Ein neuartiger Sättigung Mutagenese Ansatz: Einzelschritt Charakterisierung der regulatorischen Protein Bindungsstellen im RNA mit Phosphorthioate

Das übergeordnete Ziel dieses Phosphorthioat-Ansatzes in RNA ist es, die Sättigungsmutagenese in einem einzigen Schritt durchzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Molekularbiologie zu beantworten, wie zum Beispiel die Genregulation. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass in einem einzigen Schritt die Sättigungsmutagenese einer Proteinbindungsstelle in RNA erreicht werden kann.

Ein wichtiger Schritt in diesem einstufigen Sättigungsmutageneseprotokoll besteht darin, das DNA-Template mit Nicht-Wildtyp-Nukleotiden innerhalb der Proteinbindungsstelle zu dotieren. Synthetisieren Sie zunächst einen T7-Primer durch chemische Synthese auf einem DNA-Synthesizer. Als nächstes synthetisieren wir ein dotiertes Oligonukleotid, das der Proteinbindungsstelle entspricht.

In diesem Beispiel enthält die unterstrichene Sequenz das umgekehrte Komplement der Bindungsstelle des geschlechtsletalen Proteins von Drosophilas, wobei jede Dopingstelle durch ein X dargestellt wird.Für jede Dotierungsstelle ist ein Verhältnis von 90 % Wildtyp-Nukleotid zu 10 % Nicht-Wildtyp-Nukleotid zu verwenden. Die grün markierte Sequenz ist komplementär zur T7-Primersequenz und ist der T7-Promotor für die in vitro Transkription. Der nächste Schritt in diesem Protokoll ist die Synthese separater RNAs mit jedem Phosphorothioat-Nukleotid, gefolgt von der 5-Prime-End-Radiomarkierung der RNA.

Synthetisieren Sie RNAs für jedes Phosphorthioat in einer 20-Mikroliter-Transkriptionsreaktion. Zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen fügen Sie Folgendes hinzu: T7-Transkriptionspuffer, ein mikromolares T7-Oligonukleotid, ein mikromolares dotiertes Oligonukleotid, 10 millimolare DTT, zwei millimolare GTP, je ein Millimolar ATP, CTP und UTP und zwei Einheiten T7-RNA-Polymerase pro Mikroliter. Geben Sie 0,167 Millimolar Alpha-Thio ATP in ein Röhrchen und 0,05 Millimolar Alpha-Thio UTP in das andere Röhrchen.

Inkubieren Sie die Reaktionsgemische der RNA-Synthese zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nach zwei Stunden fügen Sie jeder RNA-Probe 2,5 Mikroliter hitzelabile Alpha-Phosphatase und 2,5 Mikroliter 10-fachen Phosphatase-Puffer hinzu. Inkubieren Sie 10 bis 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um 5-Prime-Phosphate zu entfernen.

Inaktivieren Sie das alkalische Phosphatase-Enzym, indem Sie es zwei bis fünf Minuten lang auf 80 Grad Celsius erhitzen. Die übrigen Schritte beinhalten die Verwendung von Radioaktivität und müssen unter Verwendung geeigneter Vorsichtsmaßnahmen und einer Plexiglasabschirmung zum Schutz vor Radioaktivität durchgeführt werden. Um das 5-Prime-Ende der dephosphorylierten RNA zu radioaktiv markieren, verwenden Sie einen Mikroliter T4-Polynukleotidkinase und einen Mikroliter Gamma P32 ATP in einem Reaktionsvolumen von 10 Mikrolitern.

Inkubieren Sie die Reaktionsmischungen bei 37 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten. Inaktivieren Sie das T4-Polynukleotidkinase-Enzym, indem Sie es 20 bis 30 Minuten lang auf 65 Grad Celsius erhitzen. Führen Sie die Reaktionen in einem 10%igen denaturierenden Polyacrylamid-Gel durch.

Lokalisieren Sie die RNA auf dem Gel durch Autoradiographie und entfernen Sie die Gelscheibe mit radioaktiv markierter RNA. Zerkleinern Sie die Gelscheibe in einem Mikrozentrifugenröhrchen, indem Sie sie mit einer Pipettenspitze gegen die Seite drücken, und fügen Sie dann Proteinase-K-Puffer hinzu. Drehen Sie die Röhren bei Raumtemperatur von zwei Stunden bis über Nacht.

Zentrifugieren Sie anschließend die Gelaufschlämmung, sammeln Sie die Pufferlösung und verwerfen Sie das Gel. Jede Lösung wird zweimal mit dem gleichen Volumen Phenolchloroform extrahiert. Extrahieren Sie danach die Lösung einmal mit Chloroform.

Sammeln Sie die wässrige Phase und fügen Sie ihr 0,1 Volumen dreimolaren Natriumacetats mit einem pH-Wert von 5,2, Träger-tRNA oder Glykogen und 2,5 Volumen Ethanol hinzu. Bewahren Sie die Proben eine Stunde lang bei minus 80 Grad Celsius auf. Zentrifugieren Sie die Proben in einer Hochgeschwindigkeits-Mikrozentrifuge bei 16.873 g für fünf bis 10 Minuten.

Entfernen Sie die Puffer-Ethanol-Lösung vorsichtig, ohne das RNA-Pellet zu stören. Waschen Sie die Pellets mit 70% Ethanol und zentrifugieren Sie sie zwei bis fünf Minuten lang. Entfernen Sie vorsichtig das Ethanol und trocknen Sie die Pellets an der Luft.

Suspendieren Sie jedes Pellet in 20 bis 50 Mikrolitern DEPC-behandeltem Wasser. Bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius lagern. Das Konzept der Partitionierung aufgrund von Interferenzen wird hier veranschaulicht.

Während des Prozesses der Proteinbindung teilen sich RNA-Moleküle zwischen der proteingebundenen und der ungebundenen Fraktion auf. Wenn ein spezifisches Nukleotid an einer bestimmten Position die Proteinbindung stört, wird es bevorzugt aus der proteingebundenen Fraktion ausgeschlossen. Anschließend wird Jod verwendet, um die RNAs an den Stellen des Phosphorthioateinbaus zu spalten.

Um diese Verfahren zu beginnen, richten Sie die Protein-RNA-Bindungsreaktionen ein, wobei jede Reaktion 10 millimolare Tris-HCl, ein millimolares DTT, 50 millimolare Kaliumchlorid, 0,5 Einheiten pro Mikroliter RNase-Inhibitor, 0,09 Mikrogramm pro Mikroliter acetyliertes Rinderserumalbumin, ein millimolares EDTA, 0,15 Mikrogramm pro Mikroliter tRNA, 5-Prime-End-radioaktiv markierte RNA und sechs Mikroliter einer geeigneten Konzentration des Proteins enthält. Inkubieren Sie die Proteinbindungsreaktionen bei 25 Grad Celsius für 20 bis 30 Minuten. Trennen Sie die proteingebundene RNA-Fraktion von der ungebundenen Fraktion durch Nitrozellulose-Filterbindung.

Wenden Sie die Bindungsreaktion auf einen Nitrozellulosefilter an, der mit einem Vakuumverteiler bei Raumtemperatur verbunden ist. Nur der RNA-Proteinkomplex wird auf dem Filter zurückgehalten, während die ungebundene RNA durch den Filter fließt. Schneiden Sie den Teil des Nitrozellulosefilters, der die zurückgehaltene radioaktive RNA enthält, in kleinere Stücke, die in ein Mikrozentrifugenröhrchen passen, und fügen Sie ausreichend Proteinase-K-Puffer hinzu, um die Filterstücke einzutauchen.

Eluieren Sie die RNA aus den Filterstücken für zwei bis drei Stunden oder über Nacht. Übertragen Sie dann die Lösung aus jedem Röhrchen in ein neues Röhrchen und extrahieren Sie es mit Phenolchloroform und Chloroform, wie zuvor gezeigt. Die wässrige Phase wird aufgefangen und 0,1 Volumenprozent dreimolares Natriumacetat, pH 5,2 und 2,5 Volumenvolk Ethanol hinzugefügt und im Gefrierschrank inkubiert.

Nachdem Sie die RNA wie zuvor gezeigt zentrifugiert, gewaschen und getrocknet haben, resuspendieren Sie die RNA in DEPC-behandeltem Wasser. Alle Schritte, die mit Jod zu tun haben, müssen in einer Abzugshaube durchgeführt werden. Um RNAs an den Stellen des Phosphorthioat-Einbaus zu spalten, wird jeder RNA-Probe ein Millimolar Jod in 20 Mikrolitern DEPC-behandeltem Wasser zugesetzt, das bis zu 10 Mikrogramm Träger-tRNA enthält.

Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Fältitieren Sie gespaltene RNA durch Zugabe von Natriumacetat und Ethanol, wie zuvor gezeigt. Resuspendieren Sie gespaltene RNA in einem Ladefarbstoff zur Denaturierung von Gelen.

Nach dem Erhitzen werden die Proben in ein 15-20%iges denaturierendes Polyacrylamid-Gel geladen und die RNA-Fragmente durch Elektrophorese getrennt. Setzen Sie das Polyacrylamid-Gel einem Röntgenfilm aus und erkennen Sie Banden in der gebundenen Fraktion im Vergleich zum Gesamtpool mittels Autoradiographie. Dieses Schema veranschaulicht das Konzept der Partitionierung aufgrund von Interferenzen.

In Spur T, der gesamten RNA-Fraktion, ist die Bandenintensität für alle dotierten Positionen ungefähr gleich. In der proteingebundenen RNA-Fraktion an den Positionen 1, 4 und 7 hat das Nukleotid keinen Einfluss auf die Bindung. An den Positionen 3 und 6 stört es jedoch die Bindung und wird aus der gebundenen Fraktion ausgeschlossen.

An Position 5 ist die Interferenz partiell. Vergleiche der gepaarten Lanes für jedes Nukleotid ermöglichen die Analyse aller vier Nukleotide. Dieses Autoradiogramm zeigt zwei Bahnpaare aus einem denaturierenden Gel.

Spur T ist die Gesamt-RNA und Spur B ist proteingebundene RNA. Die vertikale Linie markiert die geschlechtstödliche Bindungsstelle. Für das Alpha-Thio-Alin-Paar sind die Banden 1, 2, 3 und 5 in der Gesamt-RNA-Fraktion vorhanden, aber in der gebundenen RNA-Fraktion nicht vorhanden oder signifikant reduziert.

Für das alpha-Thio-ulin-Paar sind die Banden 7 und 8 in der gebundenen Fraktion relativ weniger intensiv. Reste, die bevorzugt aus der gebundenen Fraktion ausgeschlossen werden, sind wichtig für die Proteinbindung. Sobald die RNA synthetisiert und mit 5 Primzahlen markiert ist, kann diese Technik in 12 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass der angemessene Einbau von Phosphorthioat und die Bestimmung der geeigneten Proteinkonzentration für die Bindung wichtige Überlegungen sind. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie geeignete funktionelle Assays oder in vivo Tests durchgeführt werden, um das Ergebnis des Mutagenese-Ansatzes zu validieren und die biologische Relevanz zu verstehen. Diese Technik bietet eine Alternative zu anderen Methoden, die entweder teurer oder aufwändiger oder beides sind.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Mutantenbibliothek entwirft und synthetisiert, Bindungsreaktionen durchführt, mutierte Nukleotide in jedem Pool identifiziert und die Wirkung von Nicht-Wildtyp-Nukleotiden an jeder getesteten Position quantitativ analysiert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Polyacrylamid und Radioaktivität gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Tragen von Handschuhen, ein ordnungsgemäßer Auspuff und radioaktive Schutzschilde.