Methodenartikel

Charakterisierung der Thymus-abhängig und Thymus-unabhängige Immunglobulin Isotype Antworten bei Mäusen mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay

DOI:

10.3791/57843

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7. September 2018

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1Department of Cell Biology and Neuroscience and Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology, Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Rutgers University, 3Rutgers Cancer Institute of New Jersey

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Charakterisierung von T-abhängigen und T-unabhängige Immunglobulin (Ig) Isotype Antworten bei Mäusen mittels ELISA. Diese Methode verwendet, allein oder in Kombination mit Flow Cytometry wird erlauben Forschern, Unterschiede in der B-Zell-vermittelten Ig Isotype Antworten bei Mäusen nach T-abhängigen und T-unabhängige Antigen-Immunisierung zu identifizieren.

Zusammenfassung

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Antikörper, auch bezeichnet als Immunglobuline (Ig), abgesondert von B-Lymphozyten, Plasmablasts/Plasmazellen im humorale Immunität unterschieden bieten eine gewaltige Verteidigung gegen eindringende Krankheitserreger über vielfältige Mechanismen. Ein wichtiges Ziel der Impfung ist, schützende Antigen-spezifische Antikörper, lebensbedrohliche Infektionen zu verhindern. Thymus-abhängig (TD) und Thymus-unabhängige (TI) Antigene robuste Antigen-spezifische IgM Antworten entlocken können und können auch induzieren die Produktion von Isotype geschalteten Antikörpern (IgG, IgA und IgE) sowie die Generierung von Speicherzellen B mit Hilfe durch antigenpräsentierende Zellen (APCs) bereitgestellt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Charakterisierung von TD und TI Ig Isotype Reaktionen bei Mäusen mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA). In diesem Protokoll sind TD und TI Ig Antworten durch intraperitoneale (i.p.) Immunisierung mit konjugierten Hapten Modell Antigene TNP-KLH (in Alaun) und TNP-Polysaccharid (mit PBS-Puffer), bzw. in den Mäusen ausgelöst. Um TD Speicher Reaktion hervorzurufen, ist eine Auffrischimpfung von TNP-KLH in Alaun 3 Wochen nach der ersten Impfung mit dem gleichen Antigen/adjuvante gegeben. Maus-Seren werden zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach der Immunisierung geerntet. Insgesamt Ig Serumspiegel und TNP-spezifische Antikörper sind anschließend quantifiziert mit Ig Isotype-spezifische Sandwich und indirekten ELISA, beziehungsweise. Um die Serumkonzentration von jedem Ig Isotype korrekt zu quantifizieren, müssen die Proben entsprechend verdünnt werden, um innerhalb des linearen Bereichs der standard Kurven passen. Unter Verwendung dieses Protokolls, haben wir konsequent zuverlässige Ergebnisse mit hoher Spezifität und Sensitivität erreicht. Bei Verwendung in Kombination mit anderen ergänzenden Methoden wie Durchflusszytometrie, in-vitro- Kultur der Milz B-Zellen und immunhistochemische können Färbung (IHC), dieses Protokoll Forscher, ein umfassendes Verständnis des Antikörpers zu gewinnen Antworten in einer bestimmten experimentellen Einstellung.

Einleitung

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B-Lymphozyten sind der Hauptakteur in humorale Immunität und die einzige Zelltyp bei Säugetieren, die in der Lage, die Produktion von Antikörpern, auch als Immunglobuline (Ig)1,2bezeichnet sind. Abgesondert von B-Zellen Antikörper bieten eine gewaltige Verteidigung gegen eindringende Krankheitserreger über vielfältige Mechanismen, einschließlich Neutralisation, Opsonization und Komplementaktivierung führt zu schützende Immunität3. Sekretion von Antikörpern durch B-Zellen wird erst nach der vollständigen Aktivierung von bestimmten B-Zellen, die erfordert in der Regel zwei unterschiedlich....

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Protokoll

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Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des institutionellen Tierforschung Ethik-Kommission der Rutgers University. Alle Mäuse dienen nach NIH-Richtlinien und eine tierische Protokolls durch die institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Vorbereitung von Mäusen und Sammlung von naiven Maus Sera

  1. Halten Sie alle Mäuse für Immunisierung Experimente in einem bestimmten Pathogen-freies Tierhaus.
  2. Mäuse, die die gleichen Eltern und Käfige für Immunisierung Studien Teilen Steuern Gebrauch Geschlecht abgestimmt, junger Erwachsener (8 – 12 Wochen alt) ko und stellt.
  3. Planen Sie die Immunisierung und Serum ....

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Ergebnisse

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Wir haben dieses Protokoll verwendet, um die Rollen von einem kritischen Regler des immunen Systems, TRAF3, TI und TD Ig Isotype Antworten9,10,11zu untersuchen. TRAF3 direkt oder indirekt regelt die Signaltransduktion eine Reihe von angeborenen und der adaptiven Immunsystems Rezeptoren, einschließlich der TNF-Rezeptor-Superfamilie, Toll-Like-Rezeptoren und T-Zell-Rezeptor/CD28, unter anderem

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Diskussion

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Hier beschreiben wir das Protokoll für die Charakterisierung von TD und TI Ig Isotype Reaktionen bei Mäusen mittels ELISA. Erfolgreiche Umsetzung dieses Protokolls erfordert die Verwendung von Materialien, die in Tabelle 1, einschließlich ELISA-Assay-Platten, Immunisierung Ags, Maus Ig Isotype-spezifische Antikörper und Normen angegeben. Darauf sollte geachtet werden, vermeiden die Verwendung von Gewebekultur behandelt Platten für ELISA. Verdünnungen der Standards und Serumproben sollten in separaten unb.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keinen finanziellen Interessenkonflikt.

Danksagungen

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Diese Studie wurde unterstützt von den National Institutes of Health Zuschüsse R01 CA158402 (P. xxx) und R21 AI128264 (P. Xie), dem Department of Defense gewähren W81XWH-13-1-0242 (s. Xie), ein Pilot Award vom Cancer Institute of New Jersey durch Grant Nummer P30CA072720 vom National Cancer Institute (s. xxx), ein Busch biomedizinische Grant (s. xxx), Victor Stollar Stipendiat (A. Lalani) und Anne B. und James B. Leathem Fellowship (S. Zhu).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
VersaMax Tunable Microplate ReaderMDS Analytical TechnologiesVERSAMAXAusrüstung zum Lesen der Platten
SOFTmax PRO 5.3MDS Analytical TechnologiesSOFTmax PRO 5.3Software für den Plattenleser
GraphPad PrismGraphPadPrismSoftware für Grafik und Statistik
TNP-AECM-Polysaccharid (FICOLL)Biosearch TechnologiesF-1300-10A TI Ag für die Immunisierung
TNP-KLHBiosearch TechnologiesT-5060-5A TD Ag für die Immunisierung
TNP(38)-BSABiosearch TechnologiesT-5050-10 (Konjugationsverhältnis: 38)Coating Ag für TNP-spezifischen ELISA
TNP(3)-BSABiosearch TechnologiesT-5050-10 (Konjugationsverhältnis: 3)Coating Ag für hochaffine TNP-spezifisches Ig-Imjektiv-Alaun
Fisher Wissenschaftlich PI-77161Alaun-Adjuvans für die Immunisierung
Falcon Polypropylen-RöhrchenFisher Scientific 14-959-11AZur Inkubation von TNP-KLH/alaun
BD InsulinspritzeFisher Scientific 14-829-1BFür die i.p. Injektion von
Immuno 96-Well-Platten von Mäusen, Flachboden-FisherScientific 14-245-61Für ELISA
Unbehandelte 96-Well-Mikrotiterplatten, RundbodenVWR82050-622Für serielle Verdünnungen von Standards und Proben
Phosphatase-Substrat, 5 mg TablettenSigmaS0942-200TABAP-Substrat
DiethanolaminVWRIC15251690Ein Bestandteil des AP-Substratpuffers
Ziegen-Anti-Maus-IgMSouthernBiotech1020-01Capture Ab für Maus IgM Ziege
Anti-Maus IgG1SouthernBiotech1070-01Capture Ab für Maus IgG1
Ziege Anti-Maus IgG2aSouthernBiotech1080-01Capture Ab für Maus IgG2a
Ziege Anti-Maus IgG2bSouthernBiotech1090-01Capture Ab für Maus IgG2b
Ziege Anti-Maus IgG3SouthernBiotech1100-01Capture Ab für Maus IgG3
Ziege Anti-Maus IgASouthernBiotech1040-01Capture Ab für Maus IgA
Ziege Anti-Maus IgESouthernBiotech1110-01Capture Ab für Maus
IgE AP-Ziege Anti-MausIgM SouthernBiotech1020-04Detection Ab für Maus
IgM AP-Ziege Anti-Maus IgG1SouthernBiotech1070-04Detection Ab für Maus IgG1
AP-Ziege Anti-Maus IgG2aSouthernBiotech1080-04Detection Ab für Maus IgG2a
AP-Ziege Anti-Maus IgG2bSouthernBiotech1090-04Detection Ab für Maus IgG2b
AP-Ziege Anti-Maus IgG3SouthernBiotech1100-04Detection Ab für Maus IgG3
AP-Ziege Anti-MausIgA SouthernBiotech1040-04Detection Ab für Maus IgA
AP-Ziege Anti-Maus IgESouthernBiotech1110-04Detection Ab für Maus IgE
Maus IgM StandardBD Biosciences553472TNP-spezifisches IgM, Klon  G155-228
Maus IgG1 StandardBD Biosciences554054TNP-spezifisches IgG1, Klon  107.3
Maus IgG2a StandardBD Biosciences556651TNP-spezifisches IgG2a, Klon  G155-178
Maus IgG2b StandardBD Biosciences554055TNP-spezifisches IgG2b, Klon  49,2
Maus IgG3 StandardBD Biosciences553486KLH-spezifisches IgG3, Klon  A112-3
Maus IgA-StandardBD Biosciences550924Mineralöl-induziertes IgA, Klon  MOPC-320
Maus IgE-StandardBD Biosciences557079TNP-spezifisches IgE, Klon  Nr. C38-2

Referenzen

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  1. Moise, A., Nedelcu, F. D., Toader, M. A., Sora, S. M., Tica, A., Ferastraoaru, D. E., Constantinescu, I. Primary immunodeficiencies of the B lymphocyte. Journal of Medicine and Life. 3, 60-63 (2010).
  2. Bishop, G. A., Haxhinasto, S. A., Stunz, L. L., Hostager, B. S. Antigen-specific B-lymphocyte activation. Critical Reviews in Immunology. 23, 149-197 (2003).
  3. Murphy, K.

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Schlagwörter

Thymus abh ngiges ImmunglobulinAnalyse von MausserumIsotypspezifischer ELISATNP KLH ImmunisierungTNP Polysaccharid ImmunisierungRetroorbitale BlutentnahmeMikroplattenleseger tDurchflusszytometrie

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