Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine effiziente Einzelschritt-Reinigung des aktiven unmarkierten Menschen zehn-elf Translokation-2 (TET2) 5 Methylcytosine Dioxygenase mit Ionenaustausch Chromatographie und seine Assay mit eine flüssige Chromatographie-Tandem-Masse Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Ansatz.
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Methodenartikel
Effiziente Reinigung und LC-MS/MS-basierten Assay-Entwicklung für zehn-elf Translokation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die epigenetische Transkription Verordnung vermittelt durch 5-Methylcytosine (5mC) hat in eukaryotischen Entwicklung eine entscheidende Rolle gespielt. Demethylierung dieser epigenetischen Markierungen geschieht durch sequentielle Oxidation durch zehn-elf Translokation Dioxygenases (TET1-3), gefolgt von Thymin-DNA-Glycosylase-abhängige base Excision Repair. Inaktivierung des Gens TET2 aufgrund von genetischen Mutationen oder durch andere epigenetischen Mechanismen ist verbunden mit einer schlechten Prognose bei Patienten mit verschiedenen Krebsarten, vor allem hämatopoetischen Malignome. Hier beschreiben wir eine effiziente Einzelschritt-Reinigung des enzymatisch aktive unmarkierten menschlichen TET2 Dioxygenase mit KATIONENAUSTAUSCH-Chromatographie. Weiter bieten wir einen flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Ansatz, der trennen und die vier normale DNA-Basen (A, T, G und C), sowie die vier modifizierte Cytosin-Basen (5-Methyl, 5-Hydroxymethyl, 5-Formyl und 5-Carboxylgruppen) zu quantifizieren. Dieser Test kann verwendet werden, um die Aktivität der Wildtyp und Mutanten TET2 Dioxygenases zu bewerten.
Einleitung
Die C5-Position von Cytosin-Basen innerhalb von CpG dinucleotid ist die vorherrschende Methylierung-Website (5mCpG) in Säugetier-Genome1. Eine Reihe neuerer Studien haben darüber hinaus umfangreiche C5 Cytosin Methylierung (5mC) in nicht-CpG Websites entdeckt (5mCpH, wo H = A, T, oder C)2,3. 5mC Änderung dient als transkriptioneller Schalldämpfer bei endogenen Retrotransposons und Gen Promotoren3,4,5. DNA-Methylierung bei 5mC spielt auch eine wichtige Rolle im x-Chromosom Inaktivierung, gen Prä....
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Protokoll
1. Klonen und Reinigung des unmarkierten menschlichen TET2 Dioxygenase
- Klonen Sie menschlichen TET2 Dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) in den pDEST14-Ziel-Vektor mit der ortsspezifische Rekombination Technik wie zuvor beschrieben22.
Hinweis: Frühere Studien haben gezeigt, dass die C-terminale TET2 Dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) Domäne der minimalen katalytisch aktiven Domain21,23. Um die unmarkierten TET2 Dioxygenase Domäne mithilfe des pDONR221-Vektors auszudrücken, Flossen Shine-Dalgarno und Kozak-Sequenzen in der forward Primer während der PCR (Ta....
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Ergebnisse
Dynamisierung der 5mC in der DNA durch Dioxygenases TET-Familie spielt eine wichtige Rolle in epigenetische transkriptionelle Verordnungen. TET2 Dioxygenase ist häufig in diversen hämatopoetischen Tumoren12mutiert. Um die Rolle des Enzyms TET2 in der normalen Entwicklung und Krankheit zu untersuchen, haben wir seine minimale katalytisch aktiven Domain ohne jede Affinität-Tag in pDEST14 Vector22geklont. Die unmarkierten TET2 Dioxygenase entst.......
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Diskussion
Mutationen im TET2-gen sind einige der am häufigsten gefundenen genetischen Veränderungen bei Patienten mit unterschiedlichen hämatopoetischen Malignome. Bis heute hunderte von verschiedenen TET2 Mutationen, darunter Unsinn, Frame-Shift und Missense-Mutationen wurden in Patienten12identifiziert. Patienten mit TET2 Mutationen zeigen niedrige Konzentrationen von genomischen 5hmC im Knochenmark, im Vergleich zu denen mit wt-TET214. Mutierte TET2 Knock-in Expe.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine finanziellen Interessen zu erklären.
Danksagungen
Diese Forschung wurde finanziert durch das US Department of Defense in Form eines Idea Award (W81XWH-13-1-0174), aplastischer Anämie & MDS Foundation Grant, und UMRB Grant, M.M. Authors Danke Mohit Jaiswal und Subhradeep Bhar für erste Klonen von TET2 in pDEST14 Vektor.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Eisen(II)-sulfat-Heptahydrat | Sigma-Aldrich | F8633& | |
| alpha;-Ketoglutarsäure (2-Oxoglutarsäure) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbinsäure | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalzdihydrat | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammoniumacetat | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitril | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Wasser in HPLC-Qualität | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo Clean und Konzentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuklease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (alkalische Phosphatase im Kälberdarm) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholin)ethansulfonsäure-Monohydrat] | Carbosynth | FM37015 | |
| Natriumchlorid | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerin | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Desoxy-5-methylcytidin | TCI | D3610 | |
| 2'-Desoxy-5-hydroxymethyalcytidin | TCI | D4220 | |
| 2'-Desoxycytidin-5-carbonsäure, Natriumsalz | Berry & Ampere; Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-Desoxycytidin | Berry & Gesellschafter | PY 7589 | |
| 2'-Desoxycytidin | Beere & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Desoxyadenosin | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Desoxyguanosin | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Desoxythymidin | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway-Technologie | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R Zentrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| Auml; KTA FPLC-System | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 Gefriertrocknungssystem | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo-Aufreinigungskolonnen | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 Säule | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap Massenspektrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC-Säule | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
Referenzen
- Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341
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Nachdrucke und Genehmigungen
