In Situ Hybridisierung Techniken für Paraffin-eingebetteten Erwachsenen Korallen Proben

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist in Situ Hybridisierung auf Erwachsenen Korallen Proben durchführen, die in Paraffin eingebettet und auf Objektträger geschnitten wurden. Dies ist eine qualitative Methode zur Visualisierung des räumlichen Ausdrucks einer RNA Gegenstrang Sonde in Paraffin-eingebetteten Gewebe verwendet.

Zusammenfassung

Korallen sind wichtige Ozean Wirbellosen, die entscheidend für die allgemeine Gesundheit der Meere sowie die menschliche Gesundheit sind. Korallen sind jedoch durch menschliche Einflüsse wie steigenden Meerestemperaturen und Versauerung bedroht. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, erwiesen Fortschritte in der Zell- und Molekularbiologie sich für die Gesundheit der Korallen Diagnose von entscheidender Bedeutung. Ändern einige der häufig in der Humanmedizin verwendet Techniken könnte erheblich verbessern Forscher Fähigkeit Korallen zu behandeln. Um dieses Problem anzugehen, wurde ein Protokoll zur in Situ Hybridisierung verwendet, vor allem in der Humanmedizin und evolutionären Entwicklungsbiologie angepasst für den Einsatz in Erwachsenen Korallen unter Stress.

Der Zweck dieser Methode ist den räumliche Ausdruck einer RNA-Sonde in Erwachsenen korallengewebe zu visualisieren, die in Paraffin eingebettet und auf Objektträger geschnitten wurde. Diese Methode konzentriert sich auf die Entfernung des Paraffins und Rehydrierung der Probe, Vorbehandlung der Probe zur Durchlässigkeit der Probe, Pre-Hybridisierung Inkubation, Hybridisierung der RNA-Sonde und Visualisierung der RNA-Sonde zu gewährleisten. Dies ist eine leistungsfähige Methode, wenn nicht Modellorganismen mit um zu entdecken, wo bestimmte Gene exprimiert, und das Protokoll kann für andere Modellorganismen leicht angepasst werden. Die Methode ist jedoch beschränkt, dass es sich in erster Linie qualitative, da Ausdruck Intensität, abhängig von der Höhe der Zeit während der Visualisierung Schritt und die Konzentration der Sonde verwendet variieren kann. Darüber hinaus ist Geduld erforderlich, da dieses Protokoll bis zu 5 Tagen (und in vielen Fällen länger) abhängig von der verwendeten Sonde nehmen kann. Zu guter Letzt unspezifische Hintergrundfärbung ist üblich, aber diese Einschränkung überwunden werden kann.

Einleitung

Korallen sind kritische Ökosystem Bauherren und wichtig für die biologische Vielfalt in den Ozean und menschliche Gesundheit^1,2,3. Sie sind bedroht durch Klimawandel und anderen anthropogenen Stressfaktoren, und viele Korallenarten gelten als vom Aussterben bedroht. Somit ist ein erheblicher Bedarf für Zelluläre und molekulare Werkzeuge zur diagnose von Korallen unter Stress. Außerdem ist es wenig über wo Gene innerhalb von Erwachsenen korallengewebes und daher wenig Verständnis für die Funktionen dieser Gene exprimiert werden verstanden. Um dieses Problem zu beheben, haben w....

Protokoll

1. Entfernung des Paraffins

Achtung: Führen Sie die folgenden Schritte unter einem Abzug.

1. Wachsentfernung dünn geschnittene Paraffin-eingebetteten Folien mit 100 % Xylol unter der Haube in Coplin Gläser für 10 Minuten. Verwenden Sie keine Coplin Plastikdosen, wie Xylol Kunststoff schmilzt. Sterilisieren Sie die Coplin Gläser im Autoklav vor Gebrauch.
2. Bereiten Sie vier sterile Coplin Gläsern mit den folgenden: 100 % Ethanol, 80 % Ethanol, Ethanol 70 % und 60 % Ethanol. Das Ethanol mit RNase-freies Wasser zu verdünnen.
   1. Die Folien zu den sterilen Coplin Behälter mit 100 % Ethanol zu übertragen und für 10 Minuten ein....

Ergebnisse

Nach Abschluss dieses Protokolls, erfolgt die Identifikation von Zellen und Geweben, die die RNA-Sonde von Interesse zum Ausdruck bringen. Die repräsentativen Ergebnisse für dieses Protokoll sind für AP-1, FosB und TNFR41. Diese Ergebnisse, zuvor von Traylor-Knowles Et Al. veröffentlicht ¹¹, Sonden zeigen räumliche Ausdruck der RNA auf Erwachsenen Korallen, die Hitze-Stress ausgesetzt waren. Zwei Beispiele verschiedener Färbung sind in

Diskussion

In diesem Protokoll beschriebene Methode wurde von der früheren Arbeit in medizinischen und evolutionäre Entwicklungsforschung^8,9,10,12,17geändert. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Nuancen der eine in Situ Hybridisierung mit einer Grabung beschriftet RNA Gegenstrang Sonde auf Erwachsenen Korallen, die konserviert und in Paraffin eingebettet .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Denhardt's Lösung	Affymetrix	70468 50 ML
Bioworld Alkalischer Phosphatase-Puffer	Fisher	50-198-724
Objektträger-Versandtaschen	Fisher	12-587-17B
Bioworld Alkalischer Phosphatase-Puffer	Fisher	50-198-724
50 mL Falcon-Röhrchen	Fisher	14-959-49A
UltraPure Salmon Sperma DNA-Lösung	Invitrogen	15632-011
PBS - Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10X) pH 7,4	Invitrogen	AM9625
UltraPure DNase/RNase-freies destilliertes Wasser, 10 x 500 mL	Invitrogen	10977-023
UltraPure DNase/RNase-freies destilliertes Wasser, 10 x 500 mL	Invitrogen	10977-023
UltraPure Salmon Sperma DNA-Lösung	Invitrogen	15632-011
Objektträger weißer Apex überlegener Klebstoff	Leica Biosystems	3800080
PBS-Lösung, pH 7,4	Life Technologies	10010072
Proteinase K, Molekulare Qualität, 2 mL	New England Biolabs	P8107S
Super Pap Pen Liquid Blocker	Promega	22309
DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab-Fragmente	Roche	11093274910
BM Purple, 100 mL	Roche	11442074001
DIG Wasch- und Blockpuffer Set	Roche	11585762001
NBT/BCIP	Roche	11681451001
Formaldehydlösung, 500 mL Größe	Sigma-Aldrich	252549-500ML
SSC Puffer 20X Konzentration	Sigma-Aldrich	S6639-1L
Essigsäureanhydrid	Sigma-Aldrich	320102-100ML
Formamid	Sigma-Aldrich	47670-250ML-F
Triethanolamin	Sigma-Aldrich	90279-100ML
Heparin-Natriumsalz aus der Darmschleimhaut des Schweins	Sigma-Aldrich	H3149-10KU
Xylole, AR (ACS), für den histologischen Gebrauch	VWR	MK866806
Ethanol	VWR	EM-EX0276-4S
TE Puffer	VWR	PAV6232
Hybridisierungsofen	VWR	97005-252, 97005-254
Orbitalschüttler	VWR	89032-088