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Research Article
Carolina C. Monte-Bello*1,2, Elias F. Araujo*1,3, Marina C.M. Martins1, Valeria Mafra4, Viviane C.H. da Silva1,2, Viviane Celente1, Camila Caldana1,5
1Brazilian Bioethanol Science and Technology Laboratory (CTBE),Brazilian Center for Research in energy and materials (CNPEM), 2University of Campinas (UNICAMP), 3University of Viçosa (UFV), 4CTBE,CNPEM, 5Brazilian Bioethanol Science and Technology Laboratory (CTBE/CNPEM),Max Planck Partner Group
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Erratum Notice
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Retraction Notice
The article Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology. View Retraction Notice
Eine einfache, vielseitige und preisgünstige in-vitro- Hydrokultur-System wurde erfolgreich optimiert und ermöglichen umfangreiche Experimente unter sterilen Bedingungen. Dieses System erleichtert die Anwendung von Chemikalien in einer Lösung und deren effiziente Absorption von Wurzeln für molekularen, biochemischen und physiologischen Studien.
Eine Vielzahl von Studien in Pflanzenbiologie werden mit hydroponischen Kulturen durchgeführt. In dieser Arbeit wird ein in-vitro- Hydroponische Wachstum System für die Bewertung der Pflanze Reaktionen auf Chemikalien und anderen Stoffen von Interesse vorgestellt. Dieses System ist höchst effizient in homogenen und gesunde Setzlinge der C3 und C4 Modell Spezies Arabidopsis Thaliana und Setaria Viridis, bzw. zu erhalten. Der sterile Anbau vermeidet Algen und Mikroorganismen Kontamination, die limitierende Faktoren für Anlage normales Wachstum und Entwicklung in Hydrokultur bekannt sind. Darüber hinaus ist dieses System skalierbar, ermöglicht die Ernte von Pflanzenmaterial in großem Maßstab mit kleinere mechanische Schäden als auch die Ernte der einzelnen Teile einer Pflanze, falls gewünscht. Ein detailliertes Protokoll zeigt, dass dieses System verfügt über eine einfache und kostengünstige Montage, da sie Pipette Racks als wichtigste Plattform verwendet für den Anbau von Pflanzen, steht zur Verfügung. Die Durchführbarkeit dieses Systems war mit Arabidopsis Sämlinge zur Beurteilung der Wirkung des Medikaments AZD-8055, eine chemische das Ziel von Rapamycin (TOR)-Kinase-Inhibitor validiert. TOR-Hemmung wurde effizient so früh wie 30 min nach einer AZD-8055-Behandlung in Wurzeln und Triebe erkannt. Darüber hinaus angezeigt AZD-8055-behandelten Pflanzen den erwarteten Stärke-Überschuss-Phänotyp. Wir diese Hydrokultur-System als eine ideale Methode für Pflanzenforscher mit dem Ziel, die Wirkung der Pflanze Induktoren oder Inhibitoren, sowie zu überwachen, bewerten metabolischen Flüsse mit Isotopen-Kennzeichnung Verbindungen, die in der Regel erfordert die Verwendung von teuren vorgeschlagen Reagenzien.
Die Vorteile der Verwendung von Hydrokultur Pflanzen haben in der Produktion von großen und einheitliche Pflanzen ermöglichen reproduzierbare Experimente1,2,3weithin anerkannt. In diesem System kann die Zusammensetzung der Nährlösung ordnungsgemäß kontrolliert und recycelt alle Stufen von Wachstum und Entwicklung. Darüber hinaus sind Wurzeln nicht abiotischen Belastungen ausgesetzt, wie im Boden gewachsen Pflanzen, wie Nährstoff Hunger und Wasser-Mangel4auftreten können. Als Pflanzen hydroponisch vorliegende morphologische und physiologische Eigenschaften ziemlich ähnlich denen in Erde kultiviert hat dieses System im großen und ganzen in der Forschung tätig weil es erlaubt, die Überwachung der Wurzel/Sprosswachstum und ihre Ernte ohne Verletzungen2,5.
Aufgrund der Möglichkeit der Änderung der Zusammensetzung und Konzentration von der Nährlösung der Großteil der Forschung mit Hydrokultur Bedingungen durchgeführt wurde, um die Funktionen von Mikro- und Makronährstoffen1,3 charakterisieren ,6,7,8. Allerdings hat dieses System erwies sich als sehr nützlich, um ein breites Anwendungsspektrum in Pflanzenbiologie, wie die Funktionen von Hormonen und Chemikalien in Pflanzen aufzuklären. Zum Beispiel wurden die Entdeckung des Strigolactones als eine neue Klasse von Hormonen9 und der beschleunigten Wachstums Phänotyp ausgelöst durch Brassinosteroid Anwendung10 Hydrokultur Bedingungen durchgeführt. Darüber hinaus ermöglicht dieses System Experimente mit beschrifteten Isotope (z.B., 14N /15N und 13CO2)11,12 , deren Eingliederung in Proteinen und Metaboliten zu bewerten durch Massenspektrometrie.
In Anbetracht der Bedeutung dieses Systems in der Pflanzenforschung, eine hohe Anzahl von hydroponischen Kulturen wurde in den letzten Jahren, einschließlich Systeme, mit denen (i) die Übertragung der Sämlinge aus Platten auf Hydrokultur Container3, 13; (Ii) Rockwool, die Zugang zu den frühen Stadien der Wurzel Entwicklung2,14,15begrenzt; (Iii) Polyethylen-Granulat als Schwimmkörper, wodurch die einheitliche Anwendung der kleinen Moleküle/Behandlungen schwierig16; oder (iv) eine reduzierte Anzahl von Pflanzen9,17. Das Volumen der Hydrokultur Panzer beschrieben in vielen dieser Protokolle sind in der Regel groß (kleine Volumen von 1-5 L, bis zu 32 L)18, die die Anwendung von Chemikalien extrem teuer macht. Obwohl einige Studien eine Hydrokultur unter aseptischen Bedingungen8,beschreiben ist19, die Montage des Systems in der Regel ziemlich mühsam, bestehend aus die perfekte Abstimmung von Nylon Maschen in Kunststoff oder Glas Container5,8,17,20.
Wegen der Bedeutung als Modellpflanze Arabidopsis Thaliana wurden die Mehrheit der Hydroponik-Systeme für diese Arten1,2,8,14,18, entwickelt. 19 , 20. Dennoch gibt es einige Studien, die die Hydroponische Wachstum Berichtsfunktionen anderer Pflanzenarten mit eine Vorbehandlung der Samen ihre Keimfähigkeit zu verbessern und Synchronisation Preise in-vitro-8,16 . Um im großen Maßstab zu arbeiten, entwickelten wir ein Protokoll für eine einfache und kostengünstige Wartung Hydrokultur-System, mit dem sterile Bedingungen für den Anbau von Pflanzen, darunter A. Thaliana und andere Arten, wie der Rasen Setaria kann einrichten Viridis. Die hier beschriebene Methode eignet sich für verschiedene Experimente, wie das Wachstum des Keimlings maximiert, synchronisiert und leicht überwacht werden kann. Dieses System hat viele Vorteile wie: (i) die Montage ist unkompliziert und seiner Komponenten wiederverwendet werden; (Ii) es ermöglicht die einfache Anwendung von verschiedenen Chemikalien in das flüssige Medium; (Iii) die Sämlinge Keimen und wachsen direkt in das Kulturmedium ohne die Notwendigkeit der Übertragung der Hydrokultur-System; (iv) das schießen und Wurzel Entwicklung/Wachstum eng überwacht werden können und die Keimlinge geerntet werden, ohne Schäden; und (V) es macht es möglich, auf einer großen Skala arbeiten Aufrechterhaltung der physiologischen Bedingungen.
1. Vorbereitung von flüssigen und festen Nährmedien
(2) hydroponic System Montage
Hinweis: Diese Schritte sorgfältig befolgt werden um die hydroponic System zu bauen.
3. Samen Sterilisation
(4) Seed-Anwendung
(5) Validierung die Verwendung von diesem Hydroponic System Target of Rapamycin-Kinase hemmen
Hinweis: Diese Hydrokultur-System wurde ursprünglich entwickelt, um die Verwaltung von Chemikalien zu Pflanzen, zu erleichtern, sind im Allgemeinen sehr teuer in groß angelegten Experimenten angewendet werden. Als ein Proof of Concept wurde die ATP-kompetitiver Inhibitor AZD-8055, das bekannt ist, gezielt die ATP-Bindungsstelle des TOR Protein Kinase22, eingesetzt, um die Unterdrückung der TOR-Aktivität in Sämlinge von A. Thaliana Columbia-0 (folgen Die Nottingham Arabidopsis Lager Zentrum, NASC-ID: N22681). Das verwendete Protokoll wird hier kurz beschrieben.
TOR-Kinase ist ein wichtiger Regulator, der Nährstoff- und Förderung der Zellproliferation und Wachstum in allen Eukaryoten Signalisierung integriert. Bemühungen, TOR-Funktionen in Pflanzen aufzuklären beinhalten die Generation der Arabidopsis transgenen Linien mit TOR bedingte Unterdrückung durch RNA-Interferenz oder künstliche MicroRNA28,30,31, Angesichts den Embryo tödliche Phänotyp TOR ko Pflanzen32,33,34,35. Die meisten bedingte transgenen Linien sind unter der Kontrolle von Östradiol-Dexamethason oder Ethanol-induzierbaren Promotoren, die auch machen könnte diese Hydrokultur-System nutzen.
Eines der bekannten Ziele der TOR-Aktivität in Arabidopsis ist die direkte Phosphorylierung der ribosomalen Proteins S6 Kinase (S6K)34,36,37,38. Nach Phosphorylierung, phosphorylates S6K weitere 40 s ribosomalen Proteins S6 (RPS6), beeinflussen die ribosomale Protein Übersetzung24,39,40. Vor kurzem wurde nachgewiesen, dass die Phosphorylierung einer RPS6 Ser240-Site ein guter Marker für TOR Aktivität24 ist. Immunoblotting Tests bestätigt, dass bald nach 30 min von Medikamentengabe, ein deutlichen Rückgang der Ser240 Phosphorylierung in Wurzeln und Triebe (Abbildung 2) beobachtet wurde. Unter den experimentellen Bedingungen verwendet hat AZD-8055 auch gezeigt, ein potenter Inhibitor der TOR, der schnell die Kinase-Aktivität unterdrückt.
Transgene Arabidopsis -Linien mit einer reduzierten Expression des Gens TOR oder Komponenten der komplexen TOR präsentieren eine klare Stärke überschüssige Phänotyp28,31. Qualitative Analyse der Stärke mit Lugol Lösung offenbart das erwartete Muster der Stärke Akkumulation und Abbau während der Diel-Zyklus (Abbildung 3). Sämlinge, die keine Anwendung von DMSO oder AZD-8055 erhielten zeigte keine größere Ansammlung von Stärke in den Blättern am Ende der Nacht (EN), und die Stärke-Akkumulation in den kontrollpflanzen (die 0,05 % DMSO erhalten) Stand im Einklang mit der Literatur 41 , 42. Darüber hinaus präsentiert Pflanzen mit AZD-8055 behandelt eine größere Menge der verbleibenden Stärke im Vergleich zu der Kontrolle Sämlinge EN. Diese Ergebnisse zeigten die Nützlichkeit des vorgeschlagenen hydroponischen Systems in wachsende Sämlinge imitiert physiologische Bedingungen. Dieses System ermöglichte auch die Bestätigung der Stärke überschüssige Phänotyp typisch für eine Unterdrückung der TOR komplexe Bauteile24,28,31.
Stärkegehalt war auch genau gemessen mit einer sensiblen Methodik, zeigen, dass die AZD-8055-Behandlung zu Sämlinge mit einem deutlich höheren Gehalt an Stärke am Ende des Tages (ED) geführt und EN im Vergleich zur Kontrolle DMSO behandelt Pflanzen (Abbildung 4). Stärke in den Blättern sammelt sich während des Tages und wird über Nacht reaktiviert, um metabolische Aktivität, vor allem die Atmung und die fortlaufende Export von Saccharose zu anderen pflanzlichen Organe41,42aufrecht zu erhalten. Unter normalen Bedingungen bleibt nur ein kleiner Bruchteil von Stärke (zwischen 5 % und 10 % des Betrages an die ED) EN43,44,45. Diese Ergebnisse bestätigt, dass die Stärke, die überschüssige Phänotyp unter die TOR-Unterdrückung beobachtet alles über den Diel-Zyklus auftritt.
Hydroponisch angebaute Pflanzen wurden im Vergleich zu Sämlinge angebaut in einem Gartenbau Substrat unter sehr ähnlichen klimatischen Bedingungen bezüglich des Ausdrucks von der Abscisic Säure-responsive Element-bindungsfaktor 3 (ABF3)-Gen (Abbildung 5A ), welche direkt korreliert mit internen ABA Ebenen, eine Klasse von Hormonen, die weithin als eine Markierung wegen seiner Rolle in mehreren abiotischen Stress Antworten46,47,48. Obwohl Sämlinge angebaut in der Hydrokultur-System eine deutliche Steigerung des Niveaus der ABF3präsentiert hat, war die Expression von Asparagin Synthase 1 (ASN1) die DMSO oder AZD Behandlungen (Abb. 5 b) nicht betroffen. Jedoch Trehalose-Phosphat-Synthase 5 (TPS5) wurde nach 8 h TOR Hemmung (Abb. 5 b) deutlich erhöht. ASN1 und TPS5 reagieren auf niedrigen und hohen Zucker Ebenen49,50,51,52,53,54, beziehungsweise, was darauf hindeutet dass diese Pflanzen nicht energisch Stress erlebten.

Abbildung 1 : Workflow für die Montage der Hydrokulturen-Systems. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Wirkung der TOR-Hemmung auf den RPS6 Phosphorylierung in verschiedenen Geweben von Arabidopsis thaliana . Immunoblotting zeigt die Fülle der Gesamt- und phosphorylierten RPS6 im Stamm (A) und (B) schießen Extrakte der Keimlinge mit 2 µM AZD-8055 oder 0,05 % DMSO (Kontrolle) behandelt. Werte repräsentieren die Verhältnisse durch das Protein nicht phosphoryliert RPS6 normiert. Anti-Aktin-Antikörper diente als ein Steuerelement laden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Arabidopsis thaliana Sämlinge mit Lugol Reagenz befleckt. Behandlungen mit 2 µM AZD-8055 oder 0,05 % DMSO (Kontrolle) waren in der EN (roter Pfeil) aufgetragen und verglichen, um Sämlinge (keine-Behandlung) zu verspotten. Sämlinge wurden vor der Behandlung Anwendung (0 h) geerntet und um 12 h (ED) und 24 h (EN) nach der Behandlung durch Schwarze Pfeile angedeutet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 : Wirkung der TOR-Hemmung auf den Stärkegehalt der Arabidopsis thaliana Sämlinge. Stärke enzymatisch vor (0 h) gemessen wurde und um 12 h (ED) oder 24 h (EN) nach der Behandlung mit 2 µM AZD-8055 (schwarz) oder 0,05 % DMSO (Control, weiß). Die angezeigten Werte sind der Mittelwert ± Standardfehler (SE) (n = 4). Signifikante Unterschiede zwischen Sämlinge behandelt mit AZD-8055 und DMSO, mit Student t-test, sind mit Sternchen gekennzeichnet: * (P < 0,05) und *** (P < 0,001). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5 : Ausdruck Ebene der betonen-in Verbindung stehende Gene. (A) Vergleich von ABF3 Abschriften in Hydrokultur und Substrat gewachsen Arabidopsis Col-0 Sämlinge. (B) Vergleich der ASN1 und TPS5 Transkripte in Arabidopsis Sämlinge behandelt mit 2 µM AZD-8055 und 0,05 % DMSO. Die normalisierte Ausdruck Niveaus werden als 2^(-dCt) angezeigt. Die angezeigten Werte sind der Mittelwert ± SE (n = 3). Signifikante Unterschiede mit der Student t-test, sind mit Sternchen gekennzeichnet: *** (P < 0,001). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Zusätzliche Abbildung 1:dieses in-vitro- Hydrokultur-System ermöglicht es, Keimung zu synchronisieren und zu homogenen Sämlinge erhalten. Samen von A. Thaliana (C3) und S. Viridis (C4) wurden direkt in dieses System gekeimt. (A und C) waren die Sämlinge homogen in Bezug auf die Entwicklungsstufe und die Behandlung nach 11d (Arabidopsis) oder 7D (Setaria) angewendet wurde. (B und D) wachsen die Wurzeln direkt in Richtung der Nährlösung, die Zugabe von verschiedenen Substanzen und deren Absorption zu erleichtern. Diese Ergebnisse zeigen nachdrücklich, dass dieses System ein optimales Umfeld für das Pflanzenwachstum bietet und verwendet werden, kann um effizient eine Vielzahl von Tests durchführen. Darüber hinaus ist dieser Hydrokultur-System sehr nützlich für umfangreiche Experimente.
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Eine einfache, vielseitige und preisgünstige in-vitro- Hydrokultur-System wurde erfolgreich optimiert und ermöglichen umfangreiche Experimente unter sterilen Bedingungen. Dieses System erleichtert die Anwendung von Chemikalien in einer Lösung und deren effiziente Absorption von Wurzeln für molekularen, biochemischen und physiologischen Studien.
Diese Arbeit wurde unterstützt von der Forschungsgemeinschaft von São Paulo (FAPESP; Gewähren Sie 12/19561-0) und der Max-Planck-Gesellschaft. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 14-3/10407), Valéria Mafra (FAPESP; Grant 14/07918-6), und Viviane C. H. da Silva (CAPES/CNPEM 24/2013) sind dankbar für die Stipendien. Die Autoren danken für die großzügige Bereitstellung von Antikörpern gegen RPS6 Christian Meyer vom Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, Frankreich). Die Autoren danken RTV UNICAMP und Ed Paulo Aparecido de Souza Manoel für ihre technische Unterstützung während der Audio aufzeichnen.
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Natriumhypochloritlösung | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Polysorbat 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Murashige und Skoog (MS) Medium einschließlich Vitamine | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| 2-(N-morpholino)ethansulfonsäure (MES)-Monohydrat | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7921 | |
| Kaliumhydroxid | Sigma-Aldrich | 484016 | |
| Laminar-Flow-Haube | Telstar | BH-100 | |
| Heizplatte | AREC | F20510011 | |
| Wachstumskammer | Weiss Technik | HGC 1514 | |
| Glas Petrischale (150 mm x 25 mm) | Uniglas | 189.006 | |
| 200 & My; L Pipettenspitzen-Racks | Kasvi | K8-200-5 * | |
| 300 μ L Mehrkanalpipette | Eppendorf | 3122000060 | |
| 300 μ L Pipettenspitzen | Eppendorf | 30073088 | |
| 200 μ L Pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| 200 μ L Pipettenspitzen | Eppendorf | 30000870 | |
| Schere | Tramontina | 25912/108 | |
| Pinzette | ABC Instrumentos | 702915 | |
| Skalpellklinge | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Transparentes Klebeband (45mm x 50m) | Scotch 3M | 5803 | |
| Einwegboxen aus Kunststoff, Außenmaße: 353 mm (L)x 178 mm (B) x 121mm ( H) | Maxipac | 32771 |