Methodenartikel

Eine kombinatorische einzellige Ansatz zur molekularen Charakterisierung und Immunophenotypic Heterogenität der menschlichen Stammzellen und Vorläuferzellen Populationen

DOI:

10.3791/57831

⸱

25. Oktober 2018

 ,  ,  , 
1Division of Molecular Hematology, Lund Stem Cell Center, Lund University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bulk-gen Ausdruck Messungen Wolke Einzelzelle Unterschiede in heterogenen Zellpopulationen. Hier beschreiben wir ein Protokoll wie einzellige gen Expressionsanalyse und Index Sortierung durch die Blüte aktiviert Zelle sortieren (FACS) kann kombiniert werden, um die Heterogenität zu umreißen und immunophenotypisch charakterisieren molekular unterschiedliche Zellpopulationen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunophenotypic Charakterisierung und molekulare Analyse haben seit langem verwendet, um abzugrenzen Heterogenität und unterschiedliche Zellpopulationen zu definieren. FACS ist von Natur aus eine einzellige Assay, molekulare Analyse jedoch vor, die Zielzellen oft prospektiv in loser Schüttung, isoliert werden dadurch verlieren einzellige Auflösung. Einzellige gen Expressionsanalyse bietet die Möglichkeit, molekulare Unterschiede zwischen einzelnen Zellen in heterogenen Zellpopulationen zu verstehen. In Zelle Massenanalyse ergibt eine Überrepräsentation von einem deutlichen Zelltyp Vorurteile und Gefäßverschlüsse von Signalen von seltenen Zellen mit biologischer Bedeutung. Durch die Verwendung von FACS Index sortieren gekoppelt mit einzelligen gen Expressionsanalyse, Populationen untersucht werden können ohne den Verlust von einzelligen Auflösung während Zellen mit mittleren Zelle Oberfläche Marker Ausdruck auch erfasst werden, ermöglichen die Bewertung der die Relevanz der kontinuierliche Oberfläche Marker Ausdruck. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der reversen Transkription einzellige kombiniert quantitative PCR (RT-qPCR) und FACS index sortieren gleichzeitig die molekulare Charakterisierung und Immunophenotypic Heterogenität innerhalb Zell-Populationen.

Im Gegensatz zu den einzelligen RNA Sequenzierung Methoden ermöglicht die Verwendung von qPCR mit zielgruppenspezifischen Verstärkung für robuste Messungen von niedrig-Fülle Transkripte mit weniger Aussetzer, während es durch Probleme im Zusammenhang mit Variationen von Zelle zu Zelle lesen Sie nicht verwechselt wird Tiefe. Darüber hinaus direkt Index-Sortierung Einzel-Zellen in Lyse-diese Methode Puffer, ermöglicht durch cDNA Synthese und zielgruppenspezifische Vorverstärkung in einem Schritt sowie für die Korrelation der später abgeleiteten molekulare Signaturen mit Zelloberfläche durchgeführt werden Marker-Ausdruck. Die beschriebene Vorgehensweise wurde entwickelt, um hämatopoetischen Einzel-Zellen zu untersuchen, aber haben auch erfolgreich auf andere Zelltypen eingesetzt.

Abschließend ermöglicht der hierin beschriebene Ansatz für empfindliche Messung der mRNA Ausdruck für ein Panel der vorgewählten Gene mit der Möglichkeit, Protokolle für angehende isoliert von molekular unterschiedliche Subpopulationen zu entwickeln.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jede einzelne Blutzelle wird geglaubt, um in einer zellulären Hierarchie befinden wo Stammzellen bilden die Spitze auf der Oberseite eine Reihe von zunehmend engagierte fortgeschrittene Stammväter, die schließlich unheilbar in die endgültige Effektorzellen mit spezifischen unterscheiden biologische Funktionen1. Viel von dem Wissen über Stammzellen Systeme wie organisiert sind wurde im blutbildenden System, vor allem wegen der Fähigkeit, unterschiedliche hämatopoetische Populationen hochangereichertes für Stammzellen oder verschiedene Vorfahren2 prospektiv isolieren generiert durch FACS sortieren. Dies hat für viele dieser Populationen erlaubt, funktional oder molekular, überwiegend durch gen-Expressions-profiling3,4analysiert werden. Aber wenn Analyse der Genexpression von Schüttgut Populationen individuelle Unterschiede zwischen den Zellen sind gemittelt und verlor5. So kann Arbeitsunfähigkeit, Zell-Zell-Varianten in heterogenen Zelle Bruchteilen zu erkennen unser Verständnis der kritischen biologischen Prozesse verwirren, wenn kleine Teilmengen von Zellen für die abgeleitete biologische Funktion von dieser Bevölkerung6zu berücksichtigen, 7. Umgekehrt, Untersuchung von gen-Ausdruck-Signaturen bei einzelligen Auflösung bieten die Möglichkeit zu Heterogenität abzugrenzen und zu überschatten Einflüsse aus überrepräsentiert Teilmengen von Zellen8umgehen.

Bisher wurden viele Protokolle für einzellige gen Expressionsanalyse entwickelt; mit jeder dieser Ansätze hat seine eigenen Vorbehalte. Die früheste Methode wurde RNA Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (RNA-Fisch), die eine begrenzte Anzahl von Abschriften zu einem Zeitpunkt misst, sondern ist einzigartig, da es ermöglicht die Untersuchung von RNA Lokalisierung9,11. Frühe Methoden mittels PCR und qPCR um zu erkennen, dass ein einzelnes oder wenige Abschriften wurden auch entwickelt,12. Jedoch haben diese in letzter Zeit durch Mikrofluidik-basierte Methoden ersetzt, die gleichzeitig Ausdruck von Hunderten von Abschriften pro Zelle in Hunderten von Zellen durch qPCR analysieren können und ermöglichen so hochdimensionalen Heterogenität-Analyse mit gen Platten10,13im Vorhinein festgelegt. Vor kurzem RNA Sequenzierung basierenden Technologien haben werden am meisten benutzt für Einzelzelle Analyse, wie diese können theoretisch das ganze Transkriptom einer Zelle zu messen und dadurch eine explorative Dimension Heterogenität Analyse10, verleihen 14. Multiplexed qPCR Analyse und einzellige RNA Sequenzierung haben unterschiedliche Eigenschaften, so die Begründung für die Verwendung einer der Methoden hängt die Frage sowie die Anzahl der Zellen in der Zielpopulation. Hochdurchsatz- und low-cost pro Zelle zusammen mit unvoreingenommenen, explorative Eigenschaften der einzelligen RNA Sequenzierung sind erwünscht, wenn unbekannte Zelle oder große Populationen untersucht werden. Allerdings ist einzellige RNA Sequenzierung auch voreingenommen gegenüber Sequenzierung hohe reichliche Abschriften häufiger während Transkripte mit niedrigen Fülle anfällig für Ausfälle sind. Dies führt zu erheblich komplexer Daten, das stellt hohe Anforderungen an bioinformatische Analyse wichtige molekulare Signale zeigen, die oft subtil oder in technischen Lärm15verborgen sind. Also für gut charakterisierten Gewebe einzellige qPCR-Analyse mit vorbestimmt Primer Platten ausgewählt für funktionell wichtige Gene oder molekulare Marker können als ein sensibler, unkomplizierte Konzept zur Bestimmung der Heterogenität der dienen ein Bevölkerung. Allerdings ist anzumerken, dass im Vergleich zu einzellige RNA-FF, die Kosten pro Zelle ist im Allgemeinen höher für einzellige qPCR Methoden. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der einzelligen RT-qPCR (geändert von Teles J. Et Al. kombiniert ( 16), FACS Index gleichzeitig17 und Bioinformatik Analyse18 zur Sortierung die molekularen und Immunophenotypic Heterogenität innerhalb von Populationen zu charakterisieren.

Bei diesem Ansatz die Zellpopulation des Interesses ist befleckt und Einzel-Zellen sind durch FACS direkt in Lyse Puffer in 96-Well-PCR-Platten sortiert. Gleichzeitig sind Ausdruck eines zusätzlichen Satzes der Zelloberfläche Marker für jede einzelne Zelle bei der FACS-Sortierung, eine Methode Drittel über dem Niveau, die als Index-Sortierung bezeichnet wird. Das lysierten Zellmaterial wird anschließend verstärkt und die Genexpression eine ausgewählte Gruppe von Genen mit RT-qPCR, mithilfe einer mikrofluidischen Plattform analysiert. Diese Strategie ermöglicht molekulare Analyse der sortierten einzellige sowie gleichzeitige Charakterisierung von jeder einzelnen Zelle Zelloberfläche Marker Ausdruck. Indem Sie direkt zuordnen molekular unterschiedliche Teilmengen von Zellen des Ausdrucks der indizierten sortierte Marker, können die Subpopulationen mit einer bestimmten Immunophenotype verknüpft werden, die für ihre zukünftigen Isolation verwendet werden können. Die Methode wird erläutert Schritt für Schritt in Abbildung 1. Eine vorbestimmte gen Gremium trägt eine höhere Auflösung der gezielten Genexpression, da sie Messung irrelevant reichlich Gene umgeht, die sonst feine gen Ausdruck Signale verdecken können. Robuste Messung von niedrigen ausgedrückt Transkripte, wie Transkriptionsfaktoren oder nicht-Poly-Adenylated-RNAs ermöglicht darüber hinaus der zielgruppenspezifischen Verstärkung, einen Schritt reversen Transkription und Verstärkung. Wichtig ist, zulassen qPCR Methoden für die Messung der mRNA von Schmelzverfahren Proteine, die wichtig sind bei der Untersuchung von bestimmten bösartigen Erkrankungen19. Zu guter Letzt die fokussierte Zahl der Gene untersucht, geringe Drop-out-Raten und begrenzten technischen Unterschiede zwischen den Zellen machen diese Methode leicht analysiert im Vergleich zu höher dimensionale Methoden, z. B. einzellige RNA-seq. Anhand des Protokolls kann eine gesamte Experiment durchgeführt werden, von der Sortierung Zellen analysierten Ergebnisse innerhalb von drei Tagen, so dass dies eine unkomplizierte und schnelle Methode für sensible, Hochdurchsatz einzellige Ausdruck Genanalyse.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Vorbereitung der Lyse Platten

  1. Mit Hilfe einer RNA/DNA-freie Bank vorbereiten genug Lyse Puffer 96 Wells, mit 10 % extra, durch das Mischen von 390 µL Nuklease freies Wasser, 17 µL 10 % NP-40, 2,8 µL 10 mM dNTP, 10 µL 0.1 M DTT und 5.3 µL RNAse-Inhibitor (siehe Tabelle der Materialien). Wirbel und Spin-down.
  2. Verteilen Sie 4 µL Lyse Puffer in jede Vertiefung eine 96 well PCR-Platte zu und verschließen Sie die Platten mit Klebefolie. Spin-down Röhren Flüssigkeit an der Unterseite der Platten zu sammeln. Halten Sie die Platten auf Eis bis Zelle sortieren (max. 24 h).

2. Vorbereitung der Zellen Zellsortierung

  1. Tauen Sie entsprechende Anzahl von Zellen (hier, CD34 angereicherten hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen) für das Experiment. 1 x 106 Zellen eignen sich für die Sortierung etwa drei 96-Well-Platten von Einzel-Zellen mit Steuerelementen.
  2. Aufgetaute Zellen auf eine 15 mL konische Rohr übertragen und 1 mL EB alle 30 s bis ein Gesamtvolumen von 8 mL erreicht ist. Zellen in einer Zentrifuge bei 350 X g für 10 min bei 4 ° C drehen und überstand zu entfernen.
  3. Aufschwemmen Zellen in 8 mL Puffer Färbung (PBS mit 2 % FBS) und 350 X g für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert und überstand zu entfernen.
  4. Aufschwemmen Zellen in 200 µL Färbung Puffern und Zellen für Kontrolle Flecken zu entfernen.
  5. Machen Fluoreszenz abzüglich einer Steuerelemente (RGV) für jede Fluorophor durch Färbung ein Bruch der Zellen in 50 µL Puffer Färbung. In diesem Beispiel werden 6 Mikrozentrifugenröhrchen mit 20.000 Zellen als FMOSs verwendet. Beachten Sie, dass die Anzahl der Zellen abhängig von der untersuchten Bevölkerung angepasst werden soll. Fügen Sie alle Antikörper bei der gleichen Konzentration wie in der Probe Fleck mit Ausnahme eines für jedes Rohr.
  6. Stellen Sie einzelne Flecken für jedes Fluorophor durch Färbung einen Bruchteil der Zellen in 50 µL Puffer für jede Fluorophor verwendet. In diesem Beispiel werden 6 Mikrozentrifugenröhrchen mit 20.000 Zellen verwendet. Beachten Sie, dass das Ziel für jeden Antikörper durch die Zellen benutzt für Steuerelemente zum Ausdruck gebracht werden muss. Fügen Sie jeder Antikörper bei der gleichen Konzentration wie in der Probe Fleck in Einzelrohren. Zusätzlich halten Sie 20.000 ungefärbte Zellen in 50 µL als ungefärbten Kontrolle.
  7. Die Zellprobe fügen Sie Antikörper in ihrer entsprechenden Konzentration hinzu. Verwendet hier sind CD34-FITC in einer Konzentration von 1/100, CD38-APC 1/50, CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 und Lineage Mix: CD3-PECy5 1/50, CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50 und CD235a-PECy5 1/1000.
  8. Inkubieren Sie Zellen mit Antikörpern für 30 min auf Eis im Dunkeln.
  9. Waschen Sie Zellen mit 3 mL Puffer Färbung. Zellen bei 350 X g für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert und überstand zu entfernen.
  10. Aufschwemmen Sie Zellen und wiederholen Sie Schritt 2,9.
  11. Aufschwemmen Probe in 500 µL und RGV in 100 µL Puffer mit 1/100 7AAD und Filter Zellen durch einen 50 µm Filter eine einzellige Aussetzung zu beflecken.

(3) Zellsortierung

  1. Stellen Sie sicher, dass das FACS-Gerät konfiguriert ist korrekt mit Drop Verzögerung und Cytometer Setup und tracking (CST), die vor kurzem durchgeführt worden sind, nach Angaben des Herstellers, um sicherzustellen, dass die entsprechenden Zellen sortiert werden. Für hämatopoetische Zellen empfiehlt die Verwendung der 85 Mikron Düse und maximale Geschwindigkeit von 4, während die optimale Ereignisrate zwischen 800 und 2000 Ereignisse/s ist.
  2. Spektrale Überlappung durch Fluoreszenz Kompensation ausführen korrigieren und Tore nach FMO Steuerelemente oder negative Kontrollen festgelegt.
  3. Durchführen Sie Reanalyse der Zielgruppe durch mindestens 100 Zielzellen zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch mit 100 µL Puffer Fleck Sortierung. FACS der sortierten Zellen durch Aufnahme der sortierte Probe zu analysieren und stellen Sie sicher, dass sie am Ende in der Art Tor.
  4. Set-up einzigen Zellplatte Sortierung nach Zentrierung des Rückgangs auch A1 in einer 96-well-Platte. Wenn es zentriert ist, sortieren Sie, 50 – 100 6 µm Partikel in alle Vertiefungen an den Rändern der eine leere 96-well-Platte um sicherzustellen, dass alle Brunnen eine Zelle in der Mitte jedes gut erhalten.
  5. Wenn möglich, kann eine zusätzliche Kontrolle, um sicherzustellen, dass lebensfähige Zellen sortiert werden durch Sortierung Einzel-Zellen in Vitro Wachstum hinzugefügt werden. Hämatopoetische Zellen können in U-Boden-96-well-Platten in 100 µl SFEM mit 1 % Penicillin-Streptomycin, 100 ng/mL FLT3L, TPO und SCF angebaut werden. Analysieren Sie jedes gut, nach 3 Tagen in der Kultur für Zelle Kolonien unter Verwendung eines Mikroskops.
  6. Entfernen Sie die Klebefolie von Platten. Eine einzelne Zelle Art von Interesse (hier Lin-CD34 + CD38-Zellen) in 92 von 96 Wells, aktivieren INDEX-Sortierung in der FACS sortieren Software, das Immunophenotypic-Profil von anderen Markern von Interesse (hier CD45RA, CD49f und CD90) für jede einzelne Zelle zu speichern.
  7. Zwei Brunnen mit 10 und 20 Zellen bzw. für Linearität Steuerelemente in der PCR-Amplifikation zu sortieren. Wells H1 und H2 sind in der Regel verwendet.
  8. Halten Sie zwei Brunnen ohne irgendwelche Zellen, wie keine-Template steuert in der Regel Wells H3 und H4.
  9. Versiegeln Sie die Platten mit klaren Klebefilm und drehen Sie die Platten bei 300 X g für 1 min vor Snap auf Trockeneis einfrieren.
  10. Speichern Sie gefrorene Platten bei-80 ° C.
    Hinweis: Sichere Haltepunkt. Sortiert und lysierten Zellen können bei-80 ° C für die Langzeitspeicherung aufbewahrt werden.

(4) reverse Transkription und zielgruppenspezifische Verstärkung

  1. Bereiten Sie den Primer-Mix für alle 96 gen Ziele durch Zugabe von 2 µL jeder Primerpaar, einschließlich Housekeeping gen Primer und Primer für Spike-Steuerelement RNA, in eine 1,5 mL RNAse frei Rohr auf einer freien RNA/DNA-Bank. Wenn weniger als 96 Primer verwenden, fügen Sie gleichwertigem Umfang Nuklease freies Wasser für die fehlenden Primer hinzu. Primer sind separat zu bestellen das gewünschte gen Panel übereinstimmen.
  2. Machen reversen Transkription und zielgruppenspezifische Verstärkung mix, indem 632.5 µL 2 x Reaktion Mischung, 101.2 µL Taq/SuperscriptIII, 151,8 µL-Primer-Mix und 0,7 µL Kontrolle RNA versetzt. Vorform dieser Schritt auf eine freie DNA-Bank. Mix von aufschütteln und Spinnen bis zu sammeln die Flüssigkeit in den Boden des Röhrchens. Halten Sie auf dem Eis bis hinaus auf die Probe.
  3. Make keine-Reverse Transkription Kontrolle Mix für vier Brunnen durch das Mischen von 27,5 µL 2 x Reaktion Mischung, 1,76 µL Taq Enzym, 6,6 µL Grundierung-Mix und 2,64 µL Nuklease freies Wasser. Spike Kontrolle RNA. Führen Sie diesen Schritt auf einer freien DNA-Bank. Wirbel und Spin bis zu sammeln die Flüssigkeit in den Boden des Rohres und halten Sie auf dem Eis bis Zusatz zu probieren.
  4. Lysate Platten auf Eis auftauen. 92 Brunnen, einschließlich der Linearität und nicht-Template-Kontrollen fügen Sie 8,75 µL der zuvor vorbereiteten reversen Transkription und zielgruppenspezifische Verstärkung Mix hinzu. Die vier verbleibenden Brunnen 8,75 µL des keine-Reverse Transkription Kontrolle Mix hinzufügen. Platten mit klaren Klebefilm und Spinnen bis zu sammeln Flüssigkeit an der Unterseite der Platten zu versiegeln.
  5. Vorform reversen Transkription und zielgruppenspezifische Verstärkung durch die Platte in einer PCR-Maschine nach dem Preamp-Programm ausführen; Schritt 01:50 ° C für 60 min, Schritt 2: 95 ° C für 2 min, Schritt 3: 95 ° C für 15 s, Schritt 4: 60 ° C für 4 min, wiederholen Sie 3 bis 4 24 Schritte Mal und schließlich Schritt 5: 8 ° C für immer.
  6. Nach PCR abgeschlossen ist, halten Sie die Platte bei 8 ° C für die kurzfristige Lagerung und-20 ° C für langfristige Lagerung.
    Hinweis: Sichere Haltepunkt. Verstärktes Material kann bei 8 ° C für eine kurzfristige Speicherung und bei-20 ° C für die Langzeitspeicherung gehalten werden.

5. Vorbereitung der Probe und Assay-Platten für Multiplex mikrofluidischen Gene Expression Analysis

  1. Bereiten Assay Laden Platte durch Pipettieren 3 µL Assays laden Reagenz in jede Vertiefung eine 96-well-Platte. Individuelle Vertiefungen in der Probe Laden Platte fügen Sie 3 µL jedes Primers hinzu.
  2. Dichtplatte mit Klebefolie und Spinnen bis zu sammeln Flüssigkeit an der Unterseite der Platten.
  3. Bereiten Sie Verdünnung Platte durch Pipettieren 8 µL Nuklease freies Wasser in alle Vertiefungen einer 96-well-Platte. Verdünnung Plattenherstellung, eine endgültige Verdünnung von 1:5 fügen Sie 2 µL verstärkte Probe hinzu.
  4. Dichtplatte mit Klebefolie, mischen durch Vortexen Platte für 10 s, und schließlich bis zu sammeln Flüssigkeit an der Unterseite der Platten drehen.
  5. Bereiten Sie Probenbeladung Mischung sorgfältig 352 µL des master-Mix mit 35,2 µL Probe laden Reagenz vermischen. Bereiten Sie Probe Belastungsplatte durch Aliquotierung 3.3 µL Mischung in jede Vertiefung eine 96-well-Platte zu laden.
  6. Fügen Sie 2.7 µL aus der verdünnten Probe in jede Vertiefung der Platte laden Probe hinzu.
  7. Dichtplatte mit Klebefolie und Spinnen bis zu sammeln Flüssigkeit an der Unterseite der Platten.

6. Laden der Mikrofluidik-Chip

  1. Nehmen Sie einen neuen 96 x 96 Mikrofluidik-Chip. Bereiten Sie Buchten durch stossen sie mit einer Spritze mit Kappe auf, um sicherzustellen, dass sie verschoben werden können.
  2. Entfernen Sie Luftblasen von Spritzen. Jedes Ventil fügen Sie vollen Lautstärke von Spritzen während den Chip 45 Grad kippen und drücken Sie das Ventil hinzu. Prime-Chip mit der IFC-Controller.
  3. Laden Sie jedes Assay-Einlass mit 4,25 µL aus jedem der Brunnen in der Probe, die Platte zu laden. Vermeiden Sie Luftblasen. Wenn im Brunnen Luftblasen, entfernen Sie diese mit einer Pipettenspitze.
  4. Jede Probe Einlass mit 4,25 µL aus jedem der Brunnen in der Probe Laden Platte Laden fortsetzen, Luftblasen zu vermeiden und wenn Luftblasen, entfernen Sie diese mit Pipettenspitze.
  5. Chip mit der IFC-Controller zu laden.
  6. Überprüfen Sie, dass der Chip selbst sieht und alle Kammern geladen wurden. Entfernen Sie Staub von der Chipoberfläche durch Berühren mit Klebeband. Führen Sie den Chip in der Multiplex-mikrofluidischen gen Ausdruck Plattform.

7. laufende Chip auf Multiplex mikrofluidischen Gen-Expression-Plattform

  1. Nach dem Laden Chip in die multiplex mikrofluidischen gen Ausdruck Plattform, nennen Sie die Probe.
  2. Als passive Farbstoff ROX festgelegt. Stellen Sie einzelne Sonde und FAM-MGB als Fluoreszenz. Verwenden Sie 96 x 96 standard v2 als Protokoll. Starten Sie laufen.
  3. Entfernen Sie Chip Ausführung ist abgeschlossen.

8. vorläufige Analyse der Chip Run

  1. Laden Sie Daten in Real-Time PCR-Analyse-Software.
  2. Laden Sie gen Namen und Zellnamen durch Einfügen von Zell- und Gentherapie Layouts aus einer Registerkarte getrennt-Datei.
  3. Öffnen Sie Bildansicht und wählen Sie ROX als Farbstoff. Überprüfen Sie, ob alle Brunnen passive Farbstoff ROX haben.
  4. Untersuchen Sie, ob alle Verstärkung Grundstücke in Ordnung, mit einer glatten Verstärkung Kurve mit keine Spikes (ähnlich wie Abbildung 3E) aussehen.
  5. Sicherstellen Sie, dass alle Einzel-Zellen haben Ausdruck der Spike-Steuerelement RNA um sicherzustellen, dass alle ordnungsgemäß geladen wurden.
  6. Sicherzustellen Sie, dass alle Zellen Zimmermädchen Genexpression und somit richtig sortiert wurden.
  7. Sicherstellen Sie, dass 10 bis 20 Zelle Linearität Steuerelemente verfügen über ca. 1 CT Unterschied, lineare Verstärkung zu validieren.
  8. Überprüfen Sie, ob Ausdruck in NoRT Kontrollproben. Wenn Ausdruck in NoRT erkannt wird Erwägung, Sonden, Sonden die genomischen DNA für die nachfolgenden Ausführungen nicht erkennen.
  9. Exportieren Sie Daten in Csv-Dateien zur weiteren Analyse.

9. einzellige Analyse mit SCExV

Hinweis: Ein Einführungsfilm ist präsent20 , das Werkzeug einzuführen. Hier ist eine kurze Empfehlung wie man Analyse mithilfe der Steuerelemente in das Protokoll eingeführt präsentiert.

  1. Verbinden Sie mit der SCexV-Website-20.
  2. Hochladen Sie exportierte CSV-Dateien.
  3. Die Spike-Steuerelement RNA als Positivkontrolle gewählt. Jede Zelle verfügt über ein Steuerelement RNA CT über 25 zu entfernen. Die Daten zum Median Ausdruck des Steuerelements RNA zu normalisieren.
  4. Klicken Sie auf "-hier > Analyze". NoRT, Notemplate, 10 und 20 Zelle Kontrollen in der Zelle-Option "ausschließen" zu entfernen.
  5. Cluster-Zellen mit dem clustering Ansatz der Wahl mit der erwarteten Anzahl von Clustern. Exportieren Sie analysierte Werte.

10. Index-Sortierung Analyse

  1. Öffnen Sie FACS-Analyse-Software und laden Sie die indizierten Proben.
  2. Öffnen Sie den Skripteditor, und führen Sie das Skript verfügbar von Quinn J. Et al. 21
  3. Nun, da die FACS-Analyse-Software ein Tor für jede einzelne Zelle gemacht haben sollte, Layout-Editor zu öffnen und Farbe der Zellen nach der Vereinigung von SCexV (erhältlich in der Datei mit dem Namen "Sample_complete_Data.xls").

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Protokoll beschrieben ist sehr zuverlässig, schnell und problemlos durchgeführt. Ein Überblick über die Versuchsanordnung ist in Abbildung 1dargestellt. Das gesamte Protokoll von der Sortierung der Einzel-Zellen gezielt Verstärkung, gen-Ausdruck-Messungen und vorläufige Analyse kann in drei Tagen durchgeführt werden. Ein Beispiel der analysierten Ergebnisse in Form einer Heatmap, die vorläufige analysierte Daten von einzelligen Ausdruck Genanalyse mit 96 ...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In den letzten Jahren ist Ausdruck von einzelligen Genanalyse eine wertvolle Ergänzung zu definieren, die Heterogenität der einzelnen Zelle Bevölkerungen23geworden. Das Aufkommen der RNA Sequenziertechnologien theoretisch bietet die Möglichkeit, das gesamte Transkriptom einer Zelle zu messen, aber diese Methoden durch Variationen in tiefen von Zelle zu Zelle Sequenzierung und Aussteiger kompliziert sind. Einzellige qPCR bietet eine sensible und robuste Analyse des Ausdrucks von Hunderten von kriti...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wird durch Zuschüsse vom schwedischen Krebsgesellschaft, The Swedish Research Council, der schwedischen Gesellschaft für medizinische Forschung, die schwedische Kinderkrebsstiftung, die Ragnar Söderberg Foundation, und The Knut und Alice Wallenberg Foundation unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CD14 PECY5eBioscience15-0149-42Klon: 61D3
CD16 PECY5Biolegend302010Klon: 3G8
CD56 PECY5 Biolegend304608Klon: MEM-188
CD19 PECY5Biolegend302210Klon: HIB19
CD2 PECY5Biolegend300210Klon: RPA-2.10
CD3 PECY5Biolegend300310Klon: HIT3a
CD123 PECY5 Biolegend306008Klon: 6H6
CD235A PECY5BD Pharma559944Klon GAR2
CD34 FITCBiolegend343604Klon: 561
CD38 APCBiolegend303510Klon: Hit2
CD90 PEBiolegend328110Klon: 5E10
CD45RA BV421BD bioscience560362Klon: HI100
CD49f Pecy7eBioscience25-0495-82Klon: eBioGOH3
FBSHyCloneSV30160.3
PBSHyCloneSH30028.02
96-Well-U-BodenplatteVWR10861-564
SFEMStammzelltechnologien9650
Penicillin-StreptomycinHyCloneSV30010
TPOPeprotech300-18
SCFPeprotech300-07
FLT3LPeprotech300-19
Falcon Tube 15 mLSarstedt62.554.502
Eppendorph TubeSarstedt72.690.001
CST KügelchenBD
Accudrop PerlenBD3452496 µ m Partikel 
Klebefolie ClearThermo scientificAB-1170
KlebefolieThermo scientific  AB-0626
96-Well-PCR-PlatteAxygenPCR-96M2-HS-C
PCR 1,5 mL RöhrchenAxygenMCT-150-L-C
T100 PCR-CyclerBioRad186-1096
10% NP40Thermo wissenschaftlich 85124
10 mM dNTPTakara4030
0,1 M DTTInvitrogenP2325
RNAsoutInvitrogen10777-019RNAse
Inhibitor CellsDirect One-Step qRT-PCR KitInvitrogen11753-100
Neuclease freies WasserInvitrogen11753-100aus CellsDirect Kit
2x ReaktionsmixInvitrogen11753-100aus dem CellsDirect Kit
SuperScript III RT/Platinum Taq MixInvitrogen11753-100aus dem CellsDirect Kit
Platin  Taq  DNA-PolymeraseInvitrogen10966026
TaqMan Cells-to-CT Control KitInvitrogen4386995
Xeno RNA ControlInvitrogen4386995From TaqMan Cells-to-CT Control
20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression AssayInvitrogen4386995From TaqMan Cells-to-CT Control Kit
96.96 Sample/Loading Kit– 10 IFCsFluidigmBMK-M10-96.96
2x Assay Loading ReagenzFluidigmab 96.96 Sample/Loading Kit
20x GE Sample Loading ReagenzFluidigmab 96.96 Sample/Loading Kit
Kontrollleitung Fluid Fluidigmab 96.96 Proben-/Ladekit
TaqMan Genexpression Master MixAngewandte Biosysteme4369016
BioMark HDFluidigmBMKHD-BMKHD
96.96 Dynamic Array IFCFluidigmBMK-M10-96.96GT
Excel Microsoft
FlowJo V10TreeStarTreeStar
Fluidigm real-time PCR-AnalyseFluidigmFluidigm
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