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Summary

Bulk-gen Ausdruck Messungen Wolke Einzelzelle Unterschiede in heterogenen Zellpopulationen. Hier beschreiben wir ein Protokoll wie einzellige gen Expressionsanalyse und Index Sortierung durch die Blüte aktiviert Zelle sortieren (FACS) kann kombiniert werden, um die Heterogenität zu umreißen und immunophenotypisch charakterisieren molekular unterschiedliche Zellpopulationen.

Abstract

Immunophenotypic Charakterisierung und molekulare Analyse haben seit langem verwendet, um abzugrenzen Heterogenität und unterschiedliche Zellpopulationen zu definieren. FACS ist von Natur aus eine einzellige Assay, molekulare Analyse jedoch vor, die Zielzellen oft prospektiv in loser Schüttung, isoliert werden dadurch verlieren einzellige Auflösung. Einzellige gen Expressionsanalyse bietet die Möglichkeit, molekulare Unterschiede zwischen einzelnen Zellen in heterogenen Zellpopulationen zu verstehen. In Zelle Massenanalyse ergibt eine Überrepräsentation von einem deutlichen Zelltyp Vorurteile und Gefäßverschlüsse von Signalen von seltenen Zellen mit biologischer Bedeutung. Durch die Verwendung von FACS Index sortieren gekoppelt mit einzelligen gen Expressionsanalyse, Populationen untersucht werden können ohne den Verlust von einzelligen Auflösung während Zellen mit mittleren Zelle Oberfläche Marker Ausdruck auch erfasst werden, ermöglichen die Bewertung der die Relevanz der kontinuierliche Oberfläche Marker Ausdruck. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der reversen Transkription einzellige kombiniert quantitative PCR (RT-qPCR) und FACS index sortieren gleichzeitig die molekulare Charakterisierung und Immunophenotypic Heterogenität innerhalb Zell-Populationen.

Im Gegensatz zu den einzelligen RNA Sequenzierung Methoden ermöglicht die Verwendung von qPCR mit zielgruppenspezifischen Verstärkung für robuste Messungen von niedrig-Fülle Transkripte mit weniger Aussetzer, während es durch Probleme im Zusammenhang mit Variationen von Zelle zu Zelle lesen Sie nicht verwechselt wird Tiefe. Darüber hinaus direkt Index-Sortierung Einzel-Zellen in Lyse-diese Methode Puffer, ermöglicht durch cDNA Synthese und zielgruppenspezifische Vorverstärkung in einem Schritt sowie für die Korrelation der später abgeleiteten molekulare Signaturen mit Zelloberfläche durchgeführt werden Marker-Ausdruck. Die beschriebene Vorgehensweise wurde entwickelt, um hämatopoetischen Einzel-Zellen zu untersuchen, aber haben auch erfolgreich auf andere Zelltypen eingesetzt.

Abschließend ermöglicht der hierin beschriebene Ansatz für empfindliche Messung der mRNA Ausdruck für ein Panel der vorgewählten Gene mit der Möglichkeit, Protokolle für angehende isoliert von molekular unterschiedliche Subpopulationen zu entwickeln.

Introduction

Jede einzelne Blutzelle wird geglaubt, um in einer zellulären Hierarchie befinden wo Stammzellen bilden die Spitze auf der Oberseite eine Reihe von zunehmend engagierte fortgeschrittene Stammväter, die schließlich unheilbar in die endgültige Effektorzellen mit spezifischen unterscheiden biologische Funktionen¹. Viel von dem Wissen über Stammzellen Systeme wie organisiert sind wurde im blutbildenden System, vor allem wegen der Fähigkeit, unterschiedliche hämatopoetische Populationen hochangereichertes für Stammzellen oder verschiedene Vorfahren^{2 prospektiv isolieren generiert} durch FACS sortieren. Dies hat für viele dieser Populationen erlaubt, funktional oder molekular, überwiegend durch gen-Expressions-profiling^3,4analysiert werden. Aber wenn Analyse der Genexpression von Schüttgut Populationen individuelle Unterschiede zwischen den Zellen sind gemittelt und verlor⁵. So kann Arbeitsunfähigkeit, Zell-Zell-Varianten in heterogenen Zelle Bruchteilen zu erkennen unser Verständnis der kritischen biologischen Prozesse verwirren, wenn kleine Teilmengen von Zellen für die abgeleitete biologische Funktion von dieser Bevölkerung^{6zu berücksichtigen, 7}. Umgekehrt, Untersuchung von gen-Ausdruck-Signaturen bei einzelligen Auflösung bieten die Möglichkeit zu Heterogenität abzugrenzen und zu überschatten Einflüsse aus überrepräsentiert Teilmengen von Zellen⁸umgehen.

Bisher wurden viele Protokolle für einzellige gen Expressionsanalyse entwickelt; mit jeder dieser Ansätze hat seine eigenen Vorbehalte. Die früheste Methode wurde RNA Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (RNA-Fisch), die eine begrenzte Anzahl von Abschriften zu einem Zeitpunkt misst, sondern ist einzigartig, da es ermöglicht die Untersuchung von RNA Lokalisierung^9,11. Frühe Methoden mittels PCR und qPCR um zu erkennen, dass ein einzelnes oder wenige Abschriften wurden auch entwickelt,¹². Jedoch haben diese in letzter Zeit durch Mikrofluidik-basierte Methoden ersetzt, die gleichzeitig Ausdruck von Hunderten von Abschriften pro Zelle in Hunderten von Zellen durch qPCR analysieren können und ermöglichen so hochdimensionalen Heterogenität-Analyse mit gen Platten^10,13im Vorhinein festgelegt. Vor kurzem RNA Sequenzierung basierenden Technologien haben werden am meisten benutzt für Einzelzelle Analyse, wie diese können theoretisch das ganze Transkriptom einer Zelle zu messen und dadurch eine explorative Dimension Heterogenität Analyse^10, verleihen ¹⁴. Multiplexed qPCR Analyse und einzellige RNA Sequenzierung haben unterschiedliche Eigenschaften, so die Begründung für die Verwendung einer der Methoden hängt die Frage sowie die Anzahl der Zellen in der Zielpopulation. Hochdurchsatz- und low-cost pro Zelle zusammen mit unvoreingenommenen, explorative Eigenschaften der einzelligen RNA Sequenzierung sind erwünscht, wenn unbekannte Zelle oder große Populationen untersucht werden. Allerdings ist einzellige RNA Sequenzierung auch voreingenommen gegenüber Sequenzierung hohe reichliche Abschriften häufiger während Transkripte mit niedrigen Fülle anfällig für Ausfälle sind. Dies führt zu erheblich komplexer Daten, das stellt hohe Anforderungen an bioinformatische Analyse wichtige molekulare Signale zeigen, die oft subtil oder in technischen Lärm¹⁵verborgen sind. Also für gut charakterisierten Gewebe einzellige qPCR-Analyse mit vorbestimmt Primer Platten ausgewählt für funktionell wichtige Gene oder molekulare Marker können als ein sensibler, unkomplizierte Konzept zur Bestimmung der Heterogenität der dienen ein Bevölkerung. Allerdings ist anzumerken, dass im Vergleich zu einzellige RNA-FF, die Kosten pro Zelle ist im Allgemeinen höher für einzellige qPCR Methoden. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der einzelligen RT-qPCR (geändert von Teles J. Et Al. kombiniert ( ¹⁶), FACS Index gleichzeitig¹⁷ und Bioinformatik Analyse¹⁸ zur Sortierung die molekularen und Immunophenotypic Heterogenität innerhalb von Populationen zu charakterisieren.

Bei diesem Ansatz die Zellpopulation des Interesses ist befleckt und Einzel-Zellen sind durch FACS direkt in Lyse Puffer in 96-Well-PCR-Platten sortiert. Gleichzeitig sind Ausdruck eines zusätzlichen Satzes der Zelloberfläche Marker für jede einzelne Zelle bei der FACS-Sortierung, eine Methode Drittel über dem Niveau, die als Index-Sortierung bezeichnet wird. Das lysierten Zellmaterial wird anschließend verstärkt und die Genexpression eine ausgewählte Gruppe von Genen mit RT-qPCR, mithilfe einer mikrofluidischen Plattform analysiert. Diese Strategie ermöglicht molekulare Analyse der sortierten einzellige sowie gleichzeitige Charakterisierung von jeder einzelnen Zelle Zelloberfläche Marker Ausdruck. Indem Sie direkt zuordnen molekular unterschiedliche Teilmengen von Zellen des Ausdrucks der indizierten sortierte Marker, können die Subpopulationen mit einer bestimmten Immunophenotype verknüpft werden, die für ihre zukünftigen Isolation verwendet werden können. Die Methode wird erläutert Schritt für Schritt in Abbildung 1. Eine vorbestimmte gen Gremium trägt eine höhere Auflösung der gezielten Genexpression, da sie Messung irrelevant reichlich Gene umgeht, die sonst feine gen Ausdruck Signale verdecken können. Robuste Messung von niedrigen ausgedrückt Transkripte, wie Transkriptionsfaktoren oder nicht-Poly-Adenylated-RNAs ermöglicht darüber hinaus der zielgruppenspezifischen Verstärkung, einen Schritt reversen Transkription und Verstärkung. Wichtig ist, zulassen qPCR Methoden für die Messung der mRNA von Schmelzverfahren Proteine, die wichtig sind bei der Untersuchung von bestimmten bösartigen Erkrankungen¹⁹. Zu guter Letzt die fokussierte Zahl der Gene untersucht, geringe Drop-out-Raten und begrenzten technischen Unterschiede zwischen den Zellen machen diese Methode leicht analysiert im Vergleich zu höher dimensionale Methoden, z. B. einzellige RNA-seq. Anhand des Protokolls kann eine gesamte Experiment durchgeführt werden, von der Sortierung Zellen analysierten Ergebnisse innerhalb von drei Tagen, so dass dies eine unkomplizierte und schnelle Methode für sensible, Hochdurchsatz einzellige Ausdruck Genanalyse.

Protocol

1. Vorbereitung der Lyse Platten

1. Mit Hilfe einer RNA/DNA-freie Bank vorbereiten genug Lyse Puffer 96 Wells, mit 10 % extra, durch das Mischen von 390 µL Nuklease freies Wasser, 17 µL 10 % NP-40, 2,8 µL 10 mM dNTP, 10 µL 0.1 M DTT und 5.3 µL RNAse-Inhibitor (siehe Tabelle der Materialien). Wirbel und Spin-down.
2. Verteilen Sie 4 µL Lyse Puffer in jede Vertiefung eine 96 well PCR-Platte zu und verschließen Sie die Platten mit Klebefolie. Spin-down Röhren Flüssigkeit an der Unterseite der Platten zu sammeln. Halten Sie die Platten auf Eis bis Zelle sortieren (max. 24 h).

2. Vorbereitung der Zellen Zellsortierung

1. Tauen Sie entsprechende Anzahl von Zellen (hier, CD34 angereicherten hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen) für das Experiment. 1 x 10⁶ Zellen eignen sich für die Sortierung etwa drei 96-Well-Platten von Einzel-Zellen mit Steuerelementen.
2. Aufgetaute Zellen auf eine 15 mL konische Rohr übertragen und 1 mL EB alle 30 s bis ein Gesamtvolumen von 8 mL erreicht ist. Zellen in einer Zentrifuge bei 350 X g für 10 min bei 4 ° C drehen und überstand zu entfernen.
3. Aufschwemmen Zellen in 8 mL Puffer Färbung (PBS mit 2 % FBS) und 350 X g für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert und überstand zu entfernen.
4. Aufschwemmen Zellen in 200 µL Färbung Puffern und Zellen für Kontrolle Flecken zu entfernen.
5. Machen Fluoreszenz abzüglich einer Steuerelemente (RGV) für jede Fluorophor durch Färbung ein Bruch der Zellen in 50 µL Puffer Färbung. In diesem Beispiel werden 6 Mikrozentrifugenröhrchen mit 20.000 Zellen als FMOSs verwendet. Beachten Sie, dass die Anzahl der Zellen abhängig von der untersuchten Bevölkerung angepasst werden soll. Fügen Sie alle Antikörper bei der gleichen Konzentration wie in der Probe Fleck mit Ausnahme eines für jedes Rohr.
6. Stellen Sie einzelne Flecken für jedes Fluorophor durch Färbung einen Bruchteil der Zellen in 50 µL Puffer für jede Fluorophor verwendet. In diesem Beispiel werden 6 Mikrozentrifugenröhrchen mit 20.000 Zellen verwendet. Beachten Sie, dass das Ziel für jeden Antikörper durch die Zellen benutzt für Steuerelemente zum Ausdruck gebracht werden muss. Fügen Sie jeder Antikörper bei der gleichen Konzentration wie in der Probe Fleck in Einzelrohren. Zusätzlich halten Sie 20.000 ungefärbte Zellen in 50 µL als ungefärbten Kontrolle.
7. Die Zellprobe fügen Sie Antikörper in ihrer entsprechenden Konzentration hinzu. Verwendet hier sind CD34-FITC in einer Konzentration von 1/100, CD38-APC 1/50, CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 und Lineage Mix: CD3-PECy5 1/50, CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50 und CD235a-PECy5 1/1000.
8. Inkubieren Sie Zellen mit Antikörpern für 30 min auf Eis im Dunkeln.
9. Waschen Sie Zellen mit 3 mL Puffer Färbung. Zellen bei 350 X g für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert und überstand zu entfernen.
10. Aufschwemmen Sie Zellen und wiederholen Sie Schritt 2,9.
11. Aufschwemmen Probe in 500 µL und RGV in 100 µL Puffer mit 1/100 7AAD und Filter Zellen durch einen 50 µm Filter eine einzellige Aussetzung zu beflecken.

(3) Zellsortierung

1. Stellen Sie sicher, dass das FACS-Gerät konfiguriert ist korrekt mit Drop Verzögerung und Cytometer Setup und tracking (CST), die vor kurzem durchgeführt worden sind, nach Angaben des Herstellers, um sicherzustellen, dass die entsprechenden Zellen sortiert werden. Für hämatopoetische Zellen empfiehlt die Verwendung der 85 Mikron Düse und maximale Geschwindigkeit von 4, während die optimale Ereignisrate zwischen 800 und 2000 Ereignisse/s ist.
2. Spektrale Überlappung durch Fluoreszenz Kompensation ausführen korrigieren und Tore nach FMO Steuerelemente oder negative Kontrollen festgelegt.
3. Durchführen Sie Reanalyse der Zielgruppe durch mindestens 100 Zielzellen zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch mit 100 µL Puffer Fleck Sortierung. FACS der sortierten Zellen durch Aufnahme der sortierte Probe zu analysieren und stellen Sie sicher, dass sie am Ende in der Art Tor.
4. Set-up einzigen Zellplatte Sortierung nach Zentrierung des Rückgangs auch A1 in einer 96-well-Platte. Wenn es zentriert ist, sortieren Sie, 50 – 100 6 µm Partikel in alle Vertiefungen an den Rändern der eine leere 96-well-Platte um sicherzustellen, dass alle Brunnen eine Zelle in der Mitte jedes gut erhalten.
5. Wenn möglich, kann eine zusätzliche Kontrolle, um sicherzustellen, dass lebensfähige Zellen sortiert werden durch Sortierung Einzel-Zellen in Vitro Wachstum hinzugefügt werden. Hämatopoetische Zellen können in U-Boden-96-well-Platten in 100 µl SFEM mit 1 % Penicillin-Streptomycin, 100 ng/mL FLT3L, TPO und SCF angebaut werden. Analysieren Sie jedes gut, nach 3 Tagen in der Kultur für Zelle Kolonien unter Verwendung eines Mikroskops.
6. Entfernen Sie die Klebefolie von Platten. Eine einzelne Zelle Art von Interesse (hier Lin-CD34 + CD38-Zellen) in 92 von 96 Wells, aktivieren INDEX-Sortierung in der FACS sortieren Software, das Immunophenotypic-Profil von anderen Markern von Interesse (hier CD45RA, CD49f und CD90) für jede einzelne Zelle zu speichern.
7. Zwei Brunnen mit 10 und 20 Zellen bzw. für Linearität Steuerelemente in der PCR-Amplifikation zu sortieren. Wells H1 und H2 sind in der Regel verwendet.
8. Halten Sie zwei Brunnen ohne irgendwelche Zellen, wie keine-Template steuert in der Regel Wells H3 und H4.
9. Versiegeln Sie die Platten mit klaren Klebefilm und drehen Sie die Platten bei 300 X g für 1 min vor Snap auf Trockeneis einfrieren.
10. Speichern Sie gefrorene Platten bei-80 ° C.
    Hinweis: Sichere Haltepunkt. Sortiert und lysierten Zellen können bei-80 ° C für die Langzeitspeicherung aufbewahrt werden.

(4) reverse Transkription und zielgruppenspezifische Verstärkung

1. Bereiten Sie den Primer-Mix für alle 96 gen Ziele durch Zugabe von 2 µL jeder Primerpaar, einschließlich Housekeeping gen Primer und Primer für Spike-Steuerelement RNA, in eine 1,5 mL RNAse frei Rohr auf einer freien RNA/DNA-Bank. Wenn weniger als 96 Primer verwenden, fügen Sie gleichwertigem Umfang Nuklease freies Wasser für die fehlenden Primer hinzu. Primer sind separat zu bestellen das gewünschte gen Panel übereinstimmen.
2. Machen reversen Transkription und zielgruppenspezifische Verstärkung mix, indem 632.5 µL 2 x Reaktion Mischung, 101.2 µL Taq/SuperscriptIII, 151,8 µL-Primer-Mix und 0,7 µL Kontrolle RNA versetzt. Vorform dieser Schritt auf eine freie DNA-Bank. Mix von aufschütteln und Spinnen bis zu sammeln die Flüssigkeit in den Boden des Röhrchens. Halten Sie auf dem Eis bis hinaus auf die Probe.
3. Make keine-Reverse Transkription Kontrolle Mix für vier Brunnen durch das Mischen von 27,5 µL 2 x Reaktion Mischung, 1,76 µL Taq Enzym, 6,6 µL Grundierung-Mix und 2,64 µL Nuklease freies Wasser. Spike Kontrolle RNA. Führen Sie diesen Schritt auf einer freien DNA-Bank. Wirbel und Spin bis zu sammeln die Flüssigkeit in den Boden des Rohres und halten Sie auf dem Eis bis Zusatz zu probieren.
4. Lysate Platten auf Eis auftauen. 92 Brunnen, einschließlich der Linearität und nicht-Template-Kontrollen fügen Sie 8,75 µL der zuvor vorbereiteten reversen Transkription und zielgruppenspezifische Verstärkung Mix hinzu. Die vier verbleibenden Brunnen 8,75 µL des keine-Reverse Transkription Kontrolle Mix hinzufügen. Platten mit klaren Klebefilm und Spinnen bis zu sammeln Flüssigkeit an der Unterseite der Platten zu versiegeln.
5. Vorform reversen Transkription und zielgruppenspezifische Verstärkung durch die Platte in einer PCR-Maschine nach dem Preamp-Programm ausführen; Schritt 01:50 ° C für 60 min, Schritt 2: 95 ° C für 2 min, Schritt 3: 95 ° C für 15 s, Schritt 4: 60 ° C für 4 min, wiederholen Sie 3 bis 4 24 Schritte Mal und schließlich Schritt 5: 8 ° C für immer.
6. Nach PCR abgeschlossen ist, halten Sie die Platte bei 8 ° C für die kurzfristige Lagerung und-20 ° C für langfristige Lagerung.
   Hinweis: Sichere Haltepunkt. Verstärktes Material kann bei 8 ° C für eine kurzfristige Speicherung und bei-20 ° C für die Langzeitspeicherung gehalten werden.

5. Vorbereitung der Probe und Assay-Platten für Multiplex mikrofluidischen Gene Expression Analysis

1. Bereiten Assay Laden Platte durch Pipettieren 3 µL Assays laden Reagenz in jede Vertiefung eine 96-well-Platte. Individuelle Vertiefungen in der Probe Laden Platte fügen Sie 3 µL jedes Primers hinzu.
2. Dichtplatte mit Klebefolie und Spinnen bis zu sammeln Flüssigkeit an der Unterseite der Platten.
3. Bereiten Sie Verdünnung Platte durch Pipettieren 8 µL Nuklease freies Wasser in alle Vertiefungen einer 96-well-Platte. Verdünnung Plattenherstellung, eine endgültige Verdünnung von 1:5 fügen Sie 2 µL verstärkte Probe hinzu.
4. Dichtplatte mit Klebefolie, mischen durch Vortexen Platte für 10 s, und schließlich bis zu sammeln Flüssigkeit an der Unterseite der Platten drehen.
5. Bereiten Sie Probenbeladung Mischung sorgfältig 352 µL des master-Mix mit 35,2 µL Probe laden Reagenz vermischen. Bereiten Sie Probe Belastungsplatte durch Aliquotierung 3.3 µL Mischung in jede Vertiefung eine 96-well-Platte zu laden.
6. Fügen Sie 2.7 µL aus der verdünnten Probe in jede Vertiefung der Platte laden Probe hinzu.
7. Dichtplatte mit Klebefolie und Spinnen bis zu sammeln Flüssigkeit an der Unterseite der Platten.

6. Laden der Mikrofluidik-Chip

1. Nehmen Sie einen neuen 96 x 96 Mikrofluidik-Chip. Bereiten Sie Buchten durch stossen sie mit einer Spritze mit Kappe auf, um sicherzustellen, dass sie verschoben werden können.
2. Entfernen Sie Luftblasen von Spritzen. Jedes Ventil fügen Sie vollen Lautstärke von Spritzen während den Chip 45 Grad kippen und drücken Sie das Ventil hinzu. Prime-Chip mit der IFC-Controller.
3. Laden Sie jedes Assay-Einlass mit 4,25 µL aus jedem der Brunnen in der Probe, die Platte zu laden. Vermeiden Sie Luftblasen. Wenn im Brunnen Luftblasen, entfernen Sie diese mit einer Pipettenspitze.
4. Jede Probe Einlass mit 4,25 µL aus jedem der Brunnen in der Probe Laden Platte Laden fortsetzen, Luftblasen zu vermeiden und wenn Luftblasen, entfernen Sie diese mit Pipettenspitze.
5. Chip mit der IFC-Controller zu laden.
6. Überprüfen Sie, dass der Chip selbst sieht und alle Kammern geladen wurden. Entfernen Sie Staub von der Chipoberfläche durch Berühren mit Klebeband. Führen Sie den Chip in der Multiplex-mikrofluidischen gen Ausdruck Plattform.

7. laufende Chip auf Multiplex mikrofluidischen Gen-Expression-Plattform

1. Nach dem Laden Chip in die multiplex mikrofluidischen gen Ausdruck Plattform, nennen Sie die Probe.
2. Als passive Farbstoff ROX festgelegt. Stellen Sie einzelne Sonde und FAM-MGB als Fluoreszenz. Verwenden Sie 96 x 96 standard v2 als Protokoll. Starten Sie laufen.
3. Entfernen Sie Chip Ausführung ist abgeschlossen.

8. vorläufige Analyse der Chip Run

1. Laden Sie Daten in Real-Time PCR-Analyse-Software.
2. Laden Sie gen Namen und Zellnamen durch Einfügen von Zell- und Gentherapie Layouts aus einer Registerkarte getrennt-Datei.
3. Öffnen Sie Bildansicht und wählen Sie ROX als Farbstoff. Überprüfen Sie, ob alle Brunnen passive Farbstoff ROX haben.
4. Untersuchen Sie, ob alle Verstärkung Grundstücke in Ordnung, mit einer glatten Verstärkung Kurve mit keine Spikes (ähnlich wie Abbildung 3E) aussehen.
5. Sicherstellen Sie, dass alle Einzel-Zellen haben Ausdruck der Spike-Steuerelement RNA um sicherzustellen, dass alle ordnungsgemäß geladen wurden.
6. Sicherzustellen Sie, dass alle Zellen Zimmermädchen Genexpression und somit richtig sortiert wurden.
7. Sicherstellen Sie, dass 10 bis 20 Zelle Linearität Steuerelemente verfügen über ca. 1 CT Unterschied, lineare Verstärkung zu validieren.
8. Überprüfen Sie, ob Ausdruck in NoRT Kontrollproben. Wenn Ausdruck in NoRT erkannt wird Erwägung, Sonden, Sonden die genomischen DNA für die nachfolgenden Ausführungen nicht erkennen.
9. Exportieren Sie Daten in Csv-Dateien zur weiteren Analyse.

9. einzellige Analyse mit SCExV

Hinweis: Ein Einführungsfilm ist präsent²⁰ , das Werkzeug einzuführen. Hier ist eine kurze Empfehlung wie man Analyse mithilfe der Steuerelemente in das Protokoll eingeführt präsentiert.

1. Verbinden Sie mit der SCexV-Website-²⁰.
2. Hochladen Sie exportierte CSV-Dateien.
3. Die Spike-Steuerelement RNA als Positivkontrolle gewählt. Jede Zelle verfügt über ein Steuerelement RNA CT über 25 zu entfernen. Die Daten zum Median Ausdruck des Steuerelements RNA zu normalisieren.
4. Klicken Sie auf “-hier > Analyze”. NoRT, Notemplate, 10 und 20 Zelle Kontrollen in der Zelle-Option “ausschließen” zu entfernen.
5. Cluster-Zellen mit dem clustering Ansatz der Wahl mit der erwarteten Anzahl von Clustern. Exportieren Sie analysierte Werte.

10. Index-Sortierung Analyse

1. Öffnen Sie FACS-Analyse-Software und laden Sie die indizierten Proben.
2. Öffnen Sie den Skripteditor, und führen Sie das Skript verfügbar von Quinn J. Et al. ²¹
3. Nun, da die FACS-Analyse-Software ein Tor für jede einzelne Zelle gemacht haben sollte, Layout-Editor zu öffnen und Farbe der Zellen nach der Vereinigung von SCexV (erhältlich in der Datei mit dem Namen “Sample_complete_Data.xls”).

Representative Results

Discussion

In den letzten Jahren ist Ausdruck von einzelligen Genanalyse eine wertvolle Ergänzung zu definieren, die Heterogenität der einzelnen Zelle Bevölkerungen²³geworden. Das Aufkommen der RNA Sequenziertechnologien theoretisch bietet die Möglichkeit, das gesamte Transkriptom einer Zelle zu messen, aber diese Methoden durch Variationen in tiefen von Zelle zu Zelle Sequenzierung und Aussteiger kompliziert sind. Einzellige qPCR bietet eine sensible und robuste Analyse des Ausdrucks von Hunderten von kritischen Genen wo alle Zellen werden ebenso behandelt, technische Lärmminderung. Die zielgerichtete Analyse von einer begrenzten Anzahl von Abschriften ermöglicht darüber hinaus für eine vereinfachte Analyse ohne Einmischung von stark exprimierten Gene.

Da der Ansatz nur eine Teilmenge der Gene in den Zellen untersucht, ist es sehr wichtig, den richtigen Satz von Genen zu wählen, wenn das Gen-Panel zu entwerfen. Die Wahl von Genen kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden; durch Literatur, bisherigen Erkenntnissen durch Massenanalyse und Bioinformatik Analyse öffentlich verfügbarer Daten. Das ist nicht unbedeutend; mit den richtigen Satz von Genen kann jedoch der Ansatz sehr mächtig. Wenn das Gen-Panel entwickelt wurden, ist es wichtig zu überprüfen, ob die Primer während Multiplexen nicht beeinträchtigt werden. Hier empfehlen wir Analyse, wenn die Primer linear sind, durch eine Verdünnungsreihe mit reichlich Stoff Vorformen; eine Verdünnung, die Serie in dieser Studie verwendeten Primer in ergänzenden gezeigt ist Figur 2D in Warfvinge Et al. ²²

Die zwei wichtigsten Einschränkungen des hier vorgestellten Protokolls sind die begrenzte Anzahl von Zellen und Gene untersucht. Jedoch Obwohl bei jedem Durchlauf nur 96 Zellen untersucht werden, dieses relativ einfache Protokoll kann in einem Tag abgeschlossen werden und somit Hunderte von Zellen in einer Woche analysiert werden können. Darüber hinaus konnte die Anzahl der Gene untersucht gesteigert werden, wenn weitere Primer in der Target-spezifische Vorverstärkung Schritt enthalten sind. In diesem Fall sind mehrere Chips benötigt, um jeden Satz von 96 Primer zu untersuchen.

Wenn Gene oder Zellen mit stark ausgedrückt hohe RNA-Gehalt werden analysiert, die Anzahl der Zyklen optimiert für hämatopoetische Stammzellen mit niedrigen insgesamt gen Ausdruck²³ geändert werden sollte. Ändern Verstärkung Zyklen ist auch wichtig, bei der Untersuchung von Bulk-Populationen. Für Massenanalyse von hämatopoetischen Stammzellen (100 Zellen) empfehlen wir die Verringerung der Menge an Vorverstärkung Zyklen von 25 auf 18.

Die häufigsten Gründe für Fehler beim läuft aufgrund der erfolglosen Sortierung der Einzel-Zellen in den Brunnen der Lyse Platte, Sortierung der nicht lebensfähige Zellen, suboptimale Vorverstärkung oder Chip Ladefehler. Die Rox-Ebene in jede Reaktionskammer ist ein Indikator für die Belastung der Probe oder Assay, und wenn diese niedrig sind, es wird empfohlen, dass die Proben auf einem neuen Chip seit niedrigen Rox erneut ausgeführt werden, die Ebenen wahrscheinlich durch Einführung von Luftblasen während des Ladens verursacht sind. Mangel an dotierten Eingabesteuerelement RNA Ausdruck ist ein Indikator für das Pre-Amps sind gescheitert, wahrscheinlich aufgrund von Problemen mit Vorverstärkung- oder reverse Transkription Reagenzien. In diesem Fall empfiehlt es sich, dass ein neuer Chip mit neu sortierten Zellen und neue Reaktionspartner ausgeführt wird. Erkennung des Steuerelements RNA aber keine Anzeichen für andere Genexpression Signale Aufschluss über erfolglose einzellige FACS vor gen Expressionsanalyse Sortierung ist. Zur Vermeidung von Fehlern während der FACS sortieren es ist darauf zu achten, dass die einzelnen Zellen in der Mitte jedes gut sortiert sind. Dies kann durch Sortieren von Perlen in einen leeren Teller und visuell prüfen, wo der Tropfen landet. Achten Sie darauf, Test-Art in alle Vertiefungen in die Kanten der Platte um sicherzustellen, dass die Einrichtung nicht nur für die ersten paar Brunnen stimmt. Wenn zutreffend, Einzel-Zellen können parallel für in-vitro- Wachstum sortiert und analysiert vor der qPCR Analyse zur Kontrolle für erfolgreiche Sortierung Protokolle. Index-Sortierung Informationen lässt sich nicht nur für die Untersuchung der Immunophenotyped von einer molekular unterschiedliche Subpopulation aber bieten auch nützliche Erkenntnisse bei der Problembehandlung Wenn Sie einer undefinierten Bevölkerung sortieren und viele minderwertige Zellen sind in den einzelligen Genanalyse Ausdruck vorhanden. Die Index-Sortierung Informationen lässt sich die gating-Strategie zu optimieren und zukünftige Sortierung von minderwertigen Zellen zu vermeiden.

Einzellige gen Expressionsanalyse revolutioniert wie heterogen Zelle Populationen untersucht werden und ebnet den Weg für das weitere Verständnis der Zelldifferenzierung. In Hämatopoese einzellige gen Expressionsanalyse verwendet wurden, um Sortierstrategien für Teilmengen von HSZ⁷, zu verfeinern, um die Heterogenität der multipotenten Vorläuferzellen Populationen^6,24,25 zu beheben , und Therapie unempfindlich leukämischen Stammzellen Populationen^22,26zu identifizieren. Kombination von Index sortieren mit einzelligen gen – Expression und Funktionsanalyse hat zuvor nachweislich zuverlässig und effizient bei der Untersuchung von Immunophenotype und Heterogenität der verschiedenen Populationen^{27, 28,29}. Hier, einen Ansatz für die Untersuchung von molekularen und Immunophenotypic Heterogenität der Zelle Bevölkerungen wurden beschrieben in der Kombination von einzelligen qPCR mit Index sortieren ermöglicht schnelle und reproduzierbare Ergebnisse ohne komplizierte Analyse in kurzer Zeitrahmen.

Materials

CD14 PECY5	eBioscience	15-0149-42	Clone: 61D3
CD16 PECY5	Biolegend	302010	Clone: 3G8
CD56 PECY5	Biolegend	304608	Clone: MEM-188
CD19 PECY5	Biolegend	302210	Clone: HIB19
CD2 PECY5	Biolegend	300210	Clone: RPA-2.10
CD3 PECY5	Biolegend	300310	Clone: HIT3a
CD123 PECY5	Biolegend	306008	Clone: 6H6
CD235A PECY5	BD Pharma	559944	Clone GAR2
CD34 FITC	Biolegend	343604	Clone: 561
CD38 APC	Biolegend	303510	Clone: Hit2
CD90 PE	Biolegend	328110	Clone: 5E10
CD45RA BV421	BD bioscience	560362	Clone: HI100
CD49f Pecy7	eBioscience	25-0495-82	Clone: eBioGOH3
FBS	HyClone	SV30160.3
PBS	HyClone	SH30028.02
96-well u-bottom Plate	VWR	10861-564
SFEM	Stem cell technologies	9650
Penicillin streptomycin	HyClone	SV30010
TPO	Peprotech	300-18
SCF	Peprotech	300-07
FLT3L	Peprotech	300-19
Falcon Tube 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Eppendorph tube	Sarstedt	72.690.001
CST beads	BD	642412
Accudrop Beads	BD	345249	6 µm particles 
Adhesive film Clear	Thermo scientific 	AB-1170
Adhesive film Foil	Thermo scientific 	AB-0626
96 well PCR plate	Axygen	PCR-96M2-HS-C
PCR 1.5 mL tube	Axygen	MCT-150-L-C
T100 PCR cycler	BioRad	186-1096
10% NP40	Thermo scientific 	85124
10 mM dNTP	Takara	4030
0.1 M DTT	Invitrogen	P2325
RNAsout	Invitrogen	10777-019	RNAse inhibitor
CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen	11753-100
Neuclease free water	Invitrogen	11753-100	from CellsDirect kit
2x Reaction Mix	Invitrogen	11753-100	from CellsDirect kit
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix	Invitrogen	11753-100	from CellsDirect kit
Platinum Taq DNA Polymerase	Invitrogen	10966026
TaqMan Cells-to-CT Control Kit	Invitrogen	4386995
Xeno RNA Control	Invitrogen	4386995	From TaqMan Cells-to-CT Control Kit
20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay	Invitrogen	4386995	From TaqMan Cells-to-CT Control Kit
96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs	Fluidigm	BMK-M10-96.96
2x Assay Loading Reagent	Fluidigm		From 96.96 Sample/Loading Kit
20x GE Sample Loading Reagent	Fluidigm		From 96.96 Sample/Loading Kit
Control line fluid 	Fluidigm		From 96.96 Sample/Loading Kit
TaqMan Gene Expression Master Mix	Applied Biosystems	4369016
BioMark HD	Fluidigm	BMKHD-BMKHD
96.96 Dynamic Array IFC	Fluidigm	BMK-M10-96.96GT
Excel	Microsoft	Microsoft
FlowJo V10	TreeStar	TreeStar
Fluidigm real time PCR analysis	Fluidigm	Fluidigm
CD179a.VPREB1	Thermofisher scientific	Hs00356766_g1
ACE	Thermofisher scientific	Hs00174179_m1
AHR	Thermofisher scientific	Hs00169233_m1
BCR_ABL.52	Thermofisher scientific	Hs03043652_ft
BCR_ABL41	Thermofisher scientific	Hs03024541_ft
BMI1	Thermofisher scientific	Hs00995536_m1
CCNA2	Thermofisher scientific	Hs00996788_m1
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CCNB2	Thermofisher scientific	Hs01084593_g1
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