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Methodenartikel

Einzelne Sensillum Aufnahmen für Locust spürbare Sensillen Basiconica

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DOI:

10.3791/57863

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23. Juni 2018

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1Department of Entomology, China Agricultural University, 2Bio-tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Whitepaper beschreibt eine detaillierte und hochwirksame Protokoll für einzelne Sensillum Aufnahmen aus den Sensillen Basiconica auf die Palpen Insekt Mundwerkzeuge.

Zusammenfassung

Die Palpen Heuschrecke Mundwerkzeuge gelten als konventionelle geschmackliche Organe, die eine wichtige in einer Heuschrecke Auswahl an Speisen, vor allem für die Erkennung von nicht-flüchtigen chemischen Signale durch Sensillen Chaetica Rolle (zuvor genannten terminal Sensillen (oder crested Sensillen). Es gibt nun immer mehr Hinweise darauf, dass diese Palpen auch eine olfaktorische Funktion haben. Ein Duftstoff-Rezeptor (LmigOR2) und ein Duftstoff-bindendes Protein (LmigOBP1) haben in den Neuronen und Zubehör Zellen, bzw. in die Sensillen Basiconica von der Palpen lokalisiert wurden. Einzelne Sensillum Aufnahme (SSR) dient zur Erfassung der Antworten der Geruchsstoff Rezeptor Neuronen, ist eine effektive Methode für das screening von aktiven Liganden auf bestimmten Geruchsstoff Rezeptoren. SSR wird in funktionelle Studien der Geruchsstoff Rezeptoren in spürbare Sensillen verwendet. Die Struktur der die Sensillen Basiconica befindet sich auf der Kuppel der Palpen unterscheidet sich etwas von der Struktur von denen auf den Antennen. Daher kann bei der Durchführung eines SSR, hervorgerufen durch Geruchsstoffe einige spezifische Beratung für optimale Ergebnisse hilfreich sein. In diesem Papier wird eine detaillierte und hochwirksame Protokoll für ein SSR von Insekten spürbare Sensillen Basiconica eingeführt.

Einleitung

Tiere haben eine Reihe von chemosensorische Organe entwickelt, die exogene chemische Signale zu spüren. Bei Insekten sind die wichtigsten chemosensorische Organe der Antennen und der Palpen. Auf diese Organe sind mehrere Arten von chemosensorische Haare, genannt chemosensorische Sensillen durch chemosensorische Neuronen (CSNs) in die Haare innerviert. CSNs in chemosensorische Sensillen erkennen spezifische chemische Signale durch Signaltransduktion durch chemische Reize in elektrische Potentiale, die anschließend bis zum zentralen Nervensystem1,2,3 übertragen werden .

CSNs express verschiedene chemosensorische Rezeptoren [z. B.Geruchsstoff Rezeptoren (ORs)], Ionotropic Rezeptoren (IRs) und geschmackliche Rezeptoren (GRs) auf ihre Membranen, die exogene chemische Signale, die verbunden sind mit verschiedenen Arten von Chemosensation Codieren 4,5,6. Die Charakterisierung der CSNs ist entscheidend für die Aufklärung der zellulären und molekularen Mechanismen der Insekten Hemmstoffe. Jetzt einzelne Sensillum Aufnahme (SSR) eine weit verbreitete Technik ist für die Charakterisierung von Insekt CSNs in die antennalen Sensillen viele Insekten, darunter7fliegen, Käfer Motten8,9, Blattläuse10, Heuschrecken11, und Ameisen-12. Jedoch nur wenige Studien haben angewendet eine SSR Insekt Palpen13,14,15,16,17, weil die besonderen Strukturen ihre Sensillen machen eine Elektrophysiologische Aufnahme schwer18.

Schwärme von Heuschrecken (Orthopteren) verursachen oft schwere Ernteschäden und Vermögensschäden19. Die Palpen sind vermutlich eine wichtige Rolle in der Lebensmittel-Auswahl von Heuschrecken20,21,22,23,24. Zwei Arten von chemosensorische Sensillen werden mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM) untersucht. In der Regel werden 350 Sensillen Chaetica und 7-8 Sensillen Basiconica auf jede Kuppel der Heuschrecke Palpen18beobachtet. Sensillen Chaetica sind geschmackliche Sensillen, die nicht-flüchtigen chemischen Signale, Sinn, während Sensillen Basiconica haben eine olfaktorische Funktion, sensing flüchtige chemische Signale.

Heuschrecke Palpen, die Durchmesser der Haare Buchsen der Sensillen Basiconica (ca. 12 µm), sind viel größer als die Sensillen Chaetica (ca. 8 µm)18,25. Die kutikulären Wand Sensillen Basiconica auf der Palpen ist viel dicker als die antennalen Sensillen18. Darüber hinaus hat die Kuppel der spürbare flüssigen Inhalt innerhalb einer hochflexiblen Kutikula. Diese Eigenschaften bedeuten, dass eine Penetration mit einer Mikroelektrode und dem Erwerb einer guten elektrophysiologischen Signalen schwieriger als bei antennalen Sensillen ist. In diesem Papier wird eine detaillierte und hochwirksame SSR-Protokoll für die Heuschrecke spürbare Sensillen Basiconica mit einem Video präsentiert.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Instrumente und Insekt

  1. Erarbeiten von Wolfram-Elektroden und Reize Lösungen
    1. Eine neue wolframdraht (Durchmesser von 0,125 mm, Länge 75 mm) in einem Mikromanipulator zu beheben und bei 10 V zur Verfügung gestellt durch ein Netzteil für ca. 1 min unter einem Stereomikroskop (40 X Vergrößerung) in 10 % (w/V) Natrium Nitrit (NaNO2) Lösung in einer Spritze zu schärfen.
    2. Tauchen Sie die geschärften wolframdraht wiederholt in die 10 % NaNO2 Lösung, etwa 4 mm bei 5 V in < 1 min (Abb. 1A).
    3. Prüfen Sie den Durchmesser der geschärften Wolfram Spitze häufig unter dem Stereomikroskop, bis es fein genug, die Nagelhaut eine Heuschrecke spürbare olfaktorische Sensillum (Abbildung 1 b) zu durchdringen ist.
    4. Bereiten Sie die Impuls-Lösungen. Verdünnen Sie die chemischen Reiz Substanz in Mineralöl. Verdünnen Sie 1-Nonanol und Nonanoic Säure bei 10 % Verdünnungen. E-2-Hexenal und hexanal bei 10-2, 10-3und 10-410-5zu verdünnen.
    5. Bereiten Sie Pasteur Röhren tragen die Reize: Pasteur Röhren Filterpapier Streifen (2 cm lang, 0,5 cm breit) einfügen, Filterpapier Streifen die verdünnte Reiz-Lösungen (jeweils 10 µl) hinzu, und stecken Sie dann die Pasteur-Rohren mit Pipettenspitzen (1 ml).
  2. Bereiten Sie das Insekt
    1. Hintere Heuschrecken (Locusta Migratoria) mit frischen Weizen Sämlinge unter beengten Verhältnissen bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % und einer Temperatur von 28-30 ° C eine Photoperiode von 18:6 h (Licht: dunkel). Wählen Sie 1 bis 3 Tage alte 5th instar Heuschrecke Nymphen und die Antennen mit einer feinen Schere um Störungen zu vermeiden, bei der Aufnahme zu entfernen.
  3. Vorbereitung des Heuschrecke maxillaris spürbare Halters
    1. Verwenden Sie einen Objektträger (25 x 75 mm) als Basis für den Oberkiefer spürbare Halter (MPH). Ein Plastikteil (1 mm in der Höhe, Breite, 35 mm in der Länge von 10 mm) in eine Ecke des gläsernen Objektträger mit doppelseitigem Klebeband befestigen, und schließlich ein Deckglas (18 x 18 mm) auf das Plastikteil mit doppelseitigem Klebeband befestigen. Legen Sie ein kleines Stück rote Gummiband auf dem Deckglas als eine Anti-Rutsch-Schicht. Das Plastikteil und dem Deckglas bilden die Plattform für die Heuschrecke spürbare. Die Höhe der Plattform beträgt ca. 1,5 mm.
    2. Installieren einen wolframdraht (Durchmesser von 0,125 mm, Länge 36 mm) in einem Abstand von 1,5 mm parallel zur inneren Rand der Plattform. Befestigen Sie die beiden Enden des Drahtes auf der Plattform mit doppelseitigem Klebeband.

2. Vorbereitung der Locust maxillaris Palpen

  1. Ein Zentrifugenröhrchen (1,5 ml) vertikal in zwei Hälften geschnitten und unten abgeschnitten. Legen Sie die Heuschrecken in das vorbereitete Röhrchen. Lassen Sie die ventrale Region und den Kopf der Heuschrecke ausgesetzt. Befestigen Sie die Versammlung auf dem Objektträger mit doppelseitigem Klebeband (Abbildung 2A).
  2. Ziehen Sie die richtige maxillaris spürbare auf die Plattform.
  3. Das vierte Segment der spürbare gefährden Sie der wolframdraht. Platzieren Sie Klebstoff Kitt auf jeder Seite der wolframdraht, ca. 2 mm aus dem Oberkiefer spürbare (Abb. 2A und 2 b).

3. single Sensillum Aufnahmen

  1. Legen Sie die Heuschrecke maxillaris spürbare Vorbereitung unter dem Mikroskop an einer niedrigen Vergrößerung (100 X). Passen Sie die Position der Vorbereitung, bis die spürbare senkrecht an die Aufnahme-Elektrode (Abb. 3A).
  2. Die Locust-Auge mit einem Mikromanipulator einfügen Sie Bezugselektrode (Wolfram-Elektrode). Verschieben Sie die Aufnahme-Elektrode (Wolfram-Elektrode) in der Nähe der Oberkiefer spürbare mit Mikromanipulator (Abb. 3 b und 3 C).
  3. Passen Sie den Geruch abgabegerät um ca. 1 cm aus dem Oberkiefer spürbare (Abb. 3 b).
  4. Öffnen Sie die Aufnahmesoftware Auto Spike 32. Die Aufnahmeparameter wie folgt festgelegt: die Aufnahme-Skala auf 500 µV; der hohe Cutoff des Filters auf 300 Hz, den niedrigen Grenzwert auf 200 Hz; und der Pretrigger auf 10 s.
  5. Verbinden Sie die Aufnahme-Elektrode, ein 10 x universal AC/DC Verstärker.
  6. Schalten Sie das Mikroskop auf eine hohe Vergrößerung (500 X). Legen Sie die Aufnahme-Elektrode in den unteren Teil ein Basiconic Sensillum auf den Oberkiefer spürbare und fein einstellen der Aufnahme-Elektrode um gute spontane Spikes (Abbildung 3D) zu erhalten.
  7. Öffnen Sie die Impuls-Controller, um einen kontinuierlichen Luftstrom bei 20 ml liefern/s. Stellen Stimulation 1 S. Rekord-Signale für 10 s, ab 10 s vor dem Beginn der Reiz Puls.
  8. Verwenden Sie einen 10 X universal AC/DC Verstärker, um die Signale zu verstärken. Füttern Sie die Signale in den anderen 4. Analysieren Sie die Signale mit der Auto-Spike-32-Software. AC-Signale sind Bandpass gefiltert zwischen 200 bis 300 Hz. Verwendung Auto Spike 32 um Peak-Trog Amplituden von Geräuschen zu unterscheiden. Berechnen Sie die Antworten der Neuronen als der Anstieg des Aktionspotentials Frequenzen (Spikes pro Sekunde) über die spontane Frequenzen. Führen Sie eine statistische Analyse mit GraphPad Prism 7.

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Ergebnisse

Zwei Sensillen Subtypen (pb1 und pb2) auf die Heuschrecke maxillaris spürbare werden identifiziert basierend auf andere Antwort Dynamik chemischer Geruchsstoffe (10 % 1-Nonanol und 10 % Nonanoic Säure). Die Nervenzellen im pb1 produzieren deutlich mehr Spitzen, 1-Nonanol als Nonanoic Säure während der Neuronen in pb2 deutlich weniger durch 1-Nonanol verglichen mit Nonanoic Säure (Abbildung 4) aktiviert sind. Hexanal und E-2-Hexenal kann eine Heuschrecke spürb...

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Diskussion

Insekten setzen auf Palpen, Lebensmittel Gerüche zu erkennen, und ihre Palpen werden geglaubt, um eine wichtige Rolle in der Artbildung13,27. Die Palpen sind einfache Riechorgan und zunehmende Aufmerksamkeit erhalten, wie ein attraktives Modell für die Erforschung der Neuromolecular zugrunde liegenden Chemosensation28-Netzwerke.

Labellar Insekt und spürbare SSRs wurden am Drosophila Melanogaster, An...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wird unterstützt durch ein Stipendium der National Natural Science Foundation of China (No.31472037). Jede Erwähnung von Handelsnamen oder kommerzielle Produkte in diesem Artikel wird ausschließlich zum Zweck der Bereitstellung von spezifischen Informationen und bedeutet nicht, dass eine Empfehlung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
WolframdrahtADVENTW559504Wird zum Herstellen der Elektrode und zum Befestigen des Palp
NaNO2Sigma-aldrich563218-25GWird zum Schärfen des Wolframdrahtes
verwendet AC-NetzteilSyntechA2-70Bereitstellen der Spannung beim Schärfen des Wolframdrahts
StereoskopMoticSMZ-163Wird zum Beobachten des verwendet Schärfen von Wolframdraht
MikroskopOlympusW-51Wird zur Beobachtung der Sensillen auf dem Oberkieferpalp der Heuschrecke
verwendet Intelligenter DatenerfassungscontrollerSyntechIDAC-4Echtzeit-Anzeige aller Signale vor und während der Aufnahme Stimulus-Controller
SyntechCS-55Wird zur Steuerung der Stimulusanwendung
verwendet Elektronisch MikromanipulatorC.M.D.TCFT-8301DWird für geringfügige Bewegungen der Aufzeichnungselektrode
verwendet MikromanipulatorNarishigeMN-151Wird für geringfügige Bewegungen der Referenzelektrode
verwendet LautsprecherEDIFIERR101T06Verbunden mit IDAC-4 und liefert Ton für das
Signal MagnetfußPDOKPD-101Wird verwendet, um die Elektrode und das Stimulusabgaberohr zu halten
SchwingungsisolationstischTianHeHAP-100-1208Wird verwendet, um die Schwingung von der Ausrüstung zu isolieren
GlasschieberCITOGLASZBP-407Wird zur Herstellung der Basis für den MPH
Blu-tackBostikBlu-tack-45gBefestigung des Wolframdrahtes
PasteurrohrYAREWITEGPlatzieren des Filterpapiers mit Reizen Stimuluslösungen

Referenzen

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