Ein neuartiger Sättigung Mutagenese Ansatz: Einzelschritt Charakterisierung der regulatorischen Protein Bindungsstellen im RNA mit Phosphorthioate

Zusammenfassung

Proteine, die bestimmte RNA-Sequenzen binden spielen wichtige Rollen in der Genexpression. Ausführliche Charakterisierung von diese Bindungsstellen ist entscheidend für unser Verständnis der Genregulation. Hier wird ein Einzelschritt-Ansatz für Sättigung Mutagenese der Protein-Bindungsstellen in der RNS beschrieben. Dieser Ansatz ist relevant für alle Protein-Bindungsstellen in der RNS.

Zusammenfassung

Genregulation spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung. Zahlreiche DNA und RNA-bindende Proteine binden ihre Ziel-Sequenzen mit hoher Spezifität zur Genexpression kontrollieren. Diese regulatorischen Proteinen Steuern Genexpression auf der Ebene der DNA (Transkription) oder auf der Ebene der RNA (Pre-mRNA Spleißen, Polyadenylation mRNA Transport, Verfall und Übersetzung). Identifizierung von regulatorischen Sequenzen hilft zu verstehen, nicht nur wie ein Gen ein- oder ausgeschaltet ist, sondern auch welche nachgeschalteten Gene durch ein bestimmtes regulatorischen Protein reguliert werden. Hier beschreiben wir einen One-Step-Ansatz, der Sättigung Mutagenese von einem Protein-Bindungsstelle in RNA ermöglicht. Es geht um doping DNA Schablone mit Wildtyp-Nukleotide in die Bindungsstelle, Synthese von separaten RNAs mit jeder Phosphorothioat Nukleotid und Isolierung von der gebundenen Anteil nach Inkubation mit Protein. Störungen durch Wildtyp-Nukleotiden führt zu ihren bevorzugten Ausschluss aus der Fraktion proteingebundener. Dies wird durch Gelelektrophorese nach selektiven chemischen Spaltung mit Jod Phosphodiester-Anleihen mit phosphorthioate (Phosphorothioat Mutagenese oder PTM) überwacht. Dieser einstufigen Sättigung Mutagenese Ansatz ist anwendbar auf die Charakterisierung der Protein-Bindungsstelle in RNA.

Einleitung

Genregulation spielt eine wichtige Rolle in der Biologie. Gene reguliert werden können, auf der Ebene der Transkription, Pre-mRNA Spleißen, 3' Ende Bildung, RNA-Export, Übersetzung, mRNA Lokalisierung, Verfall, Post-translationale Modifikation/Stabilität, etc. , die beide DNA und RNA-bindende Proteine Schlüsselrollen in gen spielen Verordnung. Während Molekulare genetische Analysen zahlreiche regulatorische Proteine identifiziert haben, nur eine kleine Teilmenge davon wurden charakterisiert voll und ganz für ihre Zellfunktionen oder verbindliche Sites in Vivo. Phylogenetische Sequenzanalyse und Mutagenese bieten sich ergänzende Ansätze zur Charakterisierung von DNA oder RNA-Protein-Interaktionen.

RNA-bindende Proteine sind wichtig für Entwicklungsprozesse, einschließlich der sexuellen Differenzierung. Der Drosophila -Protein Sex-lethal (SXL) oder die Geschlecht-Hauptschalter Protein fehlt in Männchen, sondern Gegenwart bei Frauen. Es erkennt Uridin-reichen Sequenzen oder Pyrimidine-Traktate neben spezifischen Spleißstellen in nachgeschalteten Pre-mRNA-Ziele (Transformator, Sex-tödlicheund männlich-spezifische lethal2) in somatischen Zellen^{1,2 ,3,4}. Darüber hinaus regelt es polyadenylierungsstelle Wechsel durch die Bindung an Uridin-reiche Polyadenylation Enhancer Sequenzen in die Verstärker der rudimentären (e(r)) Transkript^5,6. SXL wahrscheinlich regelt zusätzliche Ziele in der weiblichen Keimbahn, die noch werden identifiziert,^{1,7,8,9,10,11, 12 , 13}.

Charakterisierung von einer Bindungsstelle umfasst Mutagenese, in der Regel, z. B. durch Löschung oder Ersatz von einzelnen oder mehreren Nukleotiden. Jede mutierte Bindungsstelle gegenüber dem Wildtyp RNA-Sequenz wird dann analysiert, mit einer Reihe von proteinkonzentrationen seine Bindungsaffinität zu bestimmen (K_d oder Gleichgewicht Dissoziation Konstante) für das Protein des Interesses; K-_d ist die Konzentration des Proteins erforderlich um 50 % RNA-bindende zu erhalten. Dieser arbeitsintensive Prozess detaillierte Mutagenese beinhaltet, Erzeugung und Analyse von zahlreichen Mutanten – drei Wild-Typ Nukleotiden für jede Position in die Bindungsstelle. So gibt es eine Notwendigkeit für einen alternativen Ansatz für schnellere, einfachere und preiswerte Sättigung Mutagenese der Protein-Bindungsstellen in der RNS.

Hier beschreiben wir einen One-Step-Ansatz, der Sättigung Mutagenese von einem Protein-Bindungsstelle in RNA ermöglicht. Es geht um doping DNA Schablone mit Wildtyp-Nukleotide in die Bindungsstelle, Synthese von separaten RNAs mit jeder Phosphorothioat Nukleotid und Isolierung von der gebundenen Anteil nach Inkubation mit Protein. Störungen durch Wildtyp-Nukleotiden führt zu ihren bevorzugten Ausschluss aus der Fraktion proteingebundener. Dies wird durch Gelelektrophorese nach selektiven chemischen Spaltung mit Jod Phosphodiester-Anleihen mit phosphorthioate (Phosphorothioat Mutagenese oder PTM) überwacht. Dieser einstufigen Sättigung Mutagenese Ansatz ist anwendbar auf die Charakterisierung der Protein-Bindungsstelle in RNA.

Protokoll

Hinweis: Abbildung 1 gibt einen Überblick über Phosphorothioat Mutagenese und fasst die wichtigsten Schritte im Prozess.

1. Generation aus einer Bibliothek von Mutanten-Doping DNA Schablone mit Wild-Typ Nukleotide

1. Synthetisieren T7 Primer (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3 ") durch chemische Synthese auf einem DNA-Synthesizer.
2. Durch chemische Synthese auf einem DNA-Synthesizer, die Protein-Bindungsstelle entspricht einem dotierten Oligonukleotid (komplementäre Strang) zu synthetisieren. Verwenden Sie eine geeignete Mischung von Phosphoramidites bei der chemischen Synthese für jeden Standort von doping (X unten) mit einem Verhältnis von 90 % A als der Wildtyp Nukleotid und 10 % T als Wild-Typ Nukleotid (siehe repräsentative Ergebnisse für weitere Einzelheiten über dieses Verhältnis).
   Hinweis: Hier ist die Reihenfolge des dotierten Oligonukleotids 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 ". Die unterstrichene Sequenz ist die umgekehrte Ergänzung SXL-Protein-Bindungsstelle, plus zusätzliche Nukleotide außerhalb der Bindungsstelle, die bieten nützliche Kontrollen bestätigt wird, dass nicht jede Änderung in der RNA wirkt sich verbindlich, als laden-Steuerungen für Vergleich und Normalisierung der Nukleotide in die Bindungsstelle. Die SXL-Bindung Seite Reihenfolge UUUUUGUUGUUUUUUUU, die im Transformator Pre-mRNA^14,15,16,17vorhanden ist, wurde verwendet, um die vorgeschlagene Methodik zu entwickeln. Die Reihenfolge in Kursivschrift ist komplementär zu der T7 Primer Sequenz und ist der T7-Promotor für in-vitro- Transkription.

2. Synthese von RNA

1. RNA in einer 20 µL Transkription Reaktion, wie zuvor beschrieben¹⁸zu synthetisieren.
   1. Mix-T7 Transkription Puffer und 1 µM T7 Oligonukleotid, 1 µM dotierten Oligonukleotid, 10 mM Dithiothreitol (DTT), 2 mM GTP, 1 mM ATP, CTP, und UTP (Adenosin, Guanosin, Cytidin und Uridin Triphosphat) und 2 U/µL T7 RNA-Polymerase.
   2. Fügen Sie in zwei separaten Mikrozentrifugenröhrchen 0,167 mM α-Thio ATP oder 0,05 mM α-Thio UTP, RNAs phosphorthioate (siehe Schaltpläne in Abbildung 2) einzubringen.
      Hinweis: Für alternative Protokolle fügen Sie 0,2 mM α-Thio CTP oder 0,2 mM α-Thio GTP zu einer entsprechenden Transkription Reaktion mit einer dotierten Oligonukleotid um die beiden verbleibenden Nukleotid Substitutionen zu testen hinzu.
   3. Inkubieren Sie die RNA-Synthese Reaktionsgemisch für 2 h bei 37 ° c
2. Die RNA-Probe 2,5 µL Hitze-labile alkalische Phosphatase und 2,5 µL 10xphosphatase-Puffer hinzufügen. Inkubieren Sie diese 25 µL Reaktion für 10-30 min bei 37 ° C, 5' Phosphate zu entfernen.
3. Inaktivieren Sie das Enzym alkalische Phosphatase durch Erhitzen auf 80 ° C für 2 – 5 min.
4. Radiomarkierung 5'-Ende der rezeptorsignals RNA (5 Pmole) mit 1 µL T4-Polynukleotid-Kinase und 1 µL γ -³²P ATP in eine 10 µL Reaktionsvolumen. Inkubieren Sie die Reaktion Mischung für 30 – 60 min bei 37 ° c
5. Deaktivieren Sie das T4 Polynukleotid Kinase Enzym durch Erhitzen bei 65 ° C für 20-30 min.
6. Gel reinigen die RNA durch Elektrophorese in einer 10 % denaturierenden Polyacrylamid-Gel. Suchen Sie RNA auf das Gel durch Autoradiographie. Verbrauchsteuern die Gel-Scheibe mit radioaktiven RNA, Zerkleinern in einem Microcentrifuge Schlauch durch Drücken gegen die Wände mit einer Pipettenspitze und Proteinase K (PK) Puffer (100 mM Tris, pH 7.5, 12,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 % Sodium Dodecyl Sulfat) einziehen. Drehen Sie das Rohr bei Raumtemperatur von 2 h über Nacht.
7. Zentrifugieren Sie die Gel-Gülle, entsorgen Sie das Gel und Sammeln der Pufferlösung.
8. Die Lösung zweimal in gleicher Lautstärke von Phenol-Chloroform und einmal mit Chloroform extrahiert und die wässrige Phase zu sammeln.
9. Hinzufügen der wässrigen Phase 0,1 Volumen von 3M Natriumacetat, pH 5,2, Träger tRNA oder Glykogen und 2,5 Volumen Ethanol. Halten Sie die Probe bei-80 ° C für 1 h.
10. Zentrifugieren Sie die Probe für 5 – 10 min in ein high-Speed-Microcentrifuge 16.873 x g. Entfernen Sie die Puffer/Ethanol-Lösung ohne störende RNA Pellet vorsichtig.
11. Waschen Sie die Pellets mit 70 % Ethanol und Zentrifugieren für 2 – 5 min. entfernen Ethanol sorgfältig. Das Pellet in Luft zu trocknen.
12. Das Pellet in 20 – 50 µL Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) aufzuwirbeln-behandeltem Wasser. Bei-20 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
    Hinweis: Führen Sie alle Schritte mit radioaktiven RNA mit entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen und Plexiglas Schild zum Schutz vor Radioaktivität. Derzeit sind Spin Spalten häufig verwendeten und bequemer zu entfernen nicht inkorporierten Radioaktivität, als Alternative zu Gel-Reinigung von RNA.

3. Verbindliche Reaktion und Trennung von gebundenen RNA protein

1. Das rekombinante Protein in Express und Reinigen von E. Coli.
2. Rekombinantes Protein-Konzentration durch Spektralphotometrie oder durch die Trennung in einem SDS-Polyacrylamid-Gel neben einem bekannten Protein standard, bovine Serum-Albumin (BSA) zu schätzen. Visualisieren Sie das Protein des Interesses und der BSA standard durch die Färbung des Gels mit Coomassie Brilliant Blue R-250. Das Protein im Vergleich zu bekannten Größen der BSA Verdünnungen auf dem gleichen Gel quantitate.
   Hinweis: Bewahren Sie rekombinantes Protein bei - 80 ° C bis zur Verwendung und verdünnt in 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazin-1-Ethanesulfonic Säure (HEPES), pH 8.0, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 0,2 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), 0,05 % NP-40, 20 % Glycerin. Verwendung von 0,5-1,0 mM Protease-Inhibitor Phenylmethane Sulfonyl Fluorid (PMSF) ist optional.
3. Führen Sie RNA-bindende Reaktion (20 – 100 µL) in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0,5 Einheiten/µL RNase-Inhibitor, 0,09 µg/µL acetyliert Rinderserumalbumin, 1 mM EDTA, 0,15 µg/µL tRNA, 5'-Ende radioaktiv RNA und 6 µL (eine entsprechende Konzentration Konzentration auf die ~ 50 % der RNA an Protein bindet) des Proteins.
   Hinweis: Dieser Bindung Puffer arbeitet für drei RNA-bindende Proteine (SXL, U2AF⁶⁵, und PTB), aber für ein Protein des Interesses standardisiert werden muss. Schätzen die Proteinkonzentration empirisch mit verschiedenen Verdünnungen für ein gegebenes Protein-Vorbereitung, die erforderlich ist, um ca. 50 % erzielen RNA-bindende. Dieser Zustand oder K_d stellt den empfindlichsten Teil der RNA-bindende Kurve.
4. Inkubieren Sie Protein verbindliche Reaktion für 20-30 min bei 25 ° C (oder auf Eis).
5. Der ungebundene Anteil mit einer der beiden Ansätze trennen Sie den proteingebundenen RNA Bruch:
   1. Nitrozellulose Filtern Bindung
      1. Auftragen Sie die verbindliche Reaktion (20 – 100 µL) auf einen Nitrozellulose-Filter angeschlossen, vielfältige Vakuum bei Raumtemperatur.
         Hinweis: Nur der RNS-Protein-Komplex wird auf dem Filter beibehalten und ungebunden RNA fließt durch den Filter. Die verbindliche Perspektiven Filter ermöglicht höhere Wiederherstellung der gebundenen RNA und ist schneller und einfacher, im Vergleich zu Gel Mobilität Verschiebung Assay. Durch die Platzierung einer DEAE Membran unterhalb der Nitrozellulose-Filter ist es auch möglich, sammeln den ungebundenen RNA-Bruch oder freie RNA zum Vergleich mit dem gebundenen Bruch.
      2. Schneiden Sie den Teil der Nitrozellulose-Filter, enthält die einbehaltenen radioaktiven RNA in kleinere Stücke zu einem Microcentrifuge Schlauch passt in ausreichend PK Puffer (300 – 500 µL mit 10 – 20 µg (PK), die Filter-Stücke einzutauchen einweichen und eluieren RNA aus dem filter für 2 – 3 h oder über Nacht.
      3. Mit Phenol-Chloroform, Chloroform, extrahieren und wässrigen Phase zu sammeln. Hinzufügen von Natriumacetat und Ethanol und, nach der Inkubation in Gefrierschrank, Zentrifugieren, waschen, Trocknen und RNA in DEPC-behandeltem Wasser aufschwemmen. Gehen Sie folgendermaßen vor wie in Schritten 2.10, 2.14 oben beschrieben.
   2. Gel-Mobilität-Verschiebung
      1. Vorbereiten und polymerisieren eine 5 % native Polyacrylamid-Gel (60:1 Acrylamide:bis-Acrylamid) in 0,5 X TBE (standard Tris-Borat-EDTA Puffer) vor Beginn der verbindliche Reaktion, als Alternative zur Bindung Filtermethode.
      2. Pre-führen Sie das Gel für 15 min bei 250 V in einem kalten Zimmer (4 ° C).
      3. Laden Sie jede verbindliche Reaktion (siehe oben) in separaten Brunnen von oben vor dem Rechenlauf Gel.
         Hinweis: Der Protein-Speicher-Puffer bietet ausreichend Glycerin für probenbeladung in Vertiefungen.
      4. Trennen Sie die Protein-gebundenen RNA durch Gelelektrophorese in einem kalten Raum bei 250 V für 1 bis 2 h, je nach Größe der RNA und spezifisches Protein.
      5. Platzieren Sie die RNS-Protein-Komplex auf dem Gel durch Autoradiographie. Verbrauchsteuern Sie die Gel-Scheibe mit der RNS-Protein-Komplex. Eluieren Sie die RNA von der Gel-Scheibe durch Zerkleinerung des Gel-Slices und Einweichen in der PK-Puffer.
      6. Mit Phenol-Chloroform, Chloroform, extrahieren und wässrigen Phase zu sammeln. Hinzufügen von Natriumacetat und Ethanol nach der Inkubation in Gefrierschrank, Zentrifugieren, waschen, Lufttrocknen, und RNA in DEPC-behandeltem Wasser aufschwemmen. Gehen Sie folgendermaßen vor wie in Schritten 2.10, 2.14 oben beschrieben.

4. Analyse der Jod gespalten Phosphorothioat Produkte für die Erkennung von mutierten Nukleotid-Positionen

1. Fügen Sie 1 mM Jod in einer 20 µL DEPC-behandeltem Wasser mit bis zu 10 µg Träger tRNA, RNAs (gefesselt und total RNAs) an den Standorten der Phosphorothioat Gründung zu Spalten. In 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   Hinweis: Weitere Informationen über Jod Spaltung mit leicht unterschiedlichen Bedingungen — 7 % (V/V) Iodoethanol, Heizung bei 95 ° C für 3 min — Gish & Eckstein 1988¹⁹entnehmen.
2. Niederschlag abgespalten RNA durch Zugabe von Natrium Acetat/Ethanol, wie oben beschrieben. In einem Laden Farbstoff für Denaturierung Gele aufzuwirbeln. Erhitzen Sie und laden Sie die Probe um RNA-Fragmente durch Elektrophorese in einem 15 – 20 % denaturierenden Polyacrylamid-Gel zu trennen.
3. Setzen Sie das Polyacrylamid-Gel auf einem Röntgenfilm.
4. Erkennen Sie Bands in der gebundenen Anteil gegenüber total Pool mit Autoradiographie.
   Hinweis: Führen Sie alle Schritte mit Jod in einer Dunstabzugshaube. Für RNA-Trennung hier gezeigt ist eine keilförmige Gel eingesetzt, das wird erreicht durch eine Verdoppelung der Dicke der beiden Abstandhalter am unteren Rand der Gel-Platten durch das Einfügen einer extra langen Abstandshalter an der Unterseite des Gels. Diese Form ermöglicht mehr einheitliche oder engeren Abstand zwischen kürzeren RNA-Fragmente. Alternativ kann ein Phosphorimager anstatt Röntgenfilme für die Erkennung und Quantifizierung von Radioaktivität verwendet werden.

Ergebnisse

Das Prinzip der Sättigung Mutagenese mit doping:

Verwenden Sie für eine entsprechende Molverhältnis von Wildtyp und andere Nukleotide eine gleiche Mischung von allen vier Nukleotide, wenn nur eine Position soll analysiert werden. Jedoch, wenn mehrere Positionen gleichzeitig analysiert werden, das Verhältnis zwischen wilden Typ Wildtyp Nukleotide muss angepasst werden, d. h. reduziert. Ansonsten neben einzelnen Ersetzungen,...

Diskussion

Mutagenese ist lang verwendet, um Protein-Bindungsstellen zu charakterisieren. Erstens kann eine Reihe von Mutanten konstruiert und einzeln getestet in verbindlichen Assays, ihre Auswirkungen auf verbindliche Affinität zu analysieren. Während ein standard Mutagenese-Ansatz bietet eine Möglichkeit, mehrere Sequenzen zu analysieren, mehrere Schritte der Standardansatz, wie Mutanten Bau und Durchführung einer Reihe verbindlicher Reaktionen für jeden Mutant beteiligt, ist mühsam und zeitaufwendig und kann nicht Sättigung Mut...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Uridin 5' a-thiotriphosphat	NEN (Boston, Massachusetts)	NLP-017
Adenosin 5' a-thiotriphosphat	NEN (Boston, Massachusetts)	NLP-016
Vakuumverteiler	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore  25  mm Glas Mikroanalytik Vakuum Filter
Vakuum Verteiler	Millipore	XX2702552	1225 Probenahme Vakuum Verteiler
Nitrocellulose	Millipore	HAWP
Nitrocellulose	Schleicher & Schuell	PROTRAN
Dephosphorlyation Kit	NEB	M0508
T4 Polynukleotidkinase	NEB	M0201S
Proteinase K	NEB	P8107S
T7 RNA Polymerase	NEB	M0251S
RNasin	Promega		RNase Inhibitor
Glasplatten	Standard	Standard
Gelelektrophorese-Geräte	Standard	Standard Röntgenfilme
	Standard	Standard Polyacrylamid
Gellösungen	Standard	Standard Standard