Die MDS-Diagnose ist schwierig bei fehlender morphologischer Kriterien oder nicht-informativen Zytogenetik. MFC könnte dazu beitragen, den MDS diagnostischen Prozess zu verfeinern. Nützlich für die klinische Praxis zu werden, die MFC-Analyse muss auf Parametern beruhen mit ausreichender Spezifität und Sensitivität und Daten sollten zwischen verschiedenen Betreibern reproduzierbar sein.
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Methodenartikel
Datenbank-geführte Durchflusszytometrie zur Auswertung von Knochenmark myeloische Zellen Reifung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Eine Arbeitsgruppe innerhalb der französischen Zytometrie Verband (AFC) initiiert wurde entwickelt, um die Anwendung der multiparameter Durchflusszytometrie (MFC) in Einklang zu bringen für die myeloischen Krankheit Diagnose in Frankreich. Die hier vorgestellten Protokoll war vereinbarten und angewandte September 2013 bis November 2015 in sechs französischen diagnostische Laboratorien (Universitätskliniken von Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nizza, und Lille und Institut Paoli-Calmettes in Marseille) und erlaubt die Standardisierung von Knochenmark Probe Vorbereitung und Datenerfassung. Für Neutrophilen, monozytären, und erythroiden Linien mit Knochenmark von "gesunden" Spenders Einzelpersonen (Individuen ohne Nachweis einer hämatopoetischen Krankheit) wurden drei Reifung Datenbanken entwickelt. Eine robuste Methode zur Analyse für jedes myeloid Abstammung sollte für den Routineeinsatz diagnostische Anwendung finden. Neuerkrankungen können auf die gleiche Weise analysiert und mit den üblichen Datenbanken verglichen. So, quantitative und qualitative phänotypische Anomalien identifiziert werden können und den oben genannten 2SD im Vergleich mit Daten des normalen Knochenmarkproben gezogen werden bezeichnend für Pathologie. Die größte Beschränkung ist die höhere Variabilität zwischen den Daten mit Hilfe der monoklonale Antikörper erhalten mit den Methoden basieren auf Hybridom-Technologien und derzeit in der klinischen Diagnostik eingesetzt. Festlegung von Kriterien für technische Validierung der gewonnenen Daten kann dazu beitragen das MFC-Dienstprogramm für die MDS-Diagnostik. Die Festlegung dieser Kriterien erfordert eine Analyse anhand einer Datenbank. Die Reduzierung der Ermittler Subjektivität in der Datenanalyse ist ein wichtiger Vorteil dieser Methode.
Einleitung
In Ermangelung der phänotypischen Marker speziell für die dysplastischen Veränderungen in myeloische Zellen während MDS Initiation und Progression schlägt ein neuer Ansatz in den letzten Jahren, basierend auf der Auswertung der Reifung Bahnen (veränderte Expression von myeloische Antigene bei der Herstellung von Reifen myeloische Zellen) oder abnorme Verteilung der verschiedenen Zelltypen im Knochenmark (BM) Zelle Fächer1,2.
Dieser Artikel stellt eine neue Methode für standardisierte Anwendung von MFC um dysplastische Veränderungen in BM myeloische Zellen Fächer im Zusammenhang mit ....
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Protokoll
Die unten aufgeführten Protokoll genehmigt wurde, durch das "Comité de Protection des Personnes" (unabhängigen Ethik-Kommission) Sud-Est 1 aus Universität Krankenhaus Saint-Etienne, Frankreich.
(1) Cytometer Einstellungen
Hinweis: Die Cytometer Einstellungen erfolgten nach Frankreich fließen Empfehlungen nach EuroFlow Verfahren "EuroFlow Standard Operating Protocol (SOP) für Inbetriebnahme und Entschädigung (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).
- Monatliche Inbetriebnahme
- Schalten Sie die Cytometer. Sicherstellen Sie, dass alle Flüssigkeitsstände angemessen und offene....
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Ergebnisse
Die 54 BM-Proben im K-EDTA Antikoagulans geerntet wurden in die Studie einbezogen. Die MFC-Daten wurden in Ermangelung von Informationen über die Patienten analysiert. Retrospektive Studie zeigte, dass die BM-Proben von 7 gesunden Spendern (5 Rüden und 2 Hündinnen mit einem Durchschnittsalter von 47,4 [35-48], 11 Personen ohne Anzeichen einer hämatopoetischen Krankheit (8 Männer und 3 Frauen mit einem Durchschnittsalter von 57,9 [35-72]) und 36 Fälle mit verschiedenen pathologischen Bedi.......
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Diskussion
Die Qualität der BM Aspirat könnte auf das Endergebnis auswirken. Die Polopiryna der BM-Aspirat könnte die Verteilung der Zellen in verschiedenen Stadien der Reifung aufgrund des Fehlens von Vorfahren oder Vorstufen verfälschen. Normalisierung der BM Aspiraten für Polopiryna im Fluss durchflusszytometrischen Analyse kann helfen, wahrscheinlich einen Großteil Lyse Methode beschäftigt. Darüber hinaus sind die entscheidenden Schritte zur Bewertung von BM myeloische Dysplasie durch Durchflusszytometrie die Probe Verarbeitung.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte. Die Durchflusszytometrie Abteilung, Hämatologie-Labor an der Universität-Krankenhaus Saint-Etienne ist Mitglied des EuroFlow Konsortiums.
Danksagungen
In dieser Studie verwendeten Antikörper wurden von BD Biosciences bereitgestellt. Die Autoren möchte ihre Kollegin Dr. Pascale Flandrin-Gresta, vom Department of Molecular Biology, Hämatologie-Labor, Universität Krankenhaus Saint-Etienne, Frankreich, versorgte sie mit Fachwissen für die Interpretation der NGS-Daten für die zweite MDS-Fall. Die Autoren sind dankbar für die Kliniker Hämatologen für ihr Interesse und ihre Beteiligung an dieser Studie auch für die Patienten und gesunden Spendern für ihre Zustimmung zur Teilnahme an dieser Studie. Die Autoren möchte auch die "Les Amis de Rémi" Stiftung für finanzielle Unterstützung für die Veröffentlichung zu danken.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| BD FACSCanto II Durchflusszytometer | BD Biosciences, CA, USA | SN: | 3-Laser, 4-2-2 Konfiguration, Filter und Spiegel Details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf |
| Awel C48-R Zentrifuge | AWEL Industries, FR | SN: 910120016; Modellnummer: 320002001 | Zentrifugen mit niedriger Drehzahl; Kapazität 60 FACS-Röhrchen |
| Pipetten von 10 & Mikro; L und 200µ L | |||
| Pasteurpipetten | |||
| 15 mL Falcon Röhrchen | |||
| Polypropylenröhrchen für FACS | |||
| Maus Anti-Human HLA-DR | BD Biosciences, CA, USA | 655874 | Klon L243 Maus BALB/c IgG2a, κ Fluorochrom Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm) |
| Maus Anti-Human CD45 | BD Biosciences, CA, USA | 560777 | Klon HI30 Maus IgG1, κ Fluorochrom Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm) |
| Maus Anti-Human CD16 | BD Biosciences, CA, USA | 656146 | Klon CLB/fcGran1 Maus BALB/c IgG2a, κ Fluorochrom FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Maus Anti-Human CD13 | BD Biosciences, CA, USA | 347406 | Klon L138 Maus BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrom PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Maus Anti-Human CD34 | BD Biosciences, CA, USA | 347222 | Klon 8G12 Maus BALB/c IgG1, κ Fluorochrom PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm) |
| Maus Anti-Human CD117 | BD Biosciences, CA, USA | 339217 | Klon 104D2 Maus BALB/c IgG1 Fluorochrom PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm) |
| Maus Anti-Human CD11b | BD Biosciences, CA, USA | 333143 | Klon D12 Maus BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrom APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm |
| Maus Anti-Human-CD10 | BD Biosciences, CA, USA | 646783 | Klon HI10A Maus BALB/c IgG1, κ Fluorochrom APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Maus Anti-Human CD35 | BD Biosciences, CA, USA | 555452 | Klon E11 Maus IgG1, κ Fluorochrom FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Maus Anti-Human CD64 | BD Biosciences, CA, USA | 644385 | Klon 10.1 Maus BALB/c IgG1, κ Fluorochrom PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Maus Anti-Human CD300e | Immunostep | IREM2A-T100 | Klon UP-H2 Maus BALB/c IgG1, k Fluorochrom APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Maus Anti-Human-CD14 | BD Biosciences, CA, USA | 641394 | Klon MoP9 Maus BALB/c IgG2b, κ Fluorochrom APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Maus Anti-Human CD36 | BD Biosciences, CA, USA | 656151 | Klon CLB-IVC7 Maus IgG1, κ Fluorochrom FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Maus Anti-Human CD105 | BD Biosciences, CA, USA | 560839 | Klon 266 Maus BALB/c IgG1, κ Fluorochrom PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Maus Anti-Human CD33 | 345800 | Klon P67.6 Maus BALB/c IgG1, κ Fluorochrom APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) | |
| Maus Anti-Human CD71 | BD Biosciences, CA, USA | 655408 | Klon M-A712 Maus BALB/c IgG2a, κ Fluorochrom APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Lyselösung 10x Konzentrat (IVD) | BD Biosciences, CA, USA | 349202 | |
| FACSFlow Sheath Fluid | BD Biosciences, CA, USA | 342003 | |
| FACSDiva CS& T IVD-Beads | BD Biosciences, CA, USA | 656046 | |
| RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS | Cytognos, Salamanca, Spanien | SPH-RCP-30-5A | Lose EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01 |
| Kompensationspartikel Multicolor CompBeads (CE/IVD) | BD Biosciences, CA, USA | Ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291 | |
| Diva-Softwareversionen 6.1.2 und 6.1.3 | BD Biosciences, CA, USA | ||
| Phosphatgepufferte Kochsalztabletten | R& D Systems, Minneapolis, USA | 5564 | |
| Rinderserumalbumin ( BSA) | Sigma-Aldrich, Frankreich | A9647 | |
| Natriumazid 99% | Sigma-Aldrich, Frankreich | 199931 | |
| Infinicyt Software Version 1.8.0.e | Cytognos, Salamanca, Spanien |
Referenzen
- Orfao, A., Ortuño, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes. Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).
- Porwit, A., et al. Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow....
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Nachdrucke und Genehmigungen
