Häufige Schwanzspitze Blutabnahme bei Mäusen zur Beurteilung der pulsierender Luteinisierendes Hormon-Sekretion

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Schwanzspitze Blut-Probenahme-Protokoll für häufige Musterkollektion in hemmungslose Mäuse. Diese Methode ist nützlich für die Beurteilung der Muster der pulsierender Luteinisierendes Hormon-Sekretion und könnte für die Analyse von anderen zirkulierenden Faktoren angepasst werden.

Zusammenfassung

In vielen Hormonsystem zirkulierende Faktoren oder Hormone werden nicht kontinuierlich freigesetzt, aber als diskrete Impuls als Reaktion auf ein Releasing-Faktor sezerniert werden. Einpunkt-Probenahme Maßnahmen ausreichen, um die biologische Bedeutung der sekretorischen Muster von pulsierender Hormonen unter normalen physiologischen Bedingungen oder bei Dysregulation verstehen. Luteinisierendes Hormon (LH) ist durch den vorderen Hypophyse Gonadotrope Zellen synthetisiert und abgesondert in eine pulsierende Muster, die häufige Sammlung von Blutproben für Puls Beurteilung erfordert. Dies ist nicht möglich bei Mäusen bis vor kurzem durch die Entwicklung eines hochempfindliche LH Assays gewesen und Fortschritt in der Technik für die häufigen leise Musterkollektion, zunächst von Steyn und Kollegen beschrieben. ¹ hier beschreiben wir ein Protokoll für die Probeentnahme häufige peripherem Blut von Mäusen mit ausreichend Umgang mit Akklimatisation pulsatile Sekretion von LH zu erkennen. Das aktuelle Protokoll beschreibt eine erweiterte Eingewöhnungszeit, die Beurteilung der robusten und kontinuierliche Impulse von LH über mehrere Stunden ermöglicht. In diesem Protokoll die Schwanzspitze wird abgeschnitten und Blut wird aus der Rute mit einer handgeführten Pipette gesammelt. Für die Beurteilung der pulsatile LH bei Gonadectomized Mäusen, serielle Proben sind gesammelt alle 5-6 Minuten für 90-180 min. wichtiger ist, die Ansammlung von Blut und Messung der robuste Impulse von LH in wach, frei Verhalten Mäusen gegeben angemessenen Umgang mit erreicht werden können Akklimatisierung und um Umweltstressfaktoren zu minimieren. Ausreichende Akklimatisierung kann innerhalb von 4 bis 5 Wochen vor der Blutentnahme erreicht werden. Dieses Protokoll zeigt Fortschritte in der Methodik zu Vollblut Probenahmen zur Beurteilung der pulsatile LH-Sekretion Muster über mehrere Stunden in der Maus, eine mächtige Tiermodell für neuroendokrine Forschung zu gewährleisten.

Einleitung

Gonade Funktion bei Säugetieren ist abhängig von Gonadotropin-Sekretion, Luteinisierendes Hormon (LH) und Follikel-stimulierendes Hormon aus der Hypophyse. Die Gonadotropine werden in entweder ein pulsierender oder Welle Muster als Reaktion auf hypothalamische Sekretion von Gonadotropin – Releasing Hormon (GnRH) abgesondert. Die Synthese und Sekretion von LH und FSH sind durch endokrine, Parakrine und Autokrine handeln aus einer Vielzahl von Molekülen einschließlich Hypothalamus GnRH, Gonaden Steroidhormone und Activin Inhibin Follistatin-System sowie eine Vielzahl von geregelt. physiologischen Bedingungen einschließlich Stress und Energiebilanz. ²

Das pulsierende Muster von LH im Blut entspringt eher plötzliche Entlastung von LH in peripherem Blut, gefolgt von ungefähr exponentiellen Beseitigung. Wichtige Merkmale des Musters die Frequenz jeder LH-Entleerung und die Amplitude der LH Antwort sind, sind beide, teilweise durch die Freisetzung von GnRH gebührend zu Schwierigkeiten bei der Hypothalamus-Hypophysen Portal Blutentnahme zur Messung von diktiert pulsatile GnRH, Probenahme und Messung von LH dient als Proxy für GnRH Verordnung der Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse. Daher wird kritische Information kodiert in Frequenz und Amplitude der LH Impulse, die aus einer einzigen Probe nicht ermittelt werden kann.

Analyse der pulsatile LH-Sekretion seit jeher auf große Säugetiere (Schafe, Menschen und Primaten) aufgrund ihrer großen Blutvolumen und Toleranz für die häufige Blutentnahme Probe beschränkt. Bei Nagetieren häufige Blutentnahme beschränkte sich auf die Ratte und erreicht über Innewohnung Vorhofflimmern Katheter. ^{3 , 4} die relativ niedrigen Kosten und Verfügbarkeit von genetischen (z. B. Cre-Lox, CRISPR) und komplexen neuronalen Schaltung (z.B. optogenetik, Chemogenetics) Manipulationen machen Mäuse ein attraktives Modellorganismus; jedoch erreichen von häufigen Blutproben und anschließende Analyse der LH-Konzentrationen bis vor kurzem schwer fassbaren bewährt. Diese gewaltige Aufgabe wurde erstmals von Steyn und Mitarbeitern. ¹ , da dann mehrere Labore haben damit begonnen, häufige Blutentnahme und ultra-sensitive LH-Assays einzuschätzen pulsatile LH-Sekretion in einer Vielzahl von experimentellen Paradigmen zu nutzen. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9} es sei darauf hingewiesen, dass das Streben nach einer praktischen Methode des Sammelns mehrere Blutproben von Mäusen für mindestens 40 Jahre¹⁰ mit mehreren Verbesserungen auf den Weg machte ausgeführt wurde. ^{11 , 12}

Bewertung des LH Pulsmuster (d. h. Frequenz und Amplitude) stellt eine wichtige Verfeinerung bei der Überwachung der basalen Gonadotropin-Sekretion in dieser genetisch gefügig Tiermodell. Traditionell wurden die LH-Konzentrationen in den Mäusen in einer einzigen Blutprobe bestimmt. Eine Schwäche des Einpunkt-Proben ist ein sehr variabel Datensatz weil LH-Konzentrationen sind natürlich bei jedem Impuls schwankt. Eine weitere Schwäche ist, dass isolierte Messungen von Natur aus wichtige Informationen vermittelt durch die Muster des LH-Puls-Sekretion verpassen. So eine Methode zum Sammeln von häufigen Blutproben in frei verhält, hemmungslose Mäuse (außer schonender Umgang während der Probenahme) Erweiterte Informationen und für viele Labors untersucht pulsatile Hormon Verordnung als nützlich erweisen.

Wir beschreiben hier, ein Protokoll für die Sammlung von häufigen (alle 6 min) Blutproben von wach, hemmungslose Mäuse. Wichtig ist, sind wir ein Handling Akklimatisation Protokoll, das ermöglicht eine stabile und kontinuierliche Erkennung der pulsatile LH-Sekretion in Vollblut-Proben eine Länge der Zeit, in der Pre- und Post-Beurteilung auf eine akute Herausforderung bestimmt werden kann gesammelt, wie die Antwort auf die psychosozialen Belastung der Immobilisierung und Zurückhaltung. Ein effektive Assay für die LH-Konzentrationen von Vollblut-Proben wurde zuvor beschrieben; ¹ dieses Protokoll auf eine Methode zur Erfassung der Blutproben für LH Pulsmessung ausgerichtet ist.

Protokoll

Die hier beschriebene Methode ist in Übereinstimmung mit den nationalen Instituten der Gesundheit Animal Care und Nutzung Richtlinien und sind durch die institutionelle Animal Care und Use Committee an der University of California, San Diego autorisiert worden.

1. Gewöhnung an Handling

1. Verfahren
   1. Legen Sie Maus Käfige in der Biosicherheit Kabinett. Entfernen Sie die erste Maus aus dem Käfig und auf einer geeigneten Fläche (z. B. einen sauberen Käfig Deckel) innerhalb der Biosicherheit Kabinett.
   2. Sanft Zurückhalten der Maus auf die zu bearbeitende Fläche durch die Schwanzwurzel mit Zeigefinger und Daumen einer Hand halten. Dann, fest die ventrale Oberfläche der Rute, von der Basis bis zur Spitze der Rute, mit Zeigefinger und Daumen der anderen Hand zu streicheln. Wiederholen Sie dies 6 Mal streicheln (d. h. 1 Satz) und die Maus wieder in seinen Käfig.
   3. Warten Sie 6 min und wiederholen Sie Schritt 1.1.2.
      Hinweis: Insgesamt werden Schritt 1.1.2 4 mal per Mausklick (d.h. 4 Sets mit 6 Schläge), wiederholt werden, dass jede Maus insgesamt 24 Schweif Striche an jedem Tag der Behandlung erhalten.
2. Die Häufigkeit der täglichen Umgang
   1. Von fünf bis zwei Wochen vor dem geplanten Blut Sammlung behandeln Sie Mäuse wie unter Schritt 1.1, fünf Tage pro Woche (Mäuse sind nicht am Samstag oder Sonntag bis zu den letzten beiden Wochen Eingewöhnungszeit behandelt).
   2. Wenn experimenteller Behandlung während der Probenahme-Zeit keine weitere Behandlung (z.B. scruffen oder intraperitoneale Injektion) enthalten soll, akklimatisieren Sie die Mäuse mit dieser Handhabung Aktivität während jeder Behandlung Sitzung.
      Hinweis: Zum akklimatisieren, Injektionsverfahren, mithilfe einer stumpfen Nadel eine Scheininjektion ausführen.
   3. Während der zwei Wochen vor dem geplanten Blut Sammlung behandeln Sie Mäuse wie unter 1.1, sieben Tage die Woche.
   4. Mindestens zwei Wochen vor dem geplanten Blut Sammlung, Haus Mäuse paarweise Störungen für die Mäuse bei der Probenahme zu minimieren.

2. Vorbereitung des Blutentnahmeröhrchen

1. Gromer LH testpuffer in einer Glasflasche vorbereiten: 0,2 % Rinderserumalbumin und 0,05 % Tween 20 in PBS [0,2 g KCl, 8 g NaCl, 1,44 g Na₂HPO₄ (wasserfrei), 0,24 g KH₂PO₄, Reinstwasser, 1 L, pH 7,4, Filter und Autoklaven] , bei 4° c Lagern ¹
   Hinweis: Volumen des empfindsamen LH testpuffer vorbereitet werden kann basierend auf der Anzahl der Proben und das Volumen pro Probe wie unten (2.2 & Diskussion) angegeben berechnet werden
2. Blutentnahmeröhrchen (0,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen) vorzubereiten. Beschriften Sie Rohre und aliquoten testpuffer (57 µL Puffer pro Röhre; beachten Sie, dass dieses Volumen variieren je nach Blutvolumen gesammelt oder das Verhältnis des Blutes in den Puffer gewünscht). Rohre können bereit Tage vor der Probenahme, Lagerung bei 4 ° C.

3. Blutentnahme

1. Vorbereitung der Blut Sammlung Materialien.
   1. Biosafety-Kabinett für den Einsatz vorzubereiten, und ordnen Sie die folgenden Materialien in der Haube oder auf einem Wagen in der Nähe: 10 µL pipette (Set 3 µL oder gewünschte Blutvolumen Sammlung), Pipettenspitzen, Abfallbehälter für gebrauchte Pipettenspitzen, Timer, Ausdruck mit Tierzahlen und Probe-Nummern ( für Hinweise zur Probenahme oder tierischen Fragen) Eis-Eimer mit Blutentnahmeröhrchen, Schere und kleine Gaze (2 "x 2").
      Hinweis: Die "hochzählen" Funktion auf einem Labor-Timer ist nützlich, weil sie nicht über ein akustisches Signal, das die Mäuse stören könnten
   2. Verwenden Sie eine dauerhafte Markierung zum Ende jeder Maus (in der Nähe der Basis) zu markieren, um schnelle Identifizierung der richtigen Maus während der Probenahme zu unterstützen.
2. Zuschneiden der Schweif und Pre-Blut Sammlung Zubereitung.
   1. 45 min vor dem Start der Blutentnahme entfernen Sie die erste Maus aus seinem Käfig und legen Sie auf einer geeigneten Oberfläche (ein sauberen Käfig Deckel eignet sich gut) innerhalb der Biosicherheit Kabinett.
   2. Scharfe, sterile Schere verwenden, um 1-2 mm von der Maus Schwanzspitze, nach aseptische Präparation zu entfernen (z.B. mit Alkohol und Betadine scrub).
      Hinweis: Dies kann die wach Tiere mit sanften Zurückhaltung oder Isoflurane Narkose erfolgen.  Darüber hinaus kann Analgesie erfolgen, entsprechend der Empfehlung des lokalen IACUC.
   3. Ende der Maus vorsichtig zu streicheln, wie oben beschrieben (1.1.2; 1-2 Striche sind in der Regel ausreichend) bis das Tröpfchen Blut Formen an der Schwanzspitze.
   4. Verwenden Sie eine Pipette mit einer sauberen Spitze, 3 µL Blut aus der Schwanzspitze zu sammeln und entsorgen Sie die PIPETTENSPITZE mit Blut.
   5. Sicherzustellen Sie vor der Rückkehr der Maus in seinem Käfig, dass die Durchblutung gestoppt hat. Falls erforderlich, üben Sie sanften Druck mit steriler Gaze.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1 - 3.2.5 für alle Mäuse. Fest der Maus Rute streicheln, bis ein Tropfen Blut Formen an der Spitze der Rute können nachfolgende Blutproben gesammelt werden.
      Hinweis: Wenn ein Tröpfchen Blut nicht nach festen Schlägen gehört, kann die Rute mit einem Tupfer getränkt in Kochsalzlösung abgetupft werden. Klumpen sind wahrscheinlicher zu bilden, während der weniger häufigen Probenahme (d. h. > 15 Minuten-Intervallen). Sobald das Gerinnsel aus der Vene deaktiviert ist, kann die Probenahme fortfahren.
   7. Weiterhin 3 µL Blut aus jedem Mausklick wie beschrieben alle 6 min für ca. 45 min in dieser Vorbereitungsphase vor Blutentnahme zu sammeln. Entsorgen Sie den Blut und Pipette Tipp.
3. Die Blutabnahme
   1. Sammeln Sie 3 µL Blut aus der Schwanzspitze wie oben beschrieben. Vorsicht um sicherzustellen, dass die gesamte 3 µL Probe die PIPETTENSPITZE (ohne Bläschen oder Bettwäsche Kontamination) berücksichtigt wird. Werfen Sie die Blutprobe in der Assay-Puffer in einem beschrifteten Röhrchen. Durch Umkehrung mischen und das Rohr zu Eis zurück.
   2. Sicherzustellen Sie vor der Rückkehr der Maus in seinem Käfig, dass der Blutfluss gestoppt hat. Falls erforderlich, üben Sie sanften Druck mit steriler Gaze.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.1 - 3.3.2 für jede Maus, alle 6 min. für die Dauer der vorgegebenen Probenahme. Überwachen Sie jedes Tier für Zeichen der Bedrängnisses (z. B. teilweise geschlossenen Augenlider, Buckliger Position [nicht verursacht durch eine andere Behandlung] oder mangelnde Reaktion auf Umgang) zu und kündigen Sie Probenahme, zu, falls erforderlich.
      Hinweis: Behavioral Ängste oder andere Komplikationen, die Beendigung der Probenahme verlangen auftreten extrem selten in unserem Labor.
   4. Wenn Tiere nicht nach Blutentnahme eingeschläfert werden, sicherzustellen Sie, dass der Blutfluss aus der Schwanzspitze zum Stillstand gekommen ist. Wischen Sie Verschüttetes Blut aus dem Inneren des Tieres Käfig (oder Änderung Käfige) und die Tierkäfige ins Rack Gehäuse.

4. Probieren Sie Verarbeitung und Analyse

1. Speichern Sie Blutproben bei-20 ° C bis zur Analyse.
   Hinweis: LH ist in Vollblut-Proben in testpuffer verdünnt untersucht; keine Trennung von Sera oder Plasma ist vor der Lagerung oder Analyse erforderlich.
2. Assay Blutproben von empfindsamen ELISA als zuvor beschriebenen Werte¹ und Bericht in ng/mL Vollblut nach Korrektur für die Verdünnung von Probenvolumen im Assay-Puffer.
3. LH-Pulse im DataSet zu identifizieren. Berechnen Sie und vergleichen Sie, mittlere Puls Amplitude und Pulsfrequenz (oder Inter Impulsabstand) je nach Bedarf für den Datensatz.
   Hinweis: Veröffentlichten Kriterien^13,14 , Programme,^15,16 zur Erkennung von LH Hülsenfrüchte sind verfügbar.

Ergebnisse

Repräsentative LH Pulsmuster aus 4 Mäuse sind in Abbildung 1 (Daten nachgedruckt von Yang Et Al., 2017) dargestellt. LH war in häufige Blutproben, die Reaktion auf eine akute psychosoziale Belastung Herausforderung bestimmen gemessen. Erwachsene weibliche C57/Bl6 Mäuse wurden ovariectomized und behandelt wie in diesem Protokoll für häufige Blutentnahme. Blutproben wurden für die ersten 90 min. bei allen Tieren herstellen eine Vorbehandlung Baseline d...

Diskussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die häufige Blutentnahme Vollblut Schwanzspitze Proben für die Bewertung der pulsatile LH-Sekretion in den Mäusen. Dieses Protokoll ermöglicht die Entnahme von Proben für die Erkennung von akuten Veränderungen in pulsatile LH-Sekretion nach Exposition gegenüber psychosozialer Stress und eignet sich gut zur Beurteilung der LH Impulse unter anderen akuten oder chronischen Manipulationen.

Ein wesentlicher Bestandteil dieses Protokolls für zuverlässige und ro...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Biosicherheitsschrank	Lab Products Inc	L/F-B
Rinderserumalbumin	Sigma	A5403
Tween-20	Sigma	P2287
KCl	Sigma	P9333
NaCl	Sigma	S7653
Na2HPO4 (wasserfrei)	Sigma	S7907
KH2PO4	Sigma	P5655
Reinstwasser	Millipore		Gereinigtes und gefiltertes Wasser
Broome Nagetier-Rückhaltevorrichtung	Harvard-Gerät	52-0460	Für die Blutentnahme nicht erforderlich, wurden aber bei der Erhebung repräsentativer Daten verwendet.
DynPeak	n/a	n/a	http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001