Method Article
Die MDS-Diagnose ist schwierig bei fehlender morphologischer Kriterien oder nicht-informativen Zytogenetik. MFC könnte dazu beitragen, den MDS diagnostischen Prozess zu verfeinern. Nützlich für die klinische Praxis zu werden, die MFC-Analyse muss auf Parametern beruhen mit ausreichender Spezifität und Sensitivität und Daten sollten zwischen verschiedenen Betreibern reproduzierbar sein.
Eine Arbeitsgruppe innerhalb der französischen Zytometrie Verband (AFC) initiiert wurde entwickelt, um die Anwendung der multiparameter Durchflusszytometrie (MFC) in Einklang zu bringen für die myeloischen Krankheit Diagnose in Frankreich. Die hier vorgestellten Protokoll war vereinbarten und angewandte September 2013 bis November 2015 in sechs französischen diagnostische Laboratorien (Universitätskliniken von Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nizza, und Lille und Institut Paoli-Calmettes in Marseille) und erlaubt die Standardisierung von Knochenmark Probe Vorbereitung und Datenerfassung. Für Neutrophilen, monozytären, und erythroiden Linien mit Knochenmark von "gesunden" Spenders Einzelpersonen (Individuen ohne Nachweis einer hämatopoetischen Krankheit) wurden drei Reifung Datenbanken entwickelt. Eine robuste Methode zur Analyse für jedes myeloid Abstammung sollte für den Routineeinsatz diagnostische Anwendung finden. Neuerkrankungen können auf die gleiche Weise analysiert und mit den üblichen Datenbanken verglichen. So, quantitative und qualitative phänotypische Anomalien identifiziert werden können und den oben genannten 2SD im Vergleich mit Daten des normalen Knochenmarkproben gezogen werden bezeichnend für Pathologie. Die größte Beschränkung ist die höhere Variabilität zwischen den Daten mit Hilfe der monoklonale Antikörper erhalten mit den Methoden basieren auf Hybridom-Technologien und derzeit in der klinischen Diagnostik eingesetzt. Festlegung von Kriterien für technische Validierung der gewonnenen Daten kann dazu beitragen das MFC-Dienstprogramm für die MDS-Diagnostik. Die Festlegung dieser Kriterien erfordert eine Analyse anhand einer Datenbank. Die Reduzierung der Ermittler Subjektivität in der Datenanalyse ist ein wichtiger Vorteil dieser Methode.
In Ermangelung der phänotypischen Marker speziell für die dysplastischen Veränderungen in myeloische Zellen während MDS Initiation und Progression schlägt ein neuer Ansatz in den letzten Jahren, basierend auf der Auswertung der Reifung Bahnen (veränderte Expression von myeloische Antigene bei der Herstellung von Reifen myeloische Zellen) oder abnorme Verteilung der verschiedenen Zelltypen im Knochenmark (BM) Zelle Fächer1,2.
Dieser Artikel stellt eine neue Methode für standardisierte Anwendung von MFC um dysplastische Veränderungen in BM myeloische Zellen Fächer im Zusammenhang mit myelodysplastischen Syndromen (MDS) oder anderen myeloischen hämatologischen Krankheiten zu erkennen. Diese Studie zeigt auch das Dienstprogramm Reifung Datenbanken für MFC Datenanalyse zu verwenden.
Standardisierung der Vorbereitung Beispielprozedur, Datenerfassung und Analyse mit den Datenbanken würde es der relevantesten phänotypischen Anomalien im Zusammenhang mit dysplastische Veränderungen in BM myeloische Zellen ermöglichen. Daher sind statistisch ausgewählte Teilmengen basierend auf gut beschriftet und anerkannter Formaten (automatische Bevölkerung Separator (APS) Diagramme, Histogramme und Punkt plottet) erforderlich für die Entwicklung einer Strategie-Analyse, die in der nachfolgenden Analyse verwendet werden können Runden. Die Entdeckung der robuste phänotypischen Anomalien bei MDS würde in Fällen mit oder ohne minimale morphologische Dysplasie und zytogenetische Aberrancies die Diagnose erleichtern. Identifikation der diskriminierenden Parameter ermöglicht die Reduzierung der Immunophenotypic Platten kann die aktuelle Resultate2, deren Anwendbarkeit im klinischen Pathologie-Labor bei schönem vereinfachen.
Diese Methode schränkt die subjektiven Interpretationen der Zytometrie Daten, wie in MDS Diagnose3signalisiert worden. Dieser Schritt ist eine Voraussetzung für die Entwicklung von automatisierten Tools für die Verarbeitung und Analyse fließen Daten4.
MDS umfasst eine heterogene Gruppe von klonalen hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Störungen in denen Spliceosome Mutationen mit spezifische epigenetische Modifikatoren den MDS-Phänotyp Ausbeute Zusammenwirken. Es ist nun bekannt, dass zusammen mit HSC Mutationen, MDS Pathophysiologie, z. B. abweichende immunvermittelte Entzündung und Wechselwirkungen zwischen malignen HSCs und die stromale Mikroumgebung des BM andere Mechanismen beteiligt sind. Diese Mechanismen bleiben jedoch schlecht verstanden. Die breite klinische und biologische Heterogenität der MDS macht die Diagnose und die Wahl der optimalen Therapie zu einer Herausforderung. In den letzten zehn Jahren mehrere Studien haben gezeigt, dass MFC oft mehr empfindlich bei der Aufdeckung von Dysplasie2 als Morphologie, aber technische und wirtschaftliche Abhängigkeiten erschweren diese Technik zu standardisieren, mit Ergebnissen oft abhängig von der Erfahrung der Dolmetscher3. Darüber hinaus ist unklar, wie MFC kann Zünglein an der Waage in Richtung MDS in Fällen mit oder ohne minimale morphologische Dysplasie und fehlender zytogenetischer Anomalien oder in Grenzfällen wie Hypocellular MDS, mit einer niedrigen Explosion zählen, von anderen nicht-klonale BM Störungen wie Knochenmarkdepression (i.e., aplastische Anämie). Es bleibt auch schwierige Grenzfälle des MDS mit einem Überschuss von Blasten von akuter myeloischer Leukämie (AML) zu unterscheiden. Aus all diesen Gründen integrieren MFC Tests in die endgültige Diagnose MDS nicht die klinischen Leitlinien. Im Jahr 2011 empfohlen die US nationale umfassende Krebs Network (NCCN) MFC für die Schätzung von den Prozentsatz von CD34 + Zellen, Erkennung von paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie Klone und Vorhandensein von zytotoxischen T-Zell-Klone in Hypocellular MDB-5. Diesen beiden letzteren Fällen beinhalten auch ein therapeutisches Ziel, da klinische Daten haben eine gute Reaktion der Patienten auf immunsuppressive Therapie6gezeigt. Die 2017 NCCN-Richtlinien, unter Berufung auf die internationalen arbeiten Group (IWG) Empfehlungen aufgeführt aberranten Immunphänotypisierung Erkennung von MFC zu den KO Kriterien für MDS-Diagnose, ohne jedoch irgendwelche Spezifikationen-6. Außerdem legt die kürzlich veröffentlichte WHO-Klassifikation, dass MFC Erkenntnisse allein nicht ausreichen, Primärdiagnose von MDS bei fehlender schlüssigen morphologischen und/oder zytogenetische Daten7zu etablieren. MFC ist jedoch als ein zusätzlicher Test zeigt die Dysregulation der myeloischen Zellen Reifung Muster und Quantifizierung den "Abstand von" normal "" für einen Patienten zu einem bestimmten Zeitpunkt im Krankheitsverlauf einsetzbar.
Diese Methode ist anwendbar bei klinischen Labors interessiert bei der Bewertung der Dysplasie bei BM myeloische Zellen unter Verwendung von MFC Immunphänotypisierung, um die Diagnose MDS oder anderen myeloischen Erkrankungen mit dysplastischen Anomalien zu verfeinern.
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Die unten aufgeführten Protokoll genehmigt wurde, durch das "Comité de Protection des Personnes" (unabhängigen Ethik-Kommission) Sud-Est 1 aus Universität Krankenhaus Saint-Etienne, Frankreich.
(1) Cytometer Einstellungen
Hinweis: Die Cytometer Einstellungen erfolgten nach Frankreich fließen Empfehlungen nach EuroFlow Verfahren "EuroFlow Standard Operating Protocol (SOP) für Inbetriebnahme und Entschädigung (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).
2. BM Probenvorbereitung
Hinweis: Führen Sie die Zelle waschen Protokoll kurz vor dem Färbeverfahren.
3. Datenerfassung
(4) Datenanalyse
Hinweis: Um die normalen BM-Datenbanken konstruieren verwendete Dateien von gesunden Spendern und von den Einzelpersonen ohne Beweise für eine hämatopoetische Krankheit waren wie folgt 11 von 18 Dateien für die Neutrophils_NM-Datenbank, 10 von 18 Dateien für Monocytes_NM Datenbank und 14 von 18 Dateien für NRC_NM-Datenbank. Die Dateien verworfen zeigte verschiedene technische Probleme, wie im Abschnitt Vertreter Ergebnisse präsentiert. Die Dateien wurden einzeln analysiert mit Hilfe der Infinicyt Software (Table of Materials), Anpassung an die verschiedenen Strategien, dargestellt in Abbildung 1A(1-3) für die Neutrophilen Abstammung (Profil Neutrophils_Maturation.inp), Abbildung 2 A Monocyte Abstammung (Profil Monocytes_Maturation.inp) und Abbildung 3A(1-2) für erythroiden Zelle Abstammung (Profil NRC_Maturation.inp).
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Die 54 BM-Proben im K-EDTA Antikoagulans geerntet wurden in die Studie einbezogen. Die MFC-Daten wurden in Ermangelung von Informationen über die Patienten analysiert. Retrospektive Studie zeigte, dass die BM-Proben von 7 gesunden Spendern (5 Rüden und 2 Hündinnen mit einem Durchschnittsalter von 47,4 [35-48], 11 Personen ohne Anzeichen einer hämatopoetischen Krankheit (8 Männer und 3 Frauen mit einem Durchschnittsalter von 57,9 [35-72]) und 36 Fälle mit verschiedenen pathologischen Bedi...
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Die Qualität der BM Aspirat könnte auf das Endergebnis auswirken. Die Polopiryna der BM-Aspirat könnte die Verteilung der Zellen in verschiedenen Stadien der Reifung aufgrund des Fehlens von Vorfahren oder Vorstufen verfälschen. Normalisierung der BM Aspiraten für Polopiryna im Fluss durchflusszytometrischen Analyse kann helfen, wahrscheinlich einen Großteil Lyse Methode beschäftigt. Darüber hinaus sind die entscheidenden Schritte zur Bewertung von BM myeloische Dysplasie durch Durchflusszytometrie die Probe Verarbeitung...
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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte. Die Durchflusszytometrie Abteilung, Hämatologie-Labor an der Universität-Krankenhaus Saint-Etienne ist Mitglied des EuroFlow Konsortiums.
In dieser Studie verwendeten Antikörper wurden von BD Biosciences bereitgestellt. Die Autoren möchte ihre Kollegin Dr. Pascale Flandrin-Gresta, vom Department of Molecular Biology, Hämatologie-Labor, Universität Krankenhaus Saint-Etienne, Frankreich, versorgte sie mit Fachwissen für die Interpretation der NGS-Daten für die zweite MDS-Fall. Die Autoren sind dankbar für die Kliniker Hämatologen für ihr Interesse und ihre Beteiligung an dieser Studie auch für die Patienten und gesunden Spendern für ihre Zustimmung zur Teilnahme an dieser Studie. Die Autoren möchte auch die "Les Amis de Rémi" Stiftung für finanzielle Unterstützung für die Veröffentlichung zu danken.
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| BD FACSCanto II Durchflusszytometer | BD Biosciences, CA, USA | SN: | 3-Laser, 4-2-2 Konfiguration, Filter und Spiegel Details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf |
| Awel C48-R Zentrifuge | AWEL Industries, FR | SN: 910120016; Modellnummer: 320002001 | Zentrifugen mit niedriger Drehzahl; Kapazität 60 FACS-Röhrchen |
| Pipetten von 10 & Mikro; L und 200µ L | |||
| Pasteurpipetten | |||
| 15 mL Falcon Röhrchen | |||
| Polypropylenröhrchen für FACS | |||
| Maus Anti-Human HLA-DR | BD Biosciences, CA, USA | 655874 | Klon L243 Maus BALB/c IgG2a, κ Fluorochrom Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm) |
| Maus Anti-Human CD45 | BD Biosciences, CA, USA | 560777 | Klon HI30 Maus IgG1, κ Fluorochrom Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm) |
| Maus Anti-Human CD16 | BD Biosciences, CA, USA | 656146 | Klon CLB/fcGran1 Maus BALB/c IgG2a, κ Fluorochrom FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Maus Anti-Human CD13 | BD Biosciences, CA, USA | 347406 | Klon L138 Maus BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrom PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Maus Anti-Human CD34 | BD Biosciences, CA, USA | 347222 | Klon 8G12 Maus BALB/c IgG1, κ Fluorochrom PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm) |
| Maus Anti-Human CD117 | BD Biosciences, CA, USA | 339217 | Klon 104D2 Maus BALB/c IgG1 Fluorochrom PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm) |
| Maus Anti-Human CD11b | BD Biosciences, CA, USA | 333143 | Klon D12 Maus BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrom APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm |
| Maus Anti-Human-CD10 | BD Biosciences, CA, USA | 646783 | Klon HI10A Maus BALB/c IgG1, κ Fluorochrom APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Maus Anti-Human CD35 | BD Biosciences, CA, USA | 555452 | Klon E11 Maus IgG1, κ Fluorochrom FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Maus Anti-Human CD64 | BD Biosciences, CA, USA | 644385 | Klon 10.1 Maus BALB/c IgG1, κ Fluorochrom PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Maus Anti-Human CD300e | Immunostep | IREM2A-T100 | Klon UP-H2 Maus BALB/c IgG1, k Fluorochrom APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Maus Anti-Human-CD14 | BD Biosciences, CA, USA | 641394 | Klon MoP9 Maus BALB/c IgG2b, κ Fluorochrom APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Maus Anti-Human CD36 | BD Biosciences, CA, USA | 656151 | Klon CLB-IVC7 Maus IgG1, κ Fluorochrom FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Maus Anti-Human CD105 | BD Biosciences, CA, USA | 560839 | Klon 266 Maus BALB/c IgG1, κ Fluorochrom PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Maus Anti-Human CD33 | 345800 | Klon P67.6 Maus BALB/c IgG1, κ Fluorochrom APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) | |
| Maus Anti-Human CD71 | BD Biosciences, CA, USA | 655408 | Klon M-A712 Maus BALB/c IgG2a, κ Fluorochrom APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Lyselösung 10x Konzentrat (IVD) | BD Biosciences, CA, USA | 349202 | |
| FACSFlow Sheath Fluid | BD Biosciences, CA, USA | 342003 | |
| FACSDiva CS& T IVD-Beads | BD Biosciences, CA, USA | 656046 | |
| RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS | Cytognos, Salamanca, Spanien | SPH-RCP-30-5A | Lose EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01 |
| Kompensationspartikel Multicolor CompBeads (CE/IVD) | BD Biosciences, CA, USA | Ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291 | |
| Diva-Softwareversionen 6.1.2 und 6.1.3 | BD Biosciences, CA, USA | ||
| Phosphatgepufferte Kochsalztabletten | R& D Systems, Minneapolis, USA | 5564 | |
| Rinderserumalbumin ( BSA) | Sigma-Aldrich, Frankreich | A9647 | |
| Natriumazid 99% | Sigma-Aldrich, Frankreich | 199931 | |
| Infinicyt Software Version 1.8.0.e | Cytognos, Salamanca, Spanien |
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