Selbsterneuerung und Pluripotenz von hPSCs gewährleisten eine zuverlässige Quelle um RPEs, zu erzeugen, während die Patienten Spezifität der HiPSCs und genomic Änderung Potenzial embryonaler (z. B.durch CRISPR) bieten ein vielseitiges Krankheit-Gericht-Modell für gewünschte BEST1 Mutationen.

hPSC-RPE hat mehrere Vorteile gegenüber Mäusen RPE Modelle: 1) BEST1 -Knockout-Mäusen zeigen kein Netzhaut Anomalie19, Anhebung der Möglichkeit unterschiedliche genetische Anforderungen der BEST1 im RPE zwischen Mäusen und Menschen; (2) nur 3 % der menschlichen RPE-Zellen sind zweikernige, im Gegensatz zu 35 % in Mäusen20; (3) HiPSC-RPE potenziert autologe Transplantation in der klinischen Behandlung von retinalen Erkrankungen des21. Dennoch, Tiermodelle sind nach wie vor unverzichtbar für ein Studium RPE Physiologie und Pathologie in einem live-System und die Onkogene Potential des HiPSC nicht zu übersehen.

Hier wird beschrieben, eine nützliche und mäßig einfach hPSC RPE Differenzierung-Protokolls, die für Forschung und klinische Zwecke verwendet werden können. Dieses Protokoll verwendet Nicotinamid (Vitamin B3) Differenzierung des hPSCs, Nervengewebe, erweitern die weitere induziert wird, in RPE zu unterscheiden durch die Behandlung mit Activin-A. Nicotinamid Behandlung ist gezeigt worden, die Zahl der pigmentierten Zellen (ein Zeichen der Differenzierung in RPE), möglicherweise durch mildernde die Aktivität Apoptotic Zellen22zu unterscheiden. Die resultierenden hPSC RPE-Zellen anzeigen die gleiche wichtige Marker, Kopfsteinpflaster Morphologie und zelluläre Funktionen als native menschlichen RPE Zellen22. Somit eignen sich inmitten der Forschung, die resultierenden hPSC RPE-Zellen für nachgeschaltete Funktionsanalysen einschließlich Immunoblotting, Immunostaining und ganze Zelle Patch Clamp, für die detaillierte experimentelle Verfahren sind ebenfalls vorhanden. RPE Zellen aus Stammzellen haben klinisch, großes Potenzial für die Transplantation Behandlung der Makula-Degeneration in tierexperimentellen Studien und Studien am Menschen23gezeigt.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Differenzierung der hPSC, RPE

  1. Pflegen und Durchgang hPSCs wie oben beschrieben18.
    Hinweis: Alle Zellen (einschließlich hPSCs und hPSC RPEs) werden bei 37 ° C um 5 % CO2 während der gesamten Dauer der Wachstum und Differenzierung Protokolle angebaut.
  2. Vor der Differenzierung, konfluierende hPSCs für vorbeschichtete 6-Well-Platten aufgeteilt.
    1. Zum Beschichten Platten, Basalmembran Matrix für ca. 1 h auf Eis Auftauen, auszusetzen Sondennahrung Matrix bei 4 ° C DMEM Medium eine 01:50 Verdünnung, jedes gut 800 µL beschichtungsmischung hinzu, und mindestens 1 h bei 37 ° c inkubieren
    2. Wenn die Beschichtung abgeschlossen ist, Aspirieren Sie die Mischung und fügen Sie sofort 1,5 – 2 mL Medium in die Vertiefungen.
    3. Um hPSCs von den alten Kultur-Platten heben, inkubieren Sie Zellen mit PBS plus 0,5 mM EDTA für 5 min bei Raumtemperatur, Aspirieren Sie die Lösung und aufzuwirbeln Sie Zellen in kleinen Klumpen mit Kulturmedium.
    4. Samenzellen bei ~ 20 % Konfluenz in die neuen Platten.
      Hinweis: Bewahren Sie Basalmembran Matrix in 100 µL-Aliquots bei-20 ° C auf und verwenden Sie eine Aliquote, um eine 6-Well-Platte zu beschichten. Die Zeit für die Beschichtung erweiterbar bis zu 4 h bei 37 ° C oder über Nacht bei Raumtemperatur. Es ist wichtig, auszusetzen und Samen hPSCs als kleine Klumpen von 3 – 5 Zellen anstatt einzelner Zellen.
  3. Wenn Zellen zur vollen Konfluenz angebaut werden, ersetzen Sie das Kulturmedium mit Differenzierung Medium (4 mL/na) (Tabelle 1, ohne Activin-A). Kultur für 14 Tage, Ändern des Mediums (4 mL/na) 3 X / Woche.
    Hinweis: Der hPSC Platte Dichte Doppel ca. alle 24 Std. erhebliche Zelltod wird nach dem Start des Verfahrens Differenzierung erwartet. Aggregate von abgestorbenen Zellen und Schmutz in den Vertiefungen ist während der mittleren Änderungen mit dem bloßen Auge zu sehen.
  4. Von 15 Tag zu Tag 28 Differenzierung Medium mit 100 ng/mL Human Activin-A (Tabelle 1, mit menschlichen Activin-A) zu ergänzen. Ändern Sie das Medium (4 mL/na) 3 X / Woche.
  5. Activin-A-Supplementierung ab Tag 29 (Tabelle 1, ohne menschlichen Activin-A) zu stoppen. Fahren Sie fort, Zelle Kultivierung in Differenzierung Medium für 8 – 10 Wochen bis pigmentierten hPSC-RPE-Cluster (Abbildung 1A-B) angezeigt werden.
    Hinweis: Cluster von pigmentierten Zellen können gesehen werden als kleine dunkle Punkte auf einer Zellplatte Kultur mit dem bloßen Auge (Abbildung 1A-B, oben). Einzelne pigmentierte Zellen mit der Signatur Kopfsteinpflaster Form sehen unter 20 X Mikroskop (Abbildung 1A-B, unten).

2. Isolierung und Kultur von differenzierten RPE-Zellen

  1. Entfernen Sie das Medium Differenzierung, einmal mit PBS waschen, fügen Sie 1 mL 0,05 % Trypsin plus 1 U/µL der Kollagenbildung in jede Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C für 20-30 min. entfernen die Trypsin/Kollagenase und sanft 2 mL vorgewärmten RPE-Medium in jede Vertiefung des 6-Well-Platte (< C0 > Tabelle 2).
    Hinweis: Verwenden Sie einem inversen Mikroskop, um die Morphologie der hPSC RPE-Zellen, die polygonale vor Trypsin/Kollagenase-Behandlung sind, zu überwachen und werden Sie Runde nach ausreichende Verdauung.
  2. Verwenden Sie einen Bunsenbrenner zu ziehen-Glas, das Pasteur Pipetten.
    1. Mit beiden Händen halten eine lange (9 Zoll) Pasteurpipette an beiden Enden, so ist die horizontale, und über dem Bunsenbrenner ca. 2/3 über die gesamte Länge des dünnen Teils der Pipette.
    2. Sobald das Glas von der Flamme weich wird, ziehen Sie schnell die beiden Enden auseinander, so dass eine Mikro Schaber-wie Spitze an das neue Ende der Pipette (Abbildung 2) gebildet wird.
    3. Wiederholen Sie mehrmals erstelle ich mehrere "Zell-Schaber". Spray zog Pipetten mit 70 % igem Ethanol für die Sterilisation und trocknen sie in der Zelle-Kultur-Haube.
  3. Unter dem Mikroskop verwenden eine Mikro "Zelle Schaber" sanft pigmentierten hPSC-RPE-Cluster von der Platte zu trennen.
    1. Klopfen Sie leicht (nicht reiben) direkt auf die pigmentierten Zellen, die schwimmt bis in das Kulturmedium sobald sie von der Unterseite des Brunnens zu distanzieren.
    2. Sofort verwenden Sie eine 20 µL Mikropipette sanft Absaugen der dissoziierten hPSC-RPE-Zellen und übertragen Sie sie auf eine vorbeschichtete 6-Well-Platte mit RPE mittlere24.
    3. ~ 5 x 103 Zellen (~ 10 % Konfluenz wie unter einem 20 X Mikroskop beobachtet) in jedem vorbeschichtet gut von einem 12-Well-Platte durch Wiederholen der Schritte 2.3.1–2.3.2 mehrfach, je nach Bedarf zu sammeln. Bringen Sie das Endvolumen des Mediums zu 2 mL.
      Hinweis: Zur Vermeidung von dissoziierten hPSC-RPE vermeiden Zellen von schwimmenden entfernt, Bewegung der Platten bei der Dissoziation so, dass die dissoziierten Zellen mittelfristig schwimmende sind aber noch lokal konzentriert bleiben.
  4. Kultur neu isoliert hPSC-RPE Zellen (P0) auf 12-Well-Platten im RPE Medium für weitere 6-8 Wochen damit sie sich eine pigmentierte Monolayer (Abbildung 1) bilden.
  5. Ändern Sie das Medium 3 X / Woche. Wenn Sie das Medium wechseln, lassen Sie etwa 1/3 Volumen des alten Mediums in jede Vertiefung und Volumen Sie 2/3 des frischen, vorgewärmten RPE-Mediums. Zu diesem Zeitpunkt verwenden Sie 2 mL RPE Medium für jede Vertiefung in einem 12-Well-Platte (1,3 mL Medium austauschen so jedes Mal).
    Hinweis: Der Monolage von P0 hPSC-RPE-Zellen bilden kann Kuppeln, was darauf hindeutet, dass die Zellen sind aktiv Transport von Flüssigkeiten und durch die tight Junctions25verankert sind. Kuppel Bildung ist daher ein Indikator für Reife RPE-Status.

(3) RPE Schicksal Validierung durch Immunoblotting

  1. Machen Sie die hPSC-RPE Zelle lysate mit Säugetier-Protein Extraktionspuffer ergänzt mit Proteinase Inhibitor cocktail. Inkubieren Sie die Zelle lysate auf Eis für 30 min vor der Zentrifugation bei 13.000 X g für 15 min bei 4 ° C, ungelöste zellenrückstand zu verwerfen. Messen Sie die Gesamt-Protein-Konzentration von lysate.
  2. Denaturieren 40 µg Gesamt-Protein in Laemmli SDS-Probenpuffer bei 75 ° C für 10 min. trennen das Protein Proben auf einem 10 %-Tris-Glycin SDS-PAGE-Gel bei einer Konstanten Spannung von 90 V für 15 min und dann 150 V bis der Farbstoff vorderen erreicht die Unterseite des Gels.
  3. Transfer der Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran in vorgekühlte Tris-Glycin Puffer mit 10 % Methanol bei 100 V für 1 h ergänzt.
  4. Blockieren Sie die Membran in Tris gepufferte Kochsalzlösung mit 0,1 % nicht-ionische Reinigungsmittel (TBST) und 5 % fettfreie Trockenmilch für 1 h bei Raumtemperatur.
  5. Inkubieren Sie die Membran mit Primärantikörpern verdünnt in den blockierenden Puffer bei 4 ° C über Nacht. Verdünnen Sie die Antikörper, die gezielt RPE-spezifische Marker-Proteine wie folgt: RPE65, 1:1 000; AUTOANTIGEN, 1:1 000; BEST1, 1:1 000. Verdünnen Sie die Antikörper gegen β-Aktin bei 1: 10.000, β-Actin als Kontrolle laden zu erkennen.
  6. Die Membran mit TBST 3 Mal mit 5 Minuten für jede Wäsche zu waschen.
  7. Inkubieren Sie die Membran mit Fluorophor konjugierten Ziege Anti-Maus IgG Sekundärantikörper verdünnt 1: 10.000 in blocking-Puffer für 1 h bei Raumtemperatur.
  8. Die Membran mit TBST 4 mal mit 10 min für jede Wäsche zu waschen.
  9. Erkennen Sie die Proteine, die über eine Infrarot imaging-System (Abbildung 3).

4. Überprüfung BEST1 subzelluläre Lokalisation durch Immunostaining

  1. HPSC RPE-Zellen mit 2 mL PBS einmal waschen und in 2 mL 4 % Paraformaldehyd für 45 min bei Raumtemperatur zu beheben.
  2. Zweimal mit 2 mL PBS waschen Sie und inkubieren Sie die Zellen in 2 mL PBS mit 0,1 % nichtionische Tenside und 2 % Esel-Serum für 45 min um die unspezifischen Bindungsstellen blockieren.
  3. Inkubieren Sie die Zellen mit BEST1 Antikörper (Verdünnung 1: 200) für 2 h bei Raumtemperatur.
  4. Waschen Sie die Zellen mit 2 mL PBS 3 Mal. Inkubieren mit Fluorophor konjugiert sekundäre IgG (1:1, 000) für 1 h bei Raumtemperatur.
  5. Waschen Sie mit 2 mL PBS 3mal, ungebundenen Sekundärantikörper zu entfernen.
  6. Beobachten Sie gefärbte Zellen durch konfokale Mikroskopie (Abbildung 4).

5. Aufnahme Ca2 +-abhängigen Cl– Stromin hPSC-RPE von Whole-Cell Patch Clamp

  1. 24-72 h vor der Patch-Clamp, split ein voll konfluierende (auf einem 12-Well-Platte) der Reifen P0 hPSC-RPE Zellen (Kopfsteinpflaster-förmigen und pigmentierten). Aspirieren Sie die einmal Mittel, Waschen mit PBS, und 1 mL 0,05 % Trypsin plus 1 U/µL Kollagenase in den Brunnen.
    Hinweis: Vorwärmen der Trypsin/Kollagenase auf 37 ° C direkt vor dem Gebrauch.
  2. Bei 37 ° C 8 min inkubieren.
    Hinweis: Nach diesem Schritt sind die hPSC RPE-Zellen noch anhaftende und verbunden.
  3. Verwenden Sie eine 1 mL mikropipette, um die Zellen aus der Platte vorsichtig waschen und übertragen Sie Zellen in der Verdauung Mischung auf eine 15 mL konische Rohr. Waschen Sie den Brunnen mit 1 mL vorgewärmten Trypsin/Kollagenase, die restlichen Zellen zu sammeln und kombinieren sie in der 15 mL konische Röhrchen.
    Hinweis: Der hPSC RPE-Zellen sind zu diesem Zeitpunkt noch in großen Klumpen. Versuchen Sie nicht, die Zelle Klumpen von kräftig pipettieren zu brechen. Einige Klumpen können an der Innenwand der 1 mL Spitze haften.
  4. Inkubieren Sie das konische Rohr in einem 37 ° C trocken Bad für 8 min.
  5. Verwenden einer Mikropipette 1 mL Pipette vorsichtig nach oben und unten 10-15 Mal die Verdauung Mischung.
    Hinweis: Die Zelle Klumpen werden viel kleiner, aber immer noch sichtbar. Vermeiden Sie kräftig pipettieren.
  6. Wiederholen Sie die beiden vorherigen Schritte.
    Hinweis: Die meisten Zellen sollte in Single-Zellsuspension nach pipettieren. Es gibt möglicherweise noch einige winzige Zelle Klumpen, die akzeptabel sind. Optional: Inkubieren Sie das konische Rohr bei 37 ° C für eine zusätzliche 5 min, gefolgt von sanften pipettieren. Die Gesamtzeit in der Trypsin/Kollagenase bei 37 ° C sollte 30 min (8 + 8 + 8 + 5 = 29) nicht überschreiten.
  7. Die 15 mL konische Röhrchen mit den verdauten Zellen fügen Sie 5 mL vorgewärmten RPE Medium hinzu. Drehen Sie mit 200 X g für 5 min um die Zellen zu sammeln. Wieder aussetzen und Samen Zellen auf vorbeschichtete 35 mm Schalen bei 10 – 20 % Konfluenz (z.B., eine 100 % gut auf ein 12-Well-Platte, 5 35 mm Gerichte für 10 % Konfluenz konfluierende).
    Hinweis: Zu allen Zeiten, vermeiden Sie kräftig pipettieren, das kann erhebliche Zelltod auslösen, vertreten durch scheinbare dunklen zellenrückstand im überstand nach Zentrifugation. Gut getrennten einzellige Aussaat ist essentiell für Patch-Clamp-Aufnahme.
  8. Führen Sie die gesamte Zelle Patch Klemmen Sie wie zuvor beschrieben18,26,27,28,29,30,31. Aktuelle Spuren aus einer Familie von Schritt Potenziale zu erwerben (-100 bis + 100 mV aus einem Holding Potential 0 mV) (Abbildung 5).
    Hinweis: Die Rezepte der internen und externen Lösungen sind in Tabelle 3 und Tabelle 4, bzw. beschrieben.

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Ergebnisse

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Der technisch anspruchsvolle Schritt ist die manuelle Isolierung, deren Ziel es ist, eine hohe Reinheit einer differenzierten P0 hPSC-RPE Bevölkerung zu erreichen. Nach einem erfolgreichen Isolierung > 90 % der Zellen in der P-0 -Bevölkerung werden wachsen und Reifen Signatur RPE Morphologien (Abbildung 1) angezeigt. Die Existenz des einen geringen Anteil von nicht-RPE oder unreif RPE-Zellen in der P-0 -Bevölkerung ist fast...

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Diskussion

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Das wichtigste Verfahren für die Krankheit im Gericht Ansatz soll hPSCs mit einer krankheitsverursachenden Mutation auf die richtige Zelle Abstammung zu unterscheiden, die RPE für BEST1ist. So sollte nach jeder Differenzierung Experiment die resultierenden hPSC RPE-Zellen sorgfältig für ihren Reifen Status von RPE-spezifische Morphologien und Protein-Marker16,17,18überprüft werden. Zur Minimierung von klonalen Artefakt ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Projekt wurde von NIH-Stipendien EY025290, GM127652 und University of Rochester Anschubfinanzierung finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Knock-Out (KO) DMEMThermoFisher 10829018
KO SerumersatzThermoFisher10829028
Nichtessentielle AminosäurenThermoFisher11140050
GlutaminThermoFisher35050061
Penicillin-StreptomycinThermoFisher10378016
NicotinamidSigma-AldrichN0636
Humanes Activin-APeproTech120-14
MEM (eine Modifikation)Sigma-AldrichM4526
Fötales RinderserumVWR97068-085
N1 ErgänzungSigma-AldrichN6530
Glutamin-Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichG1146
Nichtessentielle AminosäurenSigma-AldrichM7156
TaurinSigma-AldrichT0625
HydrocortisonSigma-AldrichH0386
Trijod-ThyroninSigma-AldrichT5516
mTeSR-1 MediumStemcell Technologies5850
MatrigelCorning356230
KollagenaseGibco17104019
TrypsinVWR45000-664
M-PER Reagenz zur Extraktion von SäugetierproteinenPierce78501
Proteinase-Inhibitor-CocktailSigma-Aldrich4693159001
RPE65 AntikörperNovus BiologicalsNB100-355
CRALBPAntikörperAbcamab15051
BEST1 AntikörperNovus BiologicalsNB300-164
Beta Aktin AntikörperThermoFisherMA5-15739
Alexa Fluor 488-konjugierter Esel Anti-Maus ThermoFisherA-21202
Ziege Anti-MausIgG ThermoFisherSA5-35521
Ziege Anti-Kaninchen IgGLI-COR Biosciences926-68071
Hoechst 33342ThermoFisher62249
HEKA EPC10 Patch-Clamp-VerstärkerWarner Instruments895000
PatchmasterWarner Instruments895040

Referenzen

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