Method Article

Die Replica-Set-Methode: Eine Hochdurchsatz-Ansatz zu quantitativ Messen Caenorhabditis Elegans Lebensdauer

DOI:

10.3791/57819

⸱

June 29th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, 2Department of Biostatistics and Computational Biology, University of Rochester Medical Center, 3Non-Clinical Statistics, Bristol-Myers Squibb, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir die Replikatgruppe Methode, Vorgehensweise quantitativ Messen C. Elegans Lebensdauer/überleben und Healthspan in hohem Durchsatz und robuste Art und Weise, so dass Screening von vielen Bedingungen ohne Einbußen bei der Qualität der Daten. Dieses Protokoll beschreibt die Strategie und bietet ein Software-Tool für die Analyse der Replikatgruppe Daten.

Abstract

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Die Replikatgruppe Methode ist ein Ansatz zur Messung quantitativ Lebensdauer oder das Überleben von Nematoden Caenorhabditis Elegans in einer Hochdurchsatz-Weise, so dass eine einzelne Forscher mehr Behandlungen oder Bedingungen über die gleiche Menge an den Bildschirm jederzeit ohne Verlust der Qualität der Daten. Die Methode erfordert eine gemeinsame Ausstattung in den meisten Labors arbeiten mit C. Elegans gefunden und ist somit einfach zu verabschieden. Der Ansatz konzentriert sich auf unabhängige Stichproben einer Grundgesamtheit an jedem Aussichtspunkt, anstatt eine einzelne Probe im Laufe der Zeit als mit herkömmlichen longitudinalen Methoden prüfen. Ritzen mit sich bringt, die Zugabe von Flüssigkeit in die Vertiefungen von Multi-well-Platte, die stimuliert C. Elegans zu bewegen und Quantifizierung Änderungen in Healthspan erleichtert. Andere wichtige Vorteile der Replica Set-Methode enthalten reduzierte Exposition von agarflächen in der Luft Schadstoffe (z.B. Schimmel oder Pilz), minimale Umgang mit Tieren und Robustheit auf sporadische MIS scoring (z. B. ein Tier als Tote gefordert, wenn es noch (lebendig). Um angemessen analysieren und Visualisieren von Daten aus einer Replikatgruppe Stil-Experiment, wurde auch eine benutzerdefinierte Software-Tool entwickelt. Aktuelle Funktionen der Software gehören Plotten von Survival-Kurven für sowohl Replikatsatz und traditionellen (Kaplan-Meier) Experimente, sowie statistische Analysen für Replikatsatz. Die Protokolle, die hier zur Verfügung gestellten beschreiben die traditionelle experimentellen Ansatz und Replica Set-Methode sowie einen Überblick über die entsprechenden Daten-Analyse.

Introduction

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Die transformative technologischen Fortschritt in Richtung zum Verständnis der genetischen Grundlagen des Alterns gehörte die Entwicklung der Fütterung-basierte RNAi in C. Elegans1; vor den experimentellen Einsatz von RNAi waren viele Phänotypen des Alterns nicht genetisch steuerbar. Fütterung-basierte RNAi wird erreicht durch die Produktion von DsRNA in E. Coli , das entspricht einer endogenen C. Elegans mRNA: IPTG induziert bidirektionale Übertragung über einen Einsatz entweder C. Elegans cDNA oder eine Portion ein Öffnen Sie Leserahmen in ein Plasmid-2. Bei C. Elegans intakt nach einziehen E. Coli DsRNA produziert durch Bakterien aus dem Lumen in Darmzellen über die SID-2 transmembranen Protein3transportiert und dann durch den Rest des Tieres über SID-14verteilt. In jeder Zelle exogene DsRNA verarbeitet durch komplexe Dicer SiRNA, die interagieren mit einem Reife mRNA über komplementäre Basenpaarung zum Erstellen eines neuen SiRNA-mRNA Duplex. Diese Maisonette ist anerkannt von der RISC-komplex und gespalten, so erniedrigend die endogenen mRNA-5. So ändern Sie lediglich das Plasmid einfügen, kann man die Funktion der fast jedes Gen in das Genom von C. Elegans inaktivieren. Diese Entdeckung führte zu die Kreation von mehreren großen Fütterung-basierte RNAi Bibliotheken-Sammlungen von E. Coli Aktien umgewandelt, die kombiniert werden können, um die Reichweite von ca. 86 % erzielen bekannt C. Elegans Gene6, 7.

Seit der Weiterentwicklung der Fütterung-basierte RNAi führten umfassende Bildschirme in C. Elegans zur Entdeckung von mehr als 900 Gene, die Lebensdauer bei inaktiviert (ausweislich der RNAi-Phänotyp Verbände kuratiert in WormBase), zu ändern, die wir beziehen um als Gerogenes. Eine Rolle für die Mehrheit der Gerogenes Langlebigkeit Kontrolle durch Fütterung-basierte RNAi in wenigen bahnbrechenden Berichten entdeckt wurde (siehe Abbildung 1A und ergänzende Datei 1 für Details). In einigen Fällen wurden diese Gerogenes festgestellt, basierend auf der Messung der Rentabilität auf ein einzelnes oder wenige Zeitpunkte, die nicht quantifizierbaren Maß für die Veränderung der Lebensdauer RNAi-Behandlung zur Verfügung zu stellen. In anderen Fällen wurden diese Gene für Veränderungen der Lebensdauer sowie zusätzliche altersassoziierter Phänotypen quantitativ bewertet. Beispielsweise haben wir bisher 159 Gene, die für normale und erhöhte Lebensdauer von Tieren mit verringerten Insulin/IGF-1 Signalisierung waren notwendig, und Änderungen in Healthspan quantifiziert. Von diesen führen 103 gen inaktivierungen progeric Phänotyp, wie ein oder mehrere Zeichen der vorzeitigen Alterung8Verlust führte.

Während einige Gerogenes mit 100 oder mehr Studien (z. B. Daf-16, Daf-2, Sir-2.1) in Verbindung gebracht haben, haben mehr als 400 Gerogenes höchstens 10 Zitate (Abbildung 1 bund ergänzende Datei 2). So umfassende Fütterung-basierte RNAi-Bildschirme haben entdeckt und kursorisch gekennzeichnet Hunderte von vermeintlichen Gerogenes, bleiben wie diese Gene funktionieren auf Langlebigkeit Kontrolle, und die genetischen Zusammenhänge zwischen diesen Genprodukte schlecht studierte. Volle Längsschnittanalyse für altersassoziierter Phänotypen ist eine Voraussetzung für genetische Interaktionen zwischen Gerogenes (z.B. epistatic Interaktionen, Asynthetic Interaktionen, etc.) zu identifizieren. Tiefer Einblick in die genetischen Zusammenhänge zwischen Gerogenes, erfordert eine Hochdurchsatz-quantitative Methode, die auch die Vorteile der Fütterung-basierte RNAi nutzt.

Die häufigsten Surrogat-Maßnahme des Alterns ist Lebensdauer. Der traditionelle Ansatz zur Messung von C. Elegans Sterblichkeit verfolgt den Tod einzelner Tiere im Laufe der Zeit innerhalb einer kleinen Stichprobe. Eine relativ kleine Anzahl von Tieren werden im Laufe der Zeit verfolgt und in regelmäßigen Abständen sind sanft stieß mit einem Platindraht oder Wimpern mit Bewegung als Indikator der Lebensfähigkeit (Abbildung 2A). Diese Methode ist weit verbreitet, da es einfache, direkte Messungen die durchschnittliche und die maximale Lebensdauer bietet. Diese traditionelle Methode ist jedoch zeitaufwendig und relativ niedrigen Durchsatz, die begrenzt die Anzahl der Tiere und Bedingungen, die gleichzeitig in einer kontrollierten Weise gemessen werden können. Eine kürzlich durchgeführte Simulationsstudie festgestellt, dass viele C. Elegans Lebensdauer Studien keine genügend große Zahl von Tieren Assay, kleine Änderungen zwischen Bedingungen9zuverlässig erkennen zu können. Darüber hinaus beinhaltet diese traditionelle Methode Umgang mit immer wieder die gleichen Kohorte von Tieren im Laufe der Zeit, die wiederum kann einzuführen, Kontamination, und kann beschädigen oder zunehmend gefährdet, im Alter von Tieren zu töten.

Wir haben eine alternative "Replica Set" Methode zur Messung von C. Elegans Lebensdauer entwickelt. Zu diesem Zweck eine große Population von Alter synchronisiert, isogenen Tiere gliedern sich in eine Reihe von kleinen Populationen (oder Nachbauten). Genügend Replik Proben werden generiert, um jeden Zeitpunkt in das geplante Experiment zu decken. Jedem Zeitpunkt Beobachtung eines der Replikate ist für die Anzahl der lebenden Toten erzielte und zensierte Tiere, dann Tiere innerhalb dieser replizieren werden verworfen. So über die erwartete Lebensdauer der Bevölkerung als Ganzes, eine Reihe von unabhängigen Subpopulationen sind in regelmäßigen Abständen abgetastet (Abb. 2 b). Bei der Verwendung von Replikatsätzen gibt es kein wiederholtes drängen von Tieren und keine wiederholte Exposition gegenüber potentiellen Kontamination der Umwelt. Die Lebensfähigkeit beobachtet an der einmaligen Stelle ist völlig unabhängig von jeder anderen Beobachtung, das minimiert die Handhabung und erhöht den Durchsatz von mindestens eine Größenordnung. Dies hat uns erlaubt, Änderungen in Lebensdauer quantitate für Hunderte von RNAi gleichzeitig8,10 Klone.

Hier präsentieren wir ausführliche Protokolle für die Durchführung von C. Elegans Lebensdauer über die Replikatgruppe und traditionelle Methoden zur Bewertung von C. Elegans Langlebigkeit. Wir zeigen, dass ähnliche Ergebnisse, zwischen den Methoden erzielt werden. Wir haben entwickelten Software, bei der die grafische Auswertung der Daten, Lebensdauer durch beide Ansätze, die wir frei unter einer GPL V3 Lizenz (siehe Tabelle der Materialien) zur Verfügung. "WormLife" ist in R11geschrieben und enthält eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) für das Plotten von Daten, die in Mac OS und Linux getestet wurde. Zu guter Letzt wir vergleichen und kontrastieren die Grenzen der einzelnen Methoden und andere Überlegungen bei der Wahl zwischen Ansätze zur Messung der quantitativen Veränderungen in C. Elegans Lebensdauer zu markieren.

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Protocol

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1. traditionelle Methode für Scoring C. Elegans Langlebigkeit

  1. Vorbereitung der Reagenzien
    1. Identifizieren Sie Gene über Fütterung-basierte RNAi inaktiviert werden. Kaufen Sie transformierten Bestände an HT115 E. Coli2 mit der RNAi-Klon von Interesse. Alternativ subclone die cDNA des Gens von Interesse in die Multicloning Site des Plasmids L4440.
      Hinweis: HT115 ist eine RNase III-defizienten E. Coli -Stamm mit IPTG-induzierbaren T7-Polymerase-Aktivität, die verwendet wird, um Abbau der DsRNA innerhalb der Bakterien zu verhindern. Für Lebensdauer Studien, die nicht füttern-basierte RNAi verwenden, kann entweder HT115 OP50 E. Coli auf NGM standardteller oder gebrauchte.
    2. Bereiten Sie 3 – 6 (oder mehr) 6 cm RNAi Platten pro Testbedingung (ergänzende Datei 3 für Rezept). RNAi-Platten bei 4 ° C vor der Aussaat mit Bakterien für bis zu mehreren Monaten zu speichern.
    3. Wachsen Sie transformierten E. Coli über Nacht (16-20 h, 37 ° C Inkubator bei 180 bis 220 u/min schütteln).
      Hinweis: HT115 E. Coli wächst in LB mit Ampicillin (50 mg/mL). Standard OP50 E. Coli ist nicht Antibiotika-resistente und wird ohne Ampicillin gewachsen. Kulturvolumen richtet sich nach der Anzahl der Platten, aber ist in der Regel zwischen 8 und 100 mL LB, abhängig von den experimentellen Design.
      1. Konzentrieren Sie Bakterien durch Zentrifugation bei 3.000 X g für 15-20 min in einer Zentrifuge Benchtop. Aspirieren überstand und wieder auszusetzen das Pellet 1/10. ab Volumen (z.B. 10 X) in LB mit Ampicillin für HT115 (oder ohne Ampicillin für standard OP50).
      2. Aliquoten 200 µL konzentriert 10 X Bakterien auf jede 6 cm Platte. Bereiten Sie 3 bis 4 Wiederholungen pro Test Zustand, mit 2 zusätzlichen backup Platten, im Falle einer Kontamination verwendet werden. Wenn Sie Platten vorbereiten, beschriften sie, so dass der Experimentator erzielte des Tests mit einem Farbcode oder ähnliche Codierschema blind für die experimentellen Bedingungen ist. Stellen Sie sicher, dass der Code aufgenommen wird.
      3. Lassen Sie offene Platten Trocknen in einer sauberen Umgebung wie z. B. einer Laminar-Flow Bank, bis alle Flüssigkeit aufgesogen worden ist oder überdachte Platten auf der Bank über Nacht trocknen. Monitor-Platten während des Trocknens um sicherzustellen, dass der Agar ohne übermäßige Trocknung trocken ist.
        Hinweis: Über Trocknung der Platten führt zu einer Rissbildung des Nährbodens, der C. Elegans , bohren sich in den Agar veranlaßt. Nass die agaroberflächen auch Graben zu fördern.
    4. Speichern Sie getrockneten Platten innerhalb einer Wurmkiste über Nacht (bis zu 24 Stunden) bei Raumtemperatur zur Induktion von DsRNA Produktion zu ermöglichen. Nach 1 Tag bei RT speichern Sie Platten bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen in einem versiegelten Zip-Lock Beutel (um Platten zu verhindern Austrocknung). Vor dem Gebrauch zurück Platten auf Raumtemperatur in dem Zip-Lock Beutel um Kondensation von der Einführung in der Luft Pilz Verunreinigungen zu verhindern.
  2. Synchronisation von C. Elegans mit Hypochlorit-Behandlung
    Hinweis: Weitere ergänzende Datei 3 M9 und Hypochlorit-Lösung-Rezepte.
    1. Trächtigen Erwachsene Tiere mit M9 zu sammeln. Verwenden Sie einen verstopften Glaspipette Übersiedlung nach 2 x 15 mL-Tuben.
    2. Drehen Sie Rohre für 30"~ 2.000 u/min. Suchen Sie einen Pool von Nematoden an der Unterseite des Rohres. Den überstand abgesaugt. Waschen Sie zwei Mal mit M9 Lösung, Spin und Aspiration zu wiederholen.
    3. Wieder aussetzen Sie C. Elegans in 4 mL M9. 2 mL Hypochlorit-Lösung zugeben. Sofort Vortexen ~ 3 min, mit regelmäßigen kräftig schütteln. Suchen Sie nach 3 min eine Wolke aus Eier unter dem sezierenden Mikroskop. Vortex zusätzlich 10 – 20 s, wenn Eier nicht nach 3 min freigegeben worden sind.
      Anmerkung: Timing der Hypochlorit-Behandlung ist wichtig. Eier in die trächtigen Erwachsenen sind was Behandlung überleben. Nach ca. 3 min die trächtigen Erwachsenen aufbrechen und die Eier austreten. Jedoch wenn Eier in Hypochlorit-Lösung sind sterben zu lange nach Veröffentlichung sie. Umgekehrt, wenn trächtigen Erwachsene nicht Hypochlorit-Lösung lange genug bleiben, keine Eier freigegeben werden.
    4. Waschen Sie schnell mit M9 Lösung zweimal wie in Schritt 2.1.2.
    5. Wieder aussetzen Sie C. Elegans Ei Pellet in 3 mL M9 und Übertragung auf eine neue 15 mL Tube. Embryonen über Nacht in 3 mL der Lösung der M9 mit Rotation bei 20 ° c schlüpfen zu ermöglichen
    6. Berechnen Sie die Dichte der L1 Tiere (oder Embryonen) pro Mikroliter durch Fallenlassen 10 µL L1 Lösung 3 X 6 cm Platte und Count die Anzahl der L1-Tiere, die durchschnittliche Anzahl der L1s/µL zu berechnen.
      Hinweis: L1 Tiere werden im Laufe der Zeit Regeln. Daher sollte in regelmäßigen Abständen L1 Lösungen gemischt werden.
    7. Samen 50 L1 Tiere pro Platte. Platten zu invertieren und Dichtung mit einem Gummiband. Platzieren Sie Platten in einem Kunststoff Wurmkiste. Verschließen Sie Feld in einem großen Zip-Lock Beutel. Bewegen Sie in einem Inkubator 20 ° C.
  3. Vermeidung von Nachkommen-Produktion durch die Zugabe von 5-Fluoro-2'-Deoxyuridine (FUdR)
    1. Wachsen Sie die Tiere erst L4-Stadium bei 20 ° C. Überprüfen Sie, ob synchronisiert Tiere entwickelt, um einen L4 ca. 40 h nach der Aussaat (Schritt 2.1.7).
      Hinweis:C. Elegans Entwicklungszeit wird bei verschiedenen Temperaturen unterschiedlich12 und Wachstumsraten von mutierten Tieren für die Preise nicht charakterisiert wurden empirisch geprüft werden müssen.
      1. Fügen Sie 160 µL 50 X FUdR auf jede 6 cm Platte mit L4 Tiere.
        Hinweis: Es ist entscheidend für FUdR in der L4-Stadium hinzufügen. Der Einfachheit halber stellen Sie 1.000 X Bestände von FUdR durch Auflösen von 1 g in 10 mL FUdR ultrapure H2O. Filter sterilisieren Lager FUdR mit einem 0,2 µm-Filter und 10 cc Spritze. Aliquoten ~ 1 mL Lager in sterilen 1,5 mL Röhrchen. Einfrieren und Lagerung bei-20 ° C.
    2. Platten für die Anwesenheit des Mannes zu inspizieren C. Elegans. Entfernen Sie alle Männer.
      Hinweis: Lebensdauer bemisst sich in der Regel für Hermaphroditen und nicht Männer. Hermaphroditen, die Paaren Leben kürzer als EWK Tiere, auch in Gegenwart von FUdR13. Männchen sind kleiner und dünner als Hermaphroditen und können leicht durch eine unverwechselbare hakenförmige Rute14identifiziert werden.
    3. Box in den Zip-Lock Beutel zurücklegen. Zurück zu 20 ° C Inkubator.
  4. Scoring Lebensfähigkeit
    1. Ergebnis Lebensfähigkeit täglich durch das Tier auf dem Kopf mit einem Platindraht oder Wimpern sanft zu berühren. Punkten Sie Tiere, die nicht als tot zu verschieben und entfernen sie aus der Platte (Abbildung 2A). Notieren Sie die Anzahl beobachtet tot für jede Bedingung für jeden Zeitpunkt der Beobachtung.
      Hinweis: Um das Risiko von scoring Voreingenommenheit der Experimentator blind für experimentellen Bedingungen bleiben muss und ebenso darf nicht verweisen die Ergebnisse aus früheren Zeitpunkten während scoring.
    2. Zensor-Tiere, die Ruptur, sterben an andere offensichtliche Entwicklung Mängel oder Crawl oben auf der Seite der Schale: Entfernen Sie diese Tiere und Datensatz die Anzahl jeweils Zeit festgestellt für die Prüfung in der statistischen Analyse Punkt. Zusätzlich wenn Männer gefunden werden, entfernen sie und notieren Sie die Anzahl beobachtet.
    3. Wiederholen Sie ab Schritt 1.4.1 täglich, bis keine Tiere am Leben bleiben.
      Hinweis: Sollte der Rasen von E. Coli deutlich vermindern oder Pilz beginnt zu wachsen auf der Platte, alle verbleibenden Tiere auf eine frische Platte mit den entsprechenden RNAi und FUdR übertragen.
  5. Daten-Analyse - Plotten und Statistiken
    1. Eingabe oder offene aufgezeichnete Beobachtungsdaten in Software unterstützt Überlebensanalyse mit dem nicht-parametrische Kaplan-Meier Abschätzer15 und Log-Rank test16 (siehe ergänzende Datei 3). Achten Sie darauf, zensierte Tiere umfassen. Enthalten Sie Männer, die beobachtet wurden, nicht, falls vorhanden.
      Hinweis: Datenformate variieren zwischen Software, aber ein gemeinsames Format ist es, jedes einzelne Tier beobachtet in einer separaten Zeile zu erfassen. Die experimentelle Timepoint, an dem ein Tier beobachtet wurde, wie die "Veranstaltung" Zeit tot ist. Wenn zensiert, ist die "Veranstaltung" Zeit der Timepoint, an dem das Tier zensiert wurde. Normalerweise gibt es ein Feld oder eine Checkbox zu zensierten Beobachtungen weisen darauf hin.
    2. Plotten Sie Kaplan-Meier-Survival-Kurven. Wählen Sie weniger als sechs Bedingungen für eine einzelne Handlung, wenn viele Bedingungen untersucht wurden, um die Lesbarkeit zu verbessern.
      1. Überprüfen Sie, ob Daten Fragen, die visuell deutlich - fehlende Beobachtungen, unerwartete Ergebnisse, etc. sind — und diese vor der statistischen Analyse.
    3. Verwenden Sie die Log-Rank-Test-Funktion in Ihrer Software paarweise auszuführenden statistische Vergleiche. Stellen Sie sicher, dass alle verfügbaren Optionen für die Behandlung von zensierte Ergebnisse für Recht zensierten Daten entsprechend festgelegt sind.

(2) Replica Set-Methode für Scoring C. Elegans Langlebigkeit

Hinweis: während die traditionelle Methode 3 – 6 Platten pro Zustand erfordert (siehe 1.1.2. oben), Replica Set-Methode erfordert viele mehr (siehe Punkt 2.2.2 unten). Die traditionelle Methode folgt Tiere auf der gleichen Platte während eines Experiments (Abbildung 2A). Im Gegensatz dazu mit Replikatsatz Tiere sind zählte nur einmal: viele identische Wiederholungen sind zu Beginn des Experiments so einrichten, dass eine Wiederholung zu jedem Zeitpunkt (pro-Testversion) erzielt wird (Abb. 2 b).

  1. Bibliothek-Setup.
    Hinweis: Zusätzliche Details auf Übergabe RNAi-Klone wird hier, wie das Replica-Set-Protokoll offen ist für die gleichzeitige Bewertung der vielen RNAi Klone behandelt und kann auf weit über 100 Klone gleichzeitig skaliert werden. Sammlungen von RNAi Klone sind als Glycerin Vorräte gehalten in einer 96-Well-Format-Platte erhalten. Replica Set Experimente verwenden 24-Well Platten. Jeder ist auch eine unterschiedliche Testbedingung, die eine Sammlung von RNAi-Klone, verschiedene chemische Behandlungen, tierische Stämme und So weiter entsprechen kann.
    1. Montieren Sie das Layout der Zweigstelle für Sammlungen von RNAi-Klone, so dass die folgenden Bedingungen erfüllt sind:
      1. Sicherstellen Sie, dass innerhalb einer 96-Well-Sammlung auch A1 ein leerer Vektor Negativkontrolle.
      2. Fügen Sie eine zusätzliche leere Vektor-Kontrolle nach dem Zufallsprinzip innerhalb jedes 24 Vertiefungen.
      3. 96-Well-Platte in Blöcke von 24 Wells, aufgeteilt, so dass jede 24-Well-Platte an einer Negativkontrolle (Abbildung 2) nach dem Zufallsprinzip eingefügt hat.
      4. Legen Sie eine Positivkontrolle nach dem Zufallsprinzip innerhalb jeder Gruppe von 24-Brunnen (Abbildung 2).
        Hinweis: Die Positivkontrolle ist die experimentelle Frage abhängig. Zum Beispiel beim Blick auf eine Sammlung von RNAi-, Erhöhung der Lebensdauer Klone, ist daf-2(RNAi) häufig enthalten. Umgekehrt wird bei der Betrachtung verkürzte Lebensdauer daf-16(RNAi) häufig verwendet.
  2. Vorbereitung der Replikatsätze
    Hinweis: die Anzahl der Wiederholungen notwendig ist die minimale Anzahl von Zeitpunkten (Abb. 2 b) gleich. Man muss wissen, a Posteriori wie lange Lebensdauer vor Beginn des Experiments sowie scoring-Frequenz (z.B. eine Replikat Set Experiment läuft 40 Tage mit jedem anderen Tag erzielte erfordert ein Minimum von 20 Replikatsätze für Vorbereitung zu messen jede Bedingung zu Beginn des Experiments). Es ist ratsam, ~ 5 zusätzliche Backup-Sätze (siehe 2.2.2 und 2.2.2.3 unten).
    1. Erstellen Sie einen frischen Stempel der RNAi-Zweigstelle, impfen Sie 200 µL LB + Amp pro Bohrloch in einem 96-Well-Format (600 µL Platten) mit einem 96-Stift Platte Replikator mit den folgenden Schritten:
      1. Sterilisieren Sie 96 Pin Platte Replikator durch nacheinander Eintauchen die Pins in 50 % Bleichmittel, hochreine H2O und Ethanol. Halten Sie die Pins mitten für mindestens 30 s für die Bleichmittel und Ethanol Schritte.  Nach dem Eintauchen in Ethanol Flamme kurz die Tipps. Den Vorgang wiederholen.
        Hinweis: achten Sie darauf, alle Bleichmittel abspülen, und lassen Sie sich nicht die Pins ausgesetzt um über einen längeren Zeitraum zu bleichen als Bleichmittel die Stifte aus rostfreiem Stahl korrodieren kann.
      2. Entfernen Sie vorsichtig die Klebefolie Abdeckung von gefrorenen 96-Well-Glycerin Materialbibliothek Platte und sanft aber mahlen Sie fest Tipps von sterilisierten Platte Replikator in die Vertiefungen der Bestände noch gefrorenen Glycerin. 200 µL LB + Amp Kulturen zu impfen und die beimpften Dichtplatte mit einer durchlässigen Membran. Lassen Sie Kulturen über Nacht auf die Benchtop wachsen.
      3. Sterilisieren des Platte-Replikators wie in Schritt 2.1.1, sorgfältig entfernen Sie die Dichtung aus der Flüssigkultur Platte nach Übernachtung Wachstum und Tipps der Replikator Pins eintauchen. Gelten Sie die Tipps mit gleichmäßigem Druck für einen rechteckigen LB-Amp + Tet nährbodenplatte und Transfer Bakterien von den Stiften auf die Platte vorsichtig mit kleinen kreisenden Bewegungen, um sicherzustellen, dass ausreichend Platz zwischen benachbarten Spots übrig bleibt. Lassen Sie Kolonien auf Agarplatte bei 37 ° c über Nacht wachsen Vorbereitung der LB + Amp/Tet zusätzliche Datei 3 weitere Platten.
      4. Vor dem Gebrauch speichern Sie nährbodenplatte bei 4 ° C invertiert (Deckel nach unten), in Paraffin Film verpackt.
        Hinweis: Speichern von Kolonien Deckel Seite oben wird Kondenswasser Kreuz-RNAi Klone verunreinigen kann! Kolonien von E. Coli sind für 2 – 8 Wochen bei 4 ° C, abhängig von bestimmten RNAi-Klone, speicherbar, RNAi Klone Wirksamkeit bei der Induktion von DsRNA nach IPTG Induktion für Variable Zeiträume beibehalten. Für kleine Sammlungen von RNAi-Klone sollten RNAi Effizienz empirisch RT-qPCR bestimmt Niederschlag zu bestätigen.
    2. Berechnen Sie die minimale Anzahl von 24-Well-Platten für eine Studie des Experiments notwendig: (# Platten pro Replikatgruppe) x (erwartete # Zeitpunkte). Stellen Sie sicher, dass ein paar zusätzliche Replikatsätze enthalten für den Umgang mit Themen wie Verunreinigung (Abbildung 2 b) sind.
      Hinweis: Die Gesamtzahl der RNAi-Klone bestimmen die Anzahl der 24-Well-Platten zu einem Satz von Repliken für jeden Zeitpunkt (Abbildung 2).
      1. Bereiten Sie 24-Well-Platten vor, wie 1.1.2 (ergänzende Datei 3 für Rezept) Schritt. Label-Platten, wenn sie so vor der Experimentator erzielte der Assay werden blind für die experimentellen Bedingungen, mit einem Farbcode oder ähnliche Codierschema sein.
      2. Eine Reihe von 1,5 mL LB + Amp Kulturen für alle 10 Replikate (siehe 2.2.2) zu impfen. Kulturen in 96 auch Deep-Well-Platten mit der Platte Replikator (wie in 2.1.3) und bakterielle Kolonien von 2.1.4 (Abbildung 2, Links) zu impfen. Mit atmungsaktive Membrane zu versiegeln Sie, wachsen Sie 20 h (37 ° C) mit zittern.
      3. Samen Sie 120 µL einer Übernacht-Kultur auf jede Platte mit einer 6-Well Mehrkanal-Pipette mit verstellbarer Spitze Abstände (Abbildung 2, rechts). Trocknen Sie die Platten in einem Laminar-Flow-Abzug aufgedeckt, bis alle Flüssigkeit aufgesogen hat. Trocknen Sie nicht übermäßig. Lagern Sie Platten über Nacht bei Raumtemperatur.
  3. Synchronisation von C. Elegans mit Hypochlorit-Behandlung
    1. Berechnung der Mindestzahl von Tieren, die für das Experiment benötigt: minimale # L1s benötigt = (15-20 Tiere/Brunnen) (24 Brunnen/Platte) (X Platten/Replikatgruppe)(Y replica sets).
      Hinweis: Replica Set-Methode erfordert mehr Tiere als die traditionelle Methode. Ein 10 cm Teller voller trächtigen Würmer kann 20.000 – 50.000 L1 Tiere abhängig von der Dichte der trächtigen Erwachsenen liefern. In ähnlicher Weise ergeben 20 6 cm Platten um ~ 30.000 L1 Tiere. Planen Sie eine Ei-Vorbereitung vorzubereiten, die die minimale Anzahl von Tieren Bedarf verdoppelt. Wenn die Bevölkerung in Vorbereitung gehungert hat, wieder zu füttern oder Brocken auf eine neue Platte und lassen mindestens drei Generationen auf Lebensmittel vor Routinemaßnahmen17,18. Achten Sie darauf, wieder übrig gebliebenen L1s einfrieren.
    2. Führen Sie die Schritte 1,2 bis 1.2.6 wie bei der traditionellen Methode zu synchronisiert L1 Tiere. Samen Sie 15 – 20 L1 Tiere in jeder gut mit 6-gut einstellbare Abstände Pipette und Reagenz Reservoir, ähnlich wie 1.2.7. In regelmäßigen Abständen mischen Sie L1 Lösung absetzen der Tiere zu verhindern.
  4. Verhinderung der Produktion von Nachkommen durch die Zugabe von 5-Fluoro-2'-Deoxyuridine (FUdR)
    1. Folgen Sie Schritt 1.3.1.  Bereiten Sie steril 50 x FUdR Lager (siehe Schritt 1.3.1.1).
    2. Wenn Tiere erreichen L4, hinzufügen 25 µL 50 X FUDR in jede Vertiefung von einer 24-Well Platte mit einer 6-Kanal-Pipette einstellbare Abstände.
  5. Partitur-Rentabilität
    1. Entfernen Sie einen Satz von replizieren Platten und Flut Brunnen mit der M9-Lösung Rekord insgesamt Tiere pro Bohrloch, und berühren Sie dann sanft ruhenden Tiere auf den Kopf mit einem Wurm-Pick (Abb. 2 b). Tiere nicht zu bewegen, werden als tot gewertet. Entsorgen Sie erzielte Platten. Rekord Lebensfähigkeit täglich.
      Hinweis: Tiere, Bruch, zeigen grob morphologischen Mängeln, versäumt, zu entwickeln oder auf der Seite des Brunnens kroch, sind zensiert werden, indem Sie von den Toten und insgesamt Werte ausschließen.
      1. Notieren Sie die Anzahl der Tiere, die innerhalb jedes gut zu jedem Zeitpunkt separat von den anderen Werten zensiert werden.
      2. Nicht Punkten, Brunnen, die haben keine Nahrung oder kontaminiert sind (z.B. Pilze oder Schleim); solche Brunnen gelten als zensiert. Auch eine gut zu zensieren, wenn alle Tiere morphologische oder Entwicklungsstörungen Mängel anzuzeigen. Die Zensur Veranstaltung für diese RNAi Klon/gut zu diesem Zeitpunkt aufzeichnen.
      3. Nach seinem Tor eine Replicate Platte, verwerfen. Weiterhin erzielte eine neue Replikation setzen jeden Tag, bis alle Tiere in alle Wells tot sind. Um das Risiko von scoring Voreingenommenheit der Experimentator blind für experimentellen Bedingungen bleiben muss und ebenso darf nicht verweisen die Ergebnisse aus früheren Zeitpunkten während scoring.
      4. Wenn alle Tiere in einen Brunnen waren tot zu einem bestimmten Zeitpunkt, dann nach diesem Tag scoring, prüfen, ob alle Tiere als tot für zwei aufeinander folgenden Zeitpunkten für erzielt eine gegebene gut. Wenn ja, ist die erzielte Lebensfähigkeit für, dass auch in späteren Zeitpunkten nicht mehr benötigt.
      5. Durchführen Sie weitere unabhängige Experiment Studien. Verfolgen Sie die Ergebnisse von aufeinanderfolgenden Prüfungen getrennt von denen in früheren Studien mit der Prüfungsnummer zur Kenntnis genommen.

3. grafische Darstellung von Daten

Hinweis: Mit der Replikatgruppe ist eine Kurve passen Verfahren ungefähren Mittelwert und maximale Lebensdauer. Die Parameter zur Beurteilung von C. Elegans Sterblichkeit passen ein Logit-Kurve-19.  Da die meisten überleben Tools Logit Kurvenanpassung nicht unterstützen, wurde ein neues Programm entwickelt, für das Plotten Logit-Kurven (für Replikatsatz); Kaplan-Meier-Kurven (für die traditionelle Methode) werden ebenfalls unterstützt.

  1. Erste Schritte mit der Software. Download der Version Zip-Datei für die aktuelle Version (siehe Abschnitt Materials). Extrahieren Sie die Zip-Datei in einen Ordner. Siehe "Readme" Datei in den entpackten Ordner für zusätzliche Installationsanweisungen.
  1. Starten Sie das Plotten Interface. Suchen Sie den Speicherort des Verzeichnisses "Code" in den Ordner aus der Zip-Datei extrahiert (z.B.  "/ Benutzer/Benutzername /Desktop/WormLife/Code").
    1. Geben Sie die folgenden Befehle in der R-Konsole als Ersatz für den Ordnerpfad nur identifiziert. Drücken Sie eingeben oder zurückkehren, nachdem jede Zeile eingegeben: (1) setwd("/Users/UserName/Desktop/WormLife/code"), (2) source("plotGUI.R"), (3) openMain().
    2. Planen Sie Zeit für die Schnittstelle in einem neuen Fenster geladen Erziehung der Standard-Bildschirm wie in Abbildung 3Agezeigt. R, die im Hintergrund laufen zu lassen.
  2. Datenformat als durch Kommas getrennten Wert (CSV) oder tabulatorgetrennte Wert (TSV) Dateien. Geben Sie Spalten und Namen, abhängig von der Art der Analyse. Vorformatierte Beispieldaten finden Sie unter zusätzliche Datei-4 (Replikat festgelegt) und ergänzende Datei 5 (traditionelle/Kaplan-Meier).
    Hinweis: Daten müssen angegeben werden, in einem "langen" Format, d. h. eine Zeile pro Sorte/Behandlung pro Zeitpunkt pro Versuch. CSV-Dateien werden für optimale Kompatibilität zwischen verschiedenen Plattformen empfohlen.
    1. Entfernen Sie Zeilen entsprechend der Beobachtungen, die übersprungen oder zensiert wurden. Überprüfen Sie das Fehlen von fehlenden oder nicht-numerische Werte, da es zu einem Fehler führen kann, wenn die Daten importiert werden.
    2. Für traditionelle Kaplan-Meier Analyse, nicht Daten aus unabhängigen Studien-Plot bündeln sie separat. Für die Replikatgruppe Analyse bündeln Daten aus mehreren Studien, und untersuchen Sie mithilfe der Funktion "TrialView" (siehe 6.3.3.4).
  3. Mit Hilfe der Plotten Schnittstelle
    1. Laden Sie eine Datendatei ("Importieren" im Menü "Datei") im Dialogfeld. Um ".csv" Dateien öffnen, ändern Sie den Dateityp in der Dropdownliste ".csv" (der Standardwert ist ".txt/.tsv"), navigieren Sie zu dem Ordner mit der Datendatei. Hier ist die Datei die Replikatgruppe Beispieldaten (zusätzliche Datei-4).
      Hinweis: Eine Datei zu importieren, wenn ein Dataset bereits geöffnet ist wird der aktuelle Datensatz ersetzt.
    2. Wählen Sie eine Datei importieren, um den Import-Assistenten starten Sie die Spaziergänge durch die Spalten der ausgewählten Datei (Abbildung S1A für Replikatsatz) zu identifizieren. Wenn die eingegebenen Daten eine Replikatgruppe Experiment entspricht, wählen Sie "Logit" für Studientyp.
      Hinweis: Der Import-Workflow unterscheidet zwischen Replikatsatz (Abbildung S1A) und traditionellen (Kaplan-Meier) (Abbildung S1B).
    3. "Plot-Daten". Wählen Sie "Add Line" beginnen Daten Plotten. (Eine Zeile entspricht einer bestimmten Bedingung. Es gibt Funktionen, die mit Experimenten zu helfen wo viele Bedingungen getestet wurden).
      1. Plotten der Kontrolle Bedingungen-bei den Beispieldaten N2 (WT) mit L4440 (leerer Vektor) RNAi eignen. Wählen Sie "Zeile hinzufügen" im Menü "Diagramme" auf den Linien Hinzufügen-Assistenten zu starten: Wählen Sie die Bedingung, die Handlung und die graphische Parameter für die Darstellung der Linie.
        1. Um eine Kurve für eine andere Erkrankung manuell hinzuzufügen, wiederholen Sie die Schritte im 3.3.3.1
        2. Ändern Farbe oder Symbol für eine Linie zeichnen, wählen Sie "Modify Line" im Menü"Diagramm".
        3. Um eine Zeile zu entfernen ohne alle Zeilen zu löschen, wählen Sie "Zeile löschen" im Menü"Diagramm".
        4. Um alle Zeilen in der aktuellen Handlung zu löschen, wählen Sie "Zeile löschen" im Menü"Diagramm".
        5. Um die automatisch gewählte maximale x-Achse (Zeit) Wert zu überschreiben, verwenden Sie "Set X Scale" im Menü"Diagramm".
          Hinweis: der y-Achse (Überlebende Bruch) zeigt immer 100 % (oben) auf 0 % (unten) in Schritten von 20 %. Die x-Achse wird immer in Schritten von 5 angezeigt. Achsenbeschriftungen werden nicht geplottet, Flexibilität bei der Kennzeichnung nach dem Plot Bilder speichern aktivieren.
      2. Um JPEG-Format Bilder des aktuell angezeigten Plots zu speichern, verwenden Sie die "Speichern-Plot" Option im Dateimenü""; nur der aktuelle Plot wird gespeichert.
      3. Für die Erstellung von einzelner Parzellen für viele unterschiedliche Bedingungen in einem Experiment, ermöglicht die Software definieren und Plotten "Serie".
        Hinweis: Die Umsetzung des Konzeptes Serie verbessert die Effizienz bei der Arbeit mit großen Experimente.
        1. Wenn mit einem leeren Grundstück Arbeitsbereich beginnen, fügen Sie Zeilen Kontrolle entsprechen, die konsequent über alle Grundstücke in der Serie sein (siehe 3.3.3.1).
        2. Definieren Sie die Serie mit "Definieren Series" im Menü "Diagramme". Wählen Sie eine Bedingung entspricht der Linie zunächst in der Serie angezeigt; nur eine kann ausgewählt werden. Wählen Sie grafische Parameter (Line Farbe und Plot-Symbol) für die Linie, wie 3.3.3.1.
        3. Überprüfen Sie die Grundstücke für die verschiedenen Testbedingungen. Schalten Sie die Anzeige der "Serie" zwischen Bedingungen mit den Links/rechts Pfeiltasten auf den Seiten des Fensters Haupthandlung sowie in der oberen Menüleiste (Abbildung 3A-C) gefunden.
          Hinweis: Wenn der ausgewählten Serie die gleichen Bedingung als eines der zuvor hinzugefügten Kontrolle/Referenzlinien ist, kann die neue Linie überlagert angezeigt.
        4. Definieren Sie die Serie, um bestimmte andere Funktionen zur Verfügung (speichern Serie Grundstücke und Trialview-siehe 3.3.3.4 für Letzteres) zu machen. Nach der Definition einer Reihe, die Option "Speichern Serie Plots" aus dem Menü "Datei" zu einzelnen Plot-Image-Dateien für jeden Plot in der Serie in einem neuen Ordner speichern.
      4. Trialview — visualisieren Ergebnisse unabhängiger Studien einer Replikatgruppe Experiment. Wenn mehrere Prüfungen für eine oder mehrere der Probe Gruppen ausgeführt wurden, zeichnen Sie die Daten aus den einzelnen Studien und die gepoolten Daten aus allen Studien getrennt, die Konsistenz zwischen unabhängigen Studien (siehe Abbildung 3D) zu bewerten.
        1. Richten Sie eine Reihe wie in 3.3.3.3 beschrieben. Die verschiedenen Studien werden für jede "unterschiedliche" Probe-Gruppen in ein anderes Bild über die jeweiligen Prüfungen für den angegebenen Verweis/Kontrollproben geplottet werden.
        2. Um die TrialView Bilder zu speichern, gehen Sie zu "Print TrialViews" im Menü "Daten"; eine JPEG-Bild wird für jeden Plot in der Serie ausgegeben.
          Hinweis: Die Beispielergebnisse in Abbildung 3D ist für einen Fall mit zwei Studien.
    4. Mittlere Lebensdauer zusammenfassende Tabelle für Replikatsatz Daten. Visuell inspizieren Kurven zum vernünftigen Sitz der Daten zu gewährleisten, und wählen Sie dann " "Übersichtstabelle "Option im Menü" Daten "zum Speichern einer Tabelle mittlere Lebensdauer Werte (Zeit bei 50 % Überleben auf Logit-Kurve) für jede Probe.
  4. Statistische Auswertung der Daten über die Replikatgruppe Methode generiert
    1. Für die statistische Analyse zwischen zwei Gruppen von einer Replikatgruppe Experiment, zu ändern, und führen Sie eine R-Skript in der Release-Zip-Datei zur Verfügung gestellt (siehe "WormLife statistische Analyse Vorlage Skript. "R").
      Hinweis: Kenntnisse in R ist nicht erforderlich, um das Skript auszuführen. Zusätzliche Dokumentation ist in den Kommentaren in der Datei. Das Skript ist für die Analyse des Beispiels Replikatsatz Daten bereit. User generated Daten im geeigneten Format können (siehe ergänzende Datei 4) auch analysiert werden.
      1. Öffnen Sie die Skriptdatei in R (R-GUI oder RStudio).
        Hinweis: Dies wird das Skript anzuzeigen, ohne es auszuführen.
      2. Ändern Sie die Speicherorte der erforderlichen Dateien an den Speicherort auf Ihrem Computer übereinstimmen.
        Hinweis: Diese Dateipfade "voll qualifiziert" sein müssen (d.h. sollte den komplette Dateispeicherort, einschließlich der Ordner enthalten).
        1. Ändern Sie die Pfade (Datei/Ordner Standorte) für "WlDir" (Speicherort des Verzeichnisses), "DataFile" (die Replikatgruppe Datendatei zu analysieren), "CompFile" (Spezifikation Vergleiche zu laufen, falls zutreffend) und "OutputPath" (Standort wo Ergebnisdateien geschrieben werden zu).
      3. Legen Sie die Spaltennamen im Abschnitt "Geben Sie Spalten in der Datendatei", wenn Spaltennamen in der zu analysierenden Datei aus der Beispieldatei unterscheiden. Eine Spalte für jeden Parameter angeben. Wenn eine Studie mehrere Stämme hat, aber keine RNAi (oder einer anderen Behandlung) eine Spalte in der Datendatei mit leere Einträge oder das gleiche für alle Zeilen (z. B. "No_treatment", etc. enthalten).
      4. Legen Sie den Parameter "CompFile". Wenn der Parameter "CompFile" auf NA festgelegt ist, werden alle möglichen paarweise Vergleiche von Gruppen ausgeführt werden.
        Hinweis: Eine Gruppe zeichnet sich durch die Kombination von Belastung/Genotyp und Behandlung, die aneinandergereiht sind und als "Strain_treatment" angezeigt. Für größere Studien mit vielen Gruppen kann eine CSV-Datei angeben Vergleiche bereitgestellt werden. Die Beispieldatei "comps_rsm_example.csv" zu sehen.
      5. Legen Sie die Anzahl der Iterationen für Monte-Carlo resampling ("k.resamp", der Standardwert ist 1.000).
        Hinweis: P-Werte von 0 können zurückgegeben werden, wenn zu wenige Iterationen durchgeführt werden; in solchen Fällen ist es angebracht, Bericht "p < 0,01" (wenn k.resamp = 100), oder "p < 0,001" (wenn k.resamp = 1.000), etc.
      6. Führen Sie das Skript: Taste "Source" in RStudio (oben rechts im Fenster bearbeiten) oder "Quelldokument" im Menü "Bearbeiten" in der R-GUI. (Ausführung kann einige Zeit dauern.)
      7. Wenn die R "Statusanzeige" nicht mehr angezeigt wird, öffnen Sie die Ausgabe-Verzeichnis-dort wird eine Tabelle mit Ergebnissen von jedem Vergleich (mediane Überlebenszeit, p-Werte, mittlere Lebensdauer Veränderung in %).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bei der Entwicklung einer neuen Methodik ist es unerlässlich, dass die neue Methode akzeptierte Ergebnisse von früheren Ansätzen rekapituliert und dem Standard innerhalb eines Feldes entspricht. Wir haben bisher empirisch gezeigt, dass die Replikatgruppe und traditionelle Methoden zur Untersuchung von C. Elegans Lebensdauer ähnliche Ergebnisse20 produzieren. Wildtyp C. Elegans (N2) in der Regel bei 20 ° C gepflegt Leben zwischen 20 und 25 Tage, di...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die traditionelle und Replica setzen-Methoden erfordern die Synchronisation von chronologisch im Alter von Tieren. Wir sind eine Methode, die Tiere mit Hypochlorit Behandlung von trächtigen Erwachsene, wo nur die befruchteten Eier mit der trächtigen Erwachsene Behandlung überleben synchronisiert. Diese Embryonen schlüpfen in flüssige Suspension und Entwicklungsgeschichtlich im ersten Larvenstadium (L1) verhaften. Nach der Aussaat L1 Tiere auf Nahrung (z.B. E. Coli mit dem Ausdruck ihrer DsRNA zu einem g...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Finanzierung dieser Arbeit beschrieben in diesem Manuskript von zur Verfügung gestellt wurde: die University of Rochester-Büro der Propst und der School of Medicine und Dentistry Dekanat über die Health Sciences Center für Computational Innovation (HSCCI); die Ellison Medical Foundation neue Wissenschaftler in alternden Fellowship (AG-NS-0681-10) hatte die Geldgeber keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
IPTG (Isopropyl beta-D-1-thigalactopyranosid)Gold Bio12481C100
FuDR (5-Fluor-2'-desoxyuridin)Alfa AesarL16497
24 Well KulturplattenGreiner Bio-One#662102
Rechteckige unbehandelte Single-Well-Platte, 128x86mmThermo-Fisher242811
600 µ L 96-Well-PlattenGreiner Bio-One#786261
2mL 96-Well-PlattenGreiner Bio-One#780286
Luftdurchlässige PlattendichtungVWR60941-086
96-poliger PlattenreplikatorNunc250520
Bacto-PeptonVWR90000-368
bakteriologischer AgarAffymetrix/USB10906
C. elegans RNAi-Klonbibliothek in HT115-Bakterien - AhringerSource BioscienceC. elegans RNAi Collection (Ahringer)Siehe auch Kamath et. al., Nature 2003.
C. elegans RNAi-Klonbibliothek in HT115-Bakterien- VidalSource BioscienceC. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)Siehe auch Rual et. al., Genome Research 2004. Diese Bibliothek ist auch bei Dharmacon erhältlich.
WormLife - Software für die Überlebensanalyse von ReplikatenSamuelson LabN/A
https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife L4440 Empty Vector PlasmidAddgene1654https://www.addgene.org/1654/
Wormbasehttp://www.wormbase.org/ 
OASEhttps://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ 
Graphpad Prismhttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 

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