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Methodenartikel

Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle

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DOI:

10.3791/57832

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2. August 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester, School of Medicine and Dentistry

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Reinigung von Ionenkanälen ist oft eine Herausforderung, aber einmal erreicht, kann es möglicherweise erlauben, in-vitro- Untersuchungen der Funktionen und Strukturen der Kanäle. Hier beschreiben wir die schrittweisen Verfahren für den Ausdruck und die Reinigung von Säugetieren Bestrophin Proteine, eine Familie von Ca2 +-Cl– Kanäle aktiviert.

Zusammenfassung

Das menschliche Genom kodiert vier Bestrophin Paralogs, BEST1, BEST2, BEST3 und BEST4. BEST1, kodiert durch das gen BEST1 ist eine Ca2 +-aktiviert Cl– Kanal (CaCC) überwiegend in retinalen Pigmentepithels (RPE) ausgedrückt. Die physiologische und pathologische Bedeutung der BEST1 wird durch die Tatsache hervorgehoben, dass über 200 verschiedene Mutationen im gen BEST1 genetisch mit einem Spektrum von mindestens fünf retinalen degenerative Erkrankungen, wie Best vitelliforme verknüpft wurden Macular Dystrophie (beste Krankheit). Daher hält das Verständnis der Biophysik der Bestrophin Kanäle der Ebene der Einzelmolekül-enorme Bedeutung. Gereinigte Säugetier-Ionenkanäle zu erhalten ist jedoch oft eine große Herausforderung. Hier berichten wir über ein Protokoll für den Ausdruck von Säugetieren Bestrophin Proteine mit BacMam Baculovirus gen-Transfer-System und ihre Reinigung durch Affinität und Größe-Ausschluss-Chromatographie. Der gereinigten Proteine haben das Potenzial, in nachfolgenden funktionellen und strukturellen Analysen wie elektrophysiologische Aufnahmen im Lipid Bilayer und Kristallographie genutzt werden. Wichtig ist, kann diese Pipeline zur Untersuchung der Funktionen und Strukturen von anderen Ionenkanälen angepasst werden.

Einleitung

Bestrophins sind eine Familie von Ionenkanälen konserviert durch Arten variierend von Bakterien auf Menschen1. Beim Menschen kodiert das BEST1 -Gen liegt auf Chromosom 11q12.3 das Membranprotein Bestrophin-1 (BEST1), die überwiegend in der basolateralen Membran des retinalen Pigmentepithels (RPE) Pigmentzellen der Augen2,3 ausgedrückt wird ,4. BEST1 fungiert bestehend aus 585 Aminosäuren, die ersten ~ 350 davon sind hoch konserviert zwischen den Arten und die transmembranen Bereich enthalten, ein CaCC Menschen1,5,6. Darüber hinaus funktionieren die homologe BEST1 bei Hühnern und Klebsiella Pneumoniae als Homopentamers7,8, was auf ein hohes Maß an Schutz im Laufe der Evolution.

Beim Menschen wurden über 200 Mutationen im gen BEST1 klinisch zu einer Gruppe von Netzhautdegeneration Krankheiten genannt Bestrophinopathies1,9verbunden. Fünf spezifische Bestrophinopathies wurden berichtet, einschließlich beste Krankheit, Altersdiabetes vitelliforme Dystrophie, autosomal dominante Vitreoretinochoroidopathy, autosomal rezessive Bestrophinopathy und Retinitis Pigmentosa3,4, ,10,11,12,13,14. Diese Krankheiten, die zu verminderter Sehkraft und sogar Blindheit führen, sind derzeit nicht behandelbar. Um therapeutische Behandlungen und potenziell personalisierte Medizin zu entwickeln, ist es wichtig zu verstehen, wie diese BEST1 krankheitsverursachende Mutationen beeinflussen die Funktion und Struktur der BEST1 Kanal15. Für diese Zwecke müssen Forscher erhalten gereinigte Bestrophin (Wildtyp und/oder Mutanten) Kanäle und Durchführung von in-vitro- Analysen5,8.

Der erste wichtige Schritt ist die Expression von Bestrophin Kanäle aus höheren Arten in Säugerzellen. Wie Baculovirus Transduktion von HEK293-F-Zellen (BacMam System) eine leistungsfähige Methode Membran Proteine16,17heterologously zum Ausdruck zu bringen ist, dieses Protokoll nutzt einen optimierte BacMam-Vektor (pEG BacMam) für robuste Ausdruck der Ziel Protein18, die in diesem Fall ein Säugetier Bestrophin Homolog ist. Dieser Vektor wurde für den Ausdruck von verschiedenen Membranproteinen, einschließlich G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, Kernrezeptoren und andere Ionen-Kanäle18verwendet. Es gibt auch Hinweise, dass die produzierten Proteine für Kristallographie18geeignet. Mit hohen Ebenen des Ausdrucks in HEK293-F-Zellen können die Proteine dann mit Chromatographie gereinigt werden; insbesondere können im Falle von Bestrophins, Affinität und Größe-Ausschluss Chromatographie verwendet werden.

Sobald dieses Protokoll für einen Bestrophin-Kanal abgestimmt ist, kann das gereinigte Protein dann für seine Funktion und Struktur durch planare Lipid Bilayer und Röntgen-Kristallographie, jeweils5,8analysiert werden. Insgesamt stellen diese Techniken eine mächtige Pipeline für funktionelle und strukturelle Untersuchungen von Bestrophins und anderen Ionenkanälen.

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Protokoll

(1) Herstellung von BacMam Ausdruck Baculoviren

  1. Legen Sie die kodierende Sequenz eines gewünschten Säugetier Bestrophin Proteins in der pEG BacMam Vektor-18 mit einer Protease erkennungssequenz Tabak Etch Virus (TEV), gefolgt von einer GLP-10 x His-Tag am C-Terminus des Proteins.
  2. Transient transfizieren Sie das expressionsplasmid in Klebstoff HEK293 Zellen19,20,21,22,23. Überprüfen Sie den Ausdruck des GFP-Fusionsproteins unter einem fluoreszierenden Mikroskop mit 10 X oder 20 X Vergrößerung, eine 488 nm Anregungsquelle und 510 nm Emission Filter (Abbildung 1A).
    Hinweis: Polymer-basierten Transfektion wird routinemäßig mit 1 μg von Plasmid DNA für ein 35 mm-Gericht HEK293 Zellen durchgeführt.
  3. Produzieren Sie Baculoviren in Sf9 Insektenzellen, wie zuvor beschrieben16,17.
    Hinweis: Die Passage 3 (P3)-Virus, das verwendet wird, um die HEK293-F-Zellen für die Proteinproduktion infizieren, kann 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden.
  4. Bestimmen Sie der Titer (infektiöse Einheiten) von der P3-Virus durch die Plaque Bildung Assay16,17.
    Hinweis: Da das Protein des Interesses mit GFP markiert ist, ist eine schnellere Methode zur Überprüfung von infektiöser Einheiten Sf9 Zellen mit seriellen Verdünnungen des Virus zu infizieren und die Anzahl der fluoreszierenden Zellen nach 48 h.

(2) Protein-Expression

  1. Pflegen Sie die HEK293-F-Zellen in einer SUSPENSIONSKULTUR mit dem HEK293-F Ausdruck Medium in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 8 % CO2. Verwenden Sie Einweg-Kulturflaschen, die 2 - 2,5 mal größer als das kulturvolumen und die Kultur auf einer orbitalen Plattform 135 u/min drehen.
    Hinweis: Es wird empfohlen, die Zellen zu infizieren, wenn sie zwischen 5 und 30 Passagen sind und diese Maßnahmen im Rahmen einer Zelle Kultur Kapuze durchzuführen.
  2. 24 h vor der Virusinfektion, ein 15 μl Aliquot der Zellkultur 15 μl Trypan blau hinzu, und überprüfen Sie die Zelldichte und Rentabilität mit einer Hemocytometer unter dem Mikroskop. Verdünnen Sie die Zellen auf 0.6 x 106 Zellen/mL in 2 x 2 L Flaschen jeweils mit 500 mL Medium bei 37 ° c vorgewärmt
    Hinweis: Abgestorbene Zellen sind blau von Trypan blau gefärbt. Die gewünschte Zellviabilität ist > 95 %.
  3. Am Tag der Infektion überprüfen Sie die Zelldichte und Lebensfähigkeit (Schritt 2.2).
    Hinweis: Eine hohe Zellviabilität von > 95 % ist wichtig für effiziente Infektion und Protein-Expression. Die erwarteten Zelldichte ist ~1.0 X 106 Zellen/mL (Erwachsene Übernachtung von 2 x 500 mL von 0.6 x 106 Zellen/mL Zellkultur). Die erwarteten Gesamtzahl der Zellen ist ~1.0 X 109.
  4. Die Zellen in einer Vielzahl von Infektionen (MOI) 5 P3 Baculoviren hinzufügen. Zur Bestimmung der Menge des Virus zu impfen, verwenden Sie die folgende Gleichung:
    figure-protocol-1
  5. Schütteln Sie die Zellen auf der orbital-Plattform bei 135 u/min in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit 8 % CO2 für 24 h.
  6. Die Zellkultur 10 mM Natrium Butyrat hinzufügen und weiter Inkubation für 48 h.
    Hinweis: Für einige Proteine, Reduzierung der Zelle Kultur Temperatur auf 30 ° C nach Natrium Butyrat Zusatz Ausdruck und Stabilität verbessern kann.
  7. Überprüfen Sie unter dem Fluoreszenzmikroskop mit 10 X oder 20 X Vergrößerung, eine 488 nm Anregungsquelle und 510 nm Emission Filter der Prozentsatz und die Helligkeit der grünen Zellen, die direkt der Proteinausbeute (Bestrophin-GLP-10xHis) (Abbildung 1 b) darstellen.
    Hinweis: Der Anteil der grünen Zellen ergibt sich aus: 100 x (grüne Zellen/Gesamt-Zellen). Gute proteinexpressionsgrad wird durch starke grüne Fluoreszenz unter dem Mikroskop.
  8. Ernte der Zellen durch Zentrifugieren bei 1.000 x g bei 4 ° C für 20 min. Überstands entfernen und wieder auszusetzen, die Zelle Pellets mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu einem Endvolumen von ca. 80 mL. Split die Zellsuspension in 2 x 50 mL konische Röhrchen und Zentrifuge bei 1.000 x g bei 4 ° C für 20 min. speichern die Zelle Pellets bei-80 ° C.

(3) Proteinreinigung

  1. Inkubieren Sie die konische Rohre, enthält die Zelle Pellets in einem mitreißenden Wasserbad bei Raumtemperatur für 10-15 min, damit sie auftauen. Wieder aussetzen der Zellen in 2 x (w/V) Volumen des Puffers (Tabelle 1) (z. B. 10 g Zelle Pellets in 20 mL Puffer) ergänzt mit Proteinase-Inhibitoren (Aprotinin, Leupeptin, Pepstatin A und Phenylmethylsulfonyl Fluorid) bei 0,1-1,0 mM. Pipettieren rauf und runter ausgiebig, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten.
  2. Lösen Sie die Zellen mit einem Hochdruck-Homogenisator. Führen Sie die Zellsuspension durch Homogenisator bei 7 bis 10 MPa für eine Gesamtmenge von 3 - 4 mal vollständige Homogenisierung zu erreichen. Halten Sie die Zelle lysate, auf Eis für 2-3 Minuten zwischen den runden.
  3. Die Zelle lysate Waschmittel [z. B. 2 % w/V Sol-Klasse n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM)] hinzufügen. Inkubieren Sie mit Agitation für 1 h bei 20 ° C, die Membranproteine zu extrahieren.
    Hinweis: Die Art des Reinigungsmittels muss für jedes Protein Ziel18,24optimiert werden.
  4. Zentrifugieren Sie bei 150.000 x g in einer Ultrazentrifuge bei 4 ° C für 1 h.
    Hinweis: Die folgenden Schritte sind bei 4 ° c durchgeführt.
  5. Sammeln Sie die klare Zelle lysate und fließen, die es durch eine 5 mL seine Falle Ni2 +- NTA Affinität Säule equilibriert mit Puffer (Tabelle 1) voraus.
    Hinweis: Nach der Zentrifugierung, wird die klare Zelle lysate zwischen ein Pellet an der Unterseite und eine trübe Schicht obenauf eingeklemmt. Verwenden Sie ein 10 mL transferpipette sorgfältig sammeln die klare lysate und wechseln Sie dann in eine 1 mL pipettieren für die letzten paar Milliliter lysate. Vermeiden Sie das Pellet, das Ni2 + Spalte verstopfen kann; aber eine kleine Menge der Deckschicht ist in Ordnung oder kann mit einem 1,5 µm Filter herausgefiltert werden.
  6. Waschen Sie die Spalte mit 25 mL Puffer B und dann 40 mL Puffer C (Tabellen 2 und 3, beziehungsweise).
    Hinweis: Dies ist ein guter Ort für eine Pause, da total Reinigung bis zu 12 Std. dauern kann und das Protein stabil bleiben kann, während die Spalte über Nacht angeschlossen.
  7. Legen Sie die Spalte auf ein schnelles Protein Flüssigkeitschromatographie (FPLC) System und eluieren Sie das Protein von der Säule mit 13 mL Puffer D (Tabelle 3) mit Fraktionierung. Sammeln Sie die Protein-angereicherte Fraktionen nach der UV-Absorption-Anzeige.
    Hinweis: The FPLC Bedingungen lauten wie folgt: eine 1,0 mL Bruchteil Größe, ein Pre-Spalte Druck Alarm auf 0,3 MPa und einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 mL/min eingestellt.
  8. Messen Sie die eluierten Proteinkonzentration Produkt auf einem Microvolume Spektralphotometer. Lesen Sie die Absorption bei 280 nm.
  9. (Optional) Um die GLP-10xHis-Tag entfernen, Hinzufügen der TEV-Protease in einem Massenverhältnis von 1:1 und bei 4 ° C für 30 min inkubieren.
    Hinweis: Die Beschriftung kann oder beeinträchtigen nicht die Funktion oder Struktur des gereinigten Kanals. Die TEV berechnen von Volumen und Konzentration des Proteins von Schritten 3.7-3.8 gesammelt. Zum Beispiel, wenn 10 mL der Elution Produkt erfasst und bei 0,1 mg/mL, die Gesamt-Protein gemessen Masse ist 10 x 0,1 = 1 mg und 1 mg von TEV für Verdauung verwendet werden.
  10. Das Protein mit einer zentrifugalen 15 mL (50 oder 100 kDa) konzentrieren Filtereinheit von Spinnen bei 4.000 x g bei 4 ° C zu einem Endvolumen von 400-500 μL (für eine 2 mL probenbeladung Schleife auf FPLC).
    Hinweis: Die sandbacken Zeit für Konzentration hängt von der Konzentration und der Größe des Proteins. Um übermäßige Konzentration zu vermeiden, kann die verursachen Proteinfällung, spin für 10 min auf den ersten, dann das restliche Volumen zu beobachten und schätzen Sie die Zeit für einen weiteren Spin (z. B. 2-5 min), und so weiter, um das endgültige Volumen zu erhalten. Pipettieren zwischen den Spins, das Protein zu zerstreuen, die an der Unterseite des Filters gezogen wird.
  11. Übertragen Sie das konzentrierte Protein um eine neue 1,5 mL tube und jedem Niederschlag oder Luftblasen aus dem konzentrierten Produkt entfernen. Mit drehen > 12.000 x g für 5-10 min bei 4 ° C und Sammeln der Überstand in ein neues 1,5 mL-Tube.
  12. Laden Sie das fertige Produkt mit einer 1 mL Spritze und eine Runde Spitze Nadel auf einem FPLC-System für die Größe-Ausschluss-Chromatographie mit einer Größe-Ausschluss-Spalte vor equilibriert mit Puffer E (Tabelle 5).
    Hinweis: The FPLC Bedingungen lauten wie folgt: eine 0,5 mL Bruchteil Größe, ein Pre-Spalte Druck Alarm eingestellt bis 2,50 MPa, ein Volumenstrom eingestellt auf 30 mL des Puffers E (Tabelle 5), und eine Durchflussmenge auf 0,5 mL/min eingestellt.
  13. Beachten Sie, dass brav Proteine als einzige Spitze (Abbildung 2A) laufen und sammeln die Protein-Fraktion(en) entspricht, dass Peak (Abbildung 2A).
  14. Das Protein mit 4 mL bzw. 0,5 mL zentrifugale Filter-Einheit (der das gleiche Molekulargewicht Cut-Off wie bei Schritt 3.10) und Spin bei 4.000 x g bei 4 ° C, eine Endkonzentration von 5-10 μg/μL zu konzentrieren. Verwenden Sie das Spektrophotometer um das Endprodukt Konzentration (Schritt 3,8).
    Hinweis: Zentrifugation Zeit variiert, da das Endprodukt Volumen zwischen Reinigung Studien unterschiedlich sein kann. Zentrifugation dauert in der Regel 10-20 min. Es wird empfohlen, pipettieren zwischen den Spins, das Protein zu zerstreuen, die an der Unterseite des Filters gezogen wird.
  15. Übertragen Sie das konzentrierte Protein auf eine neue 1,5 mL Tube. Entfernen Sie alle Niederschlag durch Zentrifugieren bei > 12.000 x g für 5-10 min bei 4 ° C. Übertragen Sie den überstand auf eine neue 1,5 mL Tube. 10 μl-Aliquots für die Lagerung bei-80 ° C und speichern Sie einer 2-5 μL kleine aliquoten auf ein 4-15 % Steigung SDS-PAGE Gel mit 9 V/cm (Abb. 2 b) ausgeführt.
  16. Bestätigen Sie die Identität des gereinigten Proteins durch Massenspektrometrie8.
    Hinweis: In-vitro- Analyse der Funktion und Struktur des gereinigten Proteins können durch planare Lipid Bilayer und Röntgen-Kristallographie, jeweils5,8durchgeführt werden.

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Ergebnisse

Die Fluoreszenzintensität in vorübergehend transfiziert Klebstoff HEK293 Zellen (Abbildung 1A) ist ein guter Indikator für die geplante proteinexpressionsgrad in Suspension-f HEK293 Zellen (Abbildung 1 b). Wenn das Zielprotein nicht gut ausgedrückt ist oder MIS nach Transiente Transfektion in HEK293 Zellen lokalisiert ist, es ist empfehlenswert, das Konstrukt Ausdruck ändern (zB., die Veränderung der Position des GFP-Tag...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine nützliche Pipeline für Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle für zukünftige in-vitro- Analysen verwendet werden. Während das FPLC-Gerät für die Größe-Ausschluss Chromatographie erforderlich ist, genügt eine Spritzenpumpe für alle Schritte der Affinitätschromatographie einschließlich verbindlich, Waschen und eluierenden. Wenn Sie eine Spritzenpumpe, Push-Lösungen (in einer Spritze) durch eine Spalte verwenden, gilt es die Frühling-Seite zur Vermeidung von L...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Dieses Projekt wurde von NIH-Stipendien EY025290, GM127652 und University of Rochester Anschubfinanzierung finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
HEPESFisher ScientificAC327265000 
NaClFisher ScientificAC446212500
GlycerinFisher ScientificG33-500
ImidazolFisher ScientificAC301870010
MgCl2FisherScientific AC197530010 
TCEPFisher ScientificAA4058704 
AprotininFisher ScientificAAJ63039MA
LeupeptinFisher ScientificAAJ61188MB 
Pepstatin AFisher ScientificAAJ20037MB
PhenylmethylsulfonylfluoridFisher ScientificAC215740050
DDM Sol-GradeAnatraceD310S
DDM anagrade AnatraceD310
Sf-900 II SFMThermoFisher10902179
FreeStyle mediumThermoFisher12338018
NanoDrop SpektralphotometerThermoFisherND-2000
Hochdruck-HomogenisatorAvestinEmulsiflex-C5
HisTrap SäuleGE17-5248-01
Superdex-200 SäuleGE28990944
AKTA PureGE29018224
Ultra-15 ZentrifugalfilteranlagenMilliporeUFC910024
Ultra-4 ZentrifugalfilteranlagenMilliporeUFC810024
Ultra-0,5 ZentrifugalfilteranlagenMilliporeUFC505024
Optima XE-90 UltrazentrifugeBeckman CoulterA94471
Mini-PROTEAN Tetra CellBio-Rad1658004
Mini-PROTEAN FertigteilgelBio-Rad4561084
T100 ThermocyclerBio-Rad1861096
PolyJet TransfektionsreagenzSignaGenSL100688
pEG BacMam VektorGewonnen aus dem Gouaux-Labor am Institut Vollum

Referenzen

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