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Methodenartikel

Ovarian Tissue Culture Phänomene in der Maus Eierstock zu visualisieren

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DOI:

10.3791/57794

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19. Juni 2018

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1Department of Physiology, Aichi Medical University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 3Department of Maternal and Perinatal Medicine, Nagoya University Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eierstöcke Gewebekulturen als Modelle der Follikel Entwicklung, Eisprung und Follikel Atresie einsetzbar und regulatorische Mechanismen der Eierstöcke Dynamiken zeigen.

Zusammenfassung

Säugetier-Frauen Eisprung in regelmäßigen Abständen eine nahezu konstante Anzahl von Eizellen bei jedem Brunst-Zyklus. Um solche Regelmäßigkeit und Häufigkeit zu erhalten, tritt die Verordnung auf die Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden Achse-Ebene und auf die Entwicklung der Follikel in den Eierstöcken. Trotz aktiven Studien sind Follikel Fördermechanismen nicht klar wegen der mehrere Schritte aus der ruhenden primordialen Follikel-Aktivierung zur Ovulation und aufgrund der Komplexität der Verordnung, die in jeder follikuläre Phase unterscheidet. Um die Mechanismen der Entwicklung der Follikel und die Dynamik der Follikel während des Östrus Zyklus zu untersuchen, entwickelten wir ein Mausmodell ovariellen Gewebe-Kultur, die verwendet werden, um die Entwicklung der Follikel mit einem Mikroskop zu beobachten. Systematische Follikel Entwicklung und regelmäßigen Eisprung Follikel Atresie können alle im kultivierten Eierstock Modell reproduziert werden, und die Kulturbedingungen experimentell moduliert werden können. Hier zeigen wir die Nützlichkeit dieser Methode in der Studie die regulatorischen Mechanismen der Entwicklung der Follikel und anderen Eierstock Phänomene.

Einleitung

Weibliche Maus Eierstöcke enthalten mehrere tausend Follikel1und regelmäßigen Eisprung reift etwa zehn Eizellen bei jedem Brunst-Zyklus. Follikel sind in mehrere Entwicklungsstufen eingeteilt: Primordial, Primar-, Sekundar-, antral, und Graafian Follikel, abhängig von der Form der Granulosa zellulärer Ebene rund um jede Eizelle. Die meisten primordialfollikel ruhen, und einige von ihnen werden aktiviert und wachsen in primären Follikel bei jeder Östrus Zyklus2. Nach der sekundären follikuläre Phase ist Follikel Entwicklung vor allem von Gonadotropinen, follikuläre stimulierende Hormon (FSH) und Luteinisierendes Hormon (LH) geregelt. Jedoch ursprüngliche und primäre Follikel Entwicklung ist unabhängig von der Gonadotropin und Regulationsmechanismen, die diese Stufen Regeln bleiben schlecht Inderstood3,4,5. Die ursprüngliche und primäre Follikel ist zusätzlich Wachstumsfaktoren und Hormone die Interaktionen zwischen den Follikeln6,7geregelt. Daher wir Analysen der Follikel Dynamik in Maus Eierstock Gewebe durchgeführt, und die damit verbundenen Regulationsmechanismen mit Eierstockkrebs Gewebekulturen8,9,10untersucht.

Hier stellen wir zwei Eierstöcke Gewebekultur Modell Methoden. Die erste dient zur Follikel Entwicklung analysieren durch Messung der follikulären Bereiche, und die zweite wird verwendet, um den Regulierungsmechanismus in frühen Entwicklung der Follikel aus ur auf sekundäre Follikel Bühne mit transgenen Mäusen zu studieren. Für Follikel Entwicklungsanalyse benutzten wir hauptsächlich Eierstöcke der 4 - Wochen alten weiblichen Mäusen, weil sie für einfache Visualisierung der Follikel ermöglichen. Um regelmäßige Ovulation und Modellentwicklung in Vivo Follikel zu induzieren, reproduziert wir LH-Anstieg und beobachteten Eisprung Follikel Atresie und Sekretion von Estradiol Gewebekultur Bedingungen. Bilder der kultivierten Eierstöcke wurden gefangen genommen, und die Follikel Entwicklungsprozesse durch Rückverfolgung Veränderungen im Bereich follikulären analysiert wurden. Allerdings war die Unterscheidung zwischen ursprünglicher und frühen primären Follikel im Hellfeld Mikroskopieren Analysen, unklar. So wir entwickelten eine Methode, um kleine Follikel zu erkennen und zu unterscheiden zwischen dem ursprünglichen, primäre, und sekundäre Follikel in kultivierten ovariellen Gewebe mit Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 und R26-H2B-mCherry Transgene Mäuse Eierstöcke bei 0 und 4 Tage nach Geburt11. Oog1 Ausdruck ist nachweisbar in Eizellen nach Inkrafttreten der Meiose und allmählich mit der Entwicklung der Follikel, so dass Beobachtung des Übergangs vom ursprünglichen primären Follikel mit Zeitraffer-Bilder der kultivierten eierstockgewebe11 ,12. Obwohl morphologische Methoden verwendet wurden, um Faktoren zu untersuchen, die ruhende primordialfollikel13,14,15,16aktivieren, ist die Entwicklung der physiologischen Follikel in den Eierstöcken schwer zu beobachten, und die Effekte verschiedener Faktoren bleiben fußgelenkes. Die gegenwärtige Kulturmethoden wurden entwickelt, um diesen Mangel in Echtzeit Analysen Ziel Faktoren anzugehen.

In der vorliegenden Studie wir follikulären Entwicklung mit einem Zeitraffer bildgebenden Methode verfolgt und charakterisiert den Prozess der Entwicklung der Follikel. Unsere neuartigen Methoden bieten ein noch nie da gewesenen Instrument zur Erforschung der Physiologie der Eierstöcke.

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Protokoll

Mäuse wurden in einem ökologisch kontrollierten Raum 23 ±1 ° C mit einem 12 h Licht/12 h dunklen Zyklus untergebracht. Tierbetreuung Protokolle und Experimente wurden gemäß den Richtlinien für Tier-Experimente an der Aichi Medical University durchgeführt und von der etablierten Tier Pflege und Nutzung Ausschuss angenommen wurden.

1. Vorbereitung des Kulturmediums und Gerichte

  1. Fügen Sie um grundlegende Kulturmedium vorzubereiten, fetalen bovine Serum (FBS, 5 % V/V), FSH (100 mIU/mL), LH (10 mU/mL) und Penicillin-Streptomycin (Penicillin, 100 U/mL; Streptomycin, 100 mg/mL), minimale wesentliche mittlere Alpha (MEM-Alpha) und mischen in 50 mL Röhrchen.
    Hinweis: Gesamtvolumen der erforderlichen Nährmedien variieren zwischen Experimente, aber 1 mL Kulturmedium ist in der Regel ausreichend für 3,5 cm Glasboden Kultur Gerichte.
  2. Gießen Sie 1 mL Aliquote gemischte Kulturmedium in 3,5 cm Glasboden Kultur Gerichte und Gerichte eingelassen Sie statt 30 mm Zelle Kultur Einsätze. Wärmen Sie vor, Medien und Gerichte in einem Inkubator (5 % CO2 und 37 ° C).

2. Vorbereitung von Eierstockgewebe

  1. Pre-warme Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (−) und MEM-Alpha mit 5 % FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 mg/mL Streptomycin im Inkubator (5 % CO2 und 37 ° C).
    Hinweis: Etwa 3 mL Aliquote von PBS (−) pro Eierstock sind ausreichend für den Einsatz im Eierstock Sezierungen, und 1 mL Aliquots der MEM-Alpha sind ausreichend für die vorübergehende Speicherung einzelner Eierstöcke in 3,5 cm Gerichte.
  2. Verbrauchsteuern Sie Eierstöcke aus 4 - Wochen alten weiblichen ICR (benannt nach dem Institute of Cancer Research) Mäusen und trimmen Sie das Gewebe um den Eierstock mit Schere und Pinzette stereoskopische Mikroskop zu. Reservieren Sie die entfernten Eierstöcken in Kulturmedium (siehe Punkt 2.1) bis zur Verwendung.
    1. Statt einzelne Eierstöcke auf Filterpapier befeuchtet mit vorgewärmt PBS (−) (siehe Punkt 2.1) und in Scheiben schneiden in 4 Stücke, die mit einem Mikrotom Klinge unter dem stereoskopische Mikroskop.
      Hinweis: Eierstöcke der 4 - Wochen alten ICR Mäuse sind ca. 2 mm im Durchmesser. Die Anzahl der Stücke hängt von der Eierstock-Größe; etwa 500 µm Dicke Stücke erlauben jedoch für korrekte Follikel Beobachtungen (in Stücke dicker als 500 mm, Gewebe Transparenz wird verringert; in Stücke dünner als 500 mm, viele antrale Follikel sind gebrochen und verloren).
    2. Legen Sie nach Dissektion die in Scheiben geschnittenen Eierstock Exemplare in vorgewärmten Kulturmedium in 3,5 cm Gerichte (siehe Punkt 2.1).

(3) Eierstock Gewebekultur

  1. Fallen etwa 0,5 µL Kulturmedium pro geschnitten eierstockgewebe auf die Zelle Kultur einfügen wo werden die ovarielle Gewebe mit einer Mikropipette eingestellt.
  2. Platzieren Sie jedes geschnittene Muster zu einem Tropfen Kulturmedium auf die Zelle-Kultur-Einsätze mit einer Pinzette.
  3. Kultur der Eierstock-Gewebe in 5 % CO2 bei 37 ° C.
  4. Ersetzen Sie das Kulturmedium mit frischen vorgewärmten Medium alle 2 Tage.
    Hinweis: Der Zeitplan für mittlere Veränderungen für die Kultur der Eierstock Abschnitte von 4 - Wochen alten ICR Mäusen ist in Abbildung 1dargestellt.
    1. Für die Reproduktion den LH-Anstieg behandeln Sie kultivierten 4 - Wochen alten ICR Mäuse Eierstöcke mit dem Medium mit 100 mU/mL FSH und LH für 12 h alle 4 Tage (Abbildung 1).

(4) Mikroskopaufnahmen kultivierten Eierstöcke

  1. Starten Sie imaging die kultivierten Eierstöcke nach Tag 1 Wenn das Gewebe auf die Zelle Kultur Einsätze geklebt haben und konfokale oder umgekehrtes Mikroskop Analysen in 24 h Abständen ausreichend Follikelwachstums zwischen Zeitpunkten zu ermöglichen.
    Hinweis: Konfokale Mikroskopie ist besser als invertierte Mikroskopie zur Beobachtung von Follikeln in ganzen kultivierten Eierstöcke.

(5) Zeitraffer Imaging kultivierten Eierstöcke

  1. Optimieren Sie die Time-Lapse imaging Bedingungen, einschließlich Laser-Intensitäten und Belichtungszeiten für die imaging-System (Tabelle 1).
    1. Wählen Sie gepaarten Eierstock Proben von einzelnen Mäusen für den Einsatz als Behandlung und Kontrollgruppen. Variieren Sie Laser Intensitäten und Belichtungszeit, die besten Bilder (Tabelle 1) zu erreichen.
    2. Vergleichen Sie Follikelwachstums unter jeder Bedingung Kultur durch die Messung der Follikel Bereiche in Bildern von Kontrollproben in 24-Stunden-Intervallen und in Zeitraffer bildgebenden Proben (siehe Schritt 6). Gleichzeitig die Anzahl der Eisprung Eizellen in jedem Eierstock-Satz und wählen Sie die optimale Zeitraffer imaging Bedingungen.
  2. Die Aufnahmen Sie in 30 min Abständen mit Zeitraffer-imaging-System unter den festgelegten Bedingungen (Tabelle 1).

(6) Follikel Wachstum Analyse

  1. Um die Entwicklung der Follikel zu analysieren, Messen Sie die Follikel Bereiche der aufgenommenen Bilder mit ImageJ-Software (http://resbweb.nih.gov/ij/).
    1. Zunächst legen Sie den Maßstab des Bildes durch Klicken auf "Set Scale" unter "Analysieren" in der Symbolleiste. Geben Sie die Seitenlängen der das aufgenommene Bild und der entsprechenden Anzahl von Pixel in die leeren Felder der "Bekannten Abstand" und "Abstand in Pixel", beziehungsweise.
    2. Klicken Sie auf "Freie Hand" in der Symbolleiste und skizzieren Sie die Follikel in den erfassten Hellfeld-Bildern zu.
    3. Klicken Sie auf "Messen" unter "Analysieren" in der Symbolleiste.
      Hinweis: Wenn andere Messdaten gewünscht werden, klicken Sie auf "Messung" unter "Analysieren" in der Werkzeugleiste, und überprüfen Sie die entsprechenden Felder in der Liste.

7. Analyse der Entwicklung der Follikel mit transgenen Mäusen

  1. Sammeln Sie Eierstöcke von postnatalen Tagen 0 und 4 (P0 und P4) weibliche Transgene Mäuse mit den transgenen Oog1pro3.9 R26-H2B-mCherrund Kultur auf Einsätze wie in beschrieben Schritte 1.1 – 3.2, außer nicht Slice der P0 und P4 Eierstöcke.
  2. Ersetzen Sie das Kulturmedium mit frischen, vorgewärmten Medium in 3,5 cm Gerichte in einem Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 ° C alle 2 Tage.
    Hinweis: Die Konzentration von LH in das Kulturmedium P0 und P4 Eierstöcke kann konstant bleiben, weil LH Überspannungen in P0 und P4 Mäuse nicht vorkommen.
  3. Legen Sie das Mikroskop nur AcGFP1-positiven primären Follikel in kultivierten P4 Eierstöcken (Tabelle 1) zu visualisieren.
    Hinweis: Nur ursprüngliche und primäre Follikel sind in P4 weibliche Maus Eierstöcke.
  4. Die Aufnahmen der kultivierten P0 Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry Transgene Mäuse Eierstöcke in 30 min Abständen mit den Einstellungen für P4 Eierstöcke (siehe Punkt 5.2).
  5. Verfolgen Sie und analysieren Sie Follikel Entwicklung mit AcGFP1 und H2B-mCHerry Signale.

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt das Protokoll für Änderungen in den Medien während der ovariellen Gewebe-Kultur. Nach diesem Programm 4 Wochen alten ICR Mäuse Eierstöcke wurden kultiviert und in 24-Stunden-Abständen mit konfokalen Mikroskopie (Abbildung 2) abgebildet. Während der Kultur der Eierstock Gewebe für 3 Wochen die meisten antral und sekundäre Follikel wurden durch Follikel Atresie degeneriert und einige waren Eisprung (

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Diskussion

In dieser Studie haben wir zwei neue Methoden für die Untersuchung der Entwicklung der Follikel in den Eierstöcken Maus entwickelt. Die erste Methode beinhaltet Kultur der geschnittenen Eierstock Erwachsener Mäuse Gewebe gefolgt von Analysen zur Entwicklung der Follikel, und die zweite beinhaltet die Verwendung von Time-Lapse imaging zu visualisieren, frühe Entwicklung der Follikel bei der Gonadotropin-unabhängig. Zuvor wir verwendet das vorliegende Eierstock Gewebekultur Verfahren zur Beurteilung der Wirkung von hemmend...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir danken Dr. Naojiro Minami (Kyoto University) für die Bereitstellung der Oog1pro3.9 Mäuse. Diese Forschung wurde von der JSPS (KAKENHI # JP15H06275) und der Nitto-Stiftung unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Follikelstimulierendes Hormon aus der menschlichen HypophyseSIGMAF4021
Lutenisierendes Hormon aus der Hypophyse des PferdesSIGMAL9773
Penicillin-Streptomycin-LösungWako Pure Chemical Industries168-23191
MEM a, GlutaMax, ohne NukleotideThermo Fisher32561037
GlasbodenschaleMatTekP35G-0-10-C35mm Schale, Nr. 0 Deckglas, 10mm Glasdurchmesser
Millicell ZellkultureinsatzMerck Millipore PICM0RG50Durchmesser: 315 mm, Porengröße: 0,4 mm, Material: hydrophil PTTE
3,5cm ZellkulturschalenGreiner Bio-One627160
50ml / Zentrifugenröhrchen mit dreifacher VerschlusskappeIWAKI2345-050
Low-Profile Einwegklingen 819Leica14035838925
LSM 710Carl ZeissKonfokalmikroskop
CellVoyager, CV1000Yokogawa Electric CorporationZeitrafferaufnahmen
BZ-X700KEYENCEZeitrafferaufnahmen

Referenzen

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