Methodenartikel

Kontrast-passende Reinigungsmittel im Small-Angle Neutron Streuexperimente für Membrane Protein strukturelle Analyse und Modellierung von Ab Initio

DOI:

10.3791/57901

⸱

21. Oktober 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie ein Modell mit niedriger Auflösung ab-initio und Strukturdetails Waschmittel solubilisiert Membranprotein in Lösung mit kleinen Winkel Neutronenstreuung mit Kontrast-matching des Waschmittels zu erhalten.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das biologische Small-Angle Neutron Streuung Instrument in der High-Flux-Isotope Reaktor des Oak Ridge National Laboratory ist widmet sich der Erforschung der biologischen Materialien, Biokraftstoff, die Verarbeitung und Bioinspirierte Materialien für Nanometer Mikrometer Längenskalen. Für die Untersuchung der physikalischer Eigenschaften (z.B. Größe und Form) von Membranproteinen hier vorgestellten Methoden (hier, MmIAP, eine Intramembrane Aspartyl-Protease aus Methanoculleus Marisnigri) in Lösungen von Micelle bildenden Reinigungsmittel sind gut geeignet für dieses kleine Winkel Neutronen-Streuung Instrument, unter anderem. Ndere biophysikalische Charakterisierung sind durch ihre Unfähigkeit, die Waschmittel Beiträge in einer komplexen Struktur von Protein-Reinigungsmittel Adresse behindert. Darüber hinaus bietet Zugriff auf die Bio-Deuterierung Labor einzigartige Fähigkeiten für die Vorbereitung der großflächige Anbau und Deuterium-markierten Proteine für verbesserte streusignal aus dem Protein zum Ausdruck zu bringen. Während diese Technik bietet keine strukturelle Details in hoher Auflösung, die strukturelle Wissenslücke für Membranproteine enthält viele adressierbare Bereiche der Forschung ohne in der Nähe von atomarer Auflösung. Beispielsweise enthalten diese Bereiche Bestimmung der Oligomere Staaten, Komplexbildung, Konformationsänderungen bei Störung und Faltung/Entfaltung Ereignisse. Diese Untersuchungen können leicht durch Anwendungen dieser Methode erreicht werden.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membranproteine sind um schätzungsweise 30 % aller Gene1 codiert und repräsentieren eine deutliche Mehrheit der Ziele für die modernen Arzneimitteln. 2 diese Proteine führen eine Vielzahl von lebenswichtigen Zellfunktionen,3 aber trotz ihrer Fülle und ihrer Bedeutung – nur etwa 1 % der gesamten Strukturen hinterlegt in der Forschung Collaboratory für strukturelle Bioinformatik (RCSB) Protein darstellen Daten Bank. 4 aufgrund ihrer teilweise hydrophoben Natur, Strukturaufklärung von Proteinen, Membrane-springen überaus schwierig wurde. 5 , 6 , 7

Wie viele biophysikalische Techniken Monodisperse Partikel in Lösung für die Messung erforderlich, wurde Membranproteine von native Membranen zu isolieren und stabilisiert diese Proteine in eine lösliche Mimik der native Membranen ein aktives Gebiet der Forschung in den letzten Jahren Jahrzehnten. 8 , 9 , 10 diese Untersuchungen zur Entwicklung der vielen neuartigen AMPHIPHILE Baugruppen führten zu solubilisieren Membranproteine, wie Nanodiscs,11,12,13 Bicelles14,15 und Amphipols. 16 , 17 bleibt jedoch die Verwendung von Reinigungsmittel Micellen einer der am weitesten verbreitete und einfache Ansätze für die Erfüllung der Anforderungen der Löslichkeit eines gegebenen Proteins. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 leider gibt es kein einziges Reinigungsmittel oder magische Mischung von Reinigungsmitteln derzeit, die alle Membranproteine gerecht wird; Diese Bedingungen müssen daher empirisch für die individuellen Anforderungen jedes Protein kontrolliert werden. 26 , 27

Reinigungsmittel selbst-zusammenbauen in Lösung über ihre kritischen Micelle Konzentration zu aggregieren Strukturen Mizellen genannt. Mizellen bestehen aus vielen Waschmittel Monomere (in der Regel im Bereich von 20-200) mit hydrophoben Alkyl-Ketten bilden eine Micelle Kern- und hydrophilen Kopfgruppen angeordnet in einem Micelle Shell Layer mit Blick auf das wässrige Lösungsmittel. Das Verhalten von Waschmitteln und Micelle Bildung wurde von Charles Tanford in Der hydrophobe Effekt,28 und Größen klassisch beschrieben und Formen von Micellen aus häufig verwendeten Reinigungsmittel in Membran-Protein-Studien wurden mit kleinen Winkel Streuung charakterisiert. 29 , 30 Waschmittel Organisation über Membranproteine wurde ebenfalls untersucht, und die Bildung von Protein-Reinigungsmittel-komplexen (PDCs) dürfte mit Waschmittel Moleküle, die rund um das Protein in einer Anordnung, die das ordentliche Waschmittel ähnelt Mizellen. 31

Eine hinzugefügte Vorteil bei der Verwendung von Reinigungsmitteln ist, dass die resultierenden Micelle Eigenschaften bearbeitet werden können, durch die Integration von anderen Waschmitteln. Viele Waschmittel weisen ideale mischen, und wählen Sie Eigenschaften von gemischten Micellen können sogar vorhergesagt werden, von den Komponenten und Verhältnis zu mischen. 22 jedoch kann das Vorhandensein von Waschmittel noch für biophysikalische Charakterisierungen Herausforderungen beitragen, das gesamte Signal. Signal von Waschmittel in der PDC ist beispielsweise mit Röntgen- und Lichtstreuung Techniken, praktisch nicht von Protein. 32 Untersuchungen mit einzelnen Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) verlassen in der Regel auf eingeschlossene Partikel (gefroren); strukturelle Details des Proteins sind noch verdeckt durch bestimmte Reinigungsmittel oder eine hohe Konzentration des Reinigungsmittels, der Hintergrund verleiht. 33 alternative Ansätze zur Interpretation der vollen PDC-Struktur (inklusive Waschmittel) durch Berechnungsmethoden wurden unternommen, die darauf abzielen, das Waschmittel um einen bestimmten Membranprotein zu rekonstruieren. 34

Für den Fall der Neutronenstreuung produziert die Kern-Schale-Anordnung der Reinigungsmittel in der Micelle einen Formfaktor die beobachtete Streuung beiträgt. Glücklicherweise können Lösungskomponenten geändert werden, so dass sie nicht zu den net beobachtete Streuung beitragen. Dabei "Kontrast passend" erfolgt durch Substitution von Deuterium für Wasserstoff, eine Streuung Länge Dichte zu erreichen, die den Hintergrund (Puffer) übereinstimmt. Eine vernünftige Auswahl an Reinigungsmittel (mit verfügbaren deuterierte Gegenstücke) und ihr Verhältnis zu mischen müssen berücksichtigt werden. Für Waschmittel Micellen kann diese Substitution mit einem Waschmittel mit der gleichen Kopf Gruppe aber eine deuterierte Alkyl Kette (d-Tail statt h-Tail) durchgeführt werden. Da das Waschmittel gut gemischt sind,35 ihrer Aggregate haben eine Streuung Länge Dichte, die Mole-Fraktion gewichtete Durchschnitt der beiden Komponenten (h-Schwänzen und d-Tails). Wenn diese durchschnittliche Kontrast mit derjenigen der Kopfgruppe konsistent ist, können einheitlichen aggregierten Strukturen voll abgestimmt werden, um alle Beiträge zu beobachtete Streuung zu entfernen.

Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll, um das Neutron Kontrast von Waschmittel Micellen zu manipulieren, durch den Einbau von chemisch identisch Waschmittel Moleküle mit Deuterium-Label Alkyl-Ketten. 19 , 36 , 37 das komplette Simultankontrast Anpassung der Micelle Kern und Schale, die eine einzigartige Fähigkeit der Neutronenstreuung ist erlaubt. 35 , 38 mit dieser deutlich verfeinert Detailebene, passender Kontrast aktivieren kann sonst nicht machbar Studien von Membran-Protein-Strukturen. Darüber hinaus könnte dieser Kontrast-matching-Ansatz auf andere Systeme mit Waschmittel wie Polymer Austausch Reaktionen39 und Öl-Wasser-Dispergiermittel,40 oder sogar andere solubilizing Mittel, wie Bicelles,41 ausgeweitet werden Nanodiscs,42 oder Block-Copolymere. 43 A ähnlicher Ansatz wie in dieser Handschrift, aber mit einer einzigen Waschmittel Spezies mit teilweise Deuterium Substitutionen auf die Alkylgruppe Kette und/oder Kopf wurde vor kurzem veröffentlicht. 37 während dies erwartet werden kann, um die zufällige Verteilung von Wasserstoff und Deuterium in das Waschmittel zu verbessern im Vergleich zu der hier vorgestellte Ansatz der begrenzten Anzahl der verfügbaren Positionen auf das Waschmittel für Substitution und in zwei Schritten Waschmittel Synthese benötigt zusätzliche Herausforderungen für die Prüfung.

Schritte 1 und 2 des Protokolls unten oft überschneiden sich da erstes Experiment Planung erfolgen muss, um eine Qualität Vorschlag zu unterbreiten. Antragstellung gilt jedoch hier als der erste Schritt zu betonen, dass dieser Prozess im Vorfeld ein Neutron-Experiment gestartet werden soll. Anzumerken ist, dass ein erforderlicher Schritt, der durch den Vorschlag nachgewiesen werden sollte, ist, biochemischen und physikalischen Charakterisierung (einschließlich Reinheit und Stabilität) der Probe die Notwendigkeit Neutron Untersuchungen zu unterstützen. Eine allgemeine Diskussion über kleine Winkel Neutronen-Streuung (SANS) sprengt den Rahmen dieses Artikels. Eine kurze, aber gründliche Einführung gibt es in der Referenzarbeit, die Charakterisierung der Materialien von Kaufmann,44 und eine umfassende Lehrbuch konzentrierte sich auf biologische kleine Winkel Lösung Streuung vor kurzem veröffentlicht worden. 45 weitere Buchempfehlungen ist im Abschnitt Diskussion gegeben. Kleine Winkel Streuung verwendet die so genannten Streuung Vektor Q als zentrale Menge, die die Streuung Prozess beschreibt. Dieser Artikel verwendet die allgemein akzeptierte Definition Q = 4π Sünde (θ) / λ, wo θ halbe Winkel zwischen eingehenden und verstreuten Strahl und λ ist ist die Wellenlänge der Neutronenstrahlung in Angström. Andere Definitionen existieren, verwenden Sie verschiedene wie z. Symbole b. die "für die Streuung Vektor, und dass durch einen Faktor 2π oder mithilfe von Nanometern anstelle von Angstrom abweichen kann (siehe auch Diskussion der Abbildung 10).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. vorbereiten und ein Neutron Facility Strahlzeit und Instrument Vorschlag einreichen

  1. Finden Sie Online-Ressourcen zur Identifizierung von Neutronen-Streuung Einrichtungen, die allgemeine Neutron Lichtstrahl Zeit Benutzerzugriff, wie Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Eine Karte der Neutron-Einrichtungen und Informationen über Neutronenforschung weltweit ist online verfügbar. Beachten Sie 46 , dass diese Einrichtungen in der Regel regelmäßige Aufforderungen zur Einreichung von Vorschlägen haben; Dadurch wird bestimmt, wann die nächste Strahlzeit verfügbar sein wird. Neutronen sind für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet. Suchen Sie nach kleinen Winkel Neutron Streuung (SANS) Instrumente, insbesondere solche mit Funktionen für biologische Proben.
  2. Mithilfe von Neutron Einrichtungen bereitgestellten Mittel Neutron Lichtstrahl Zeit Vorschlag Vorlage Prozess zu navigieren. Wenden Sie sich an mit einem Neutron Streuung Wissenschaftler (NSS), die das Instrument zugeordnet ist, für die Sie gelten werden. Aktuelle Informationen der Neutron-Anlage zu Vorschlag Anrufe, Termine und Hinweise für die Einreichung zu überprüfen; für Oak Ridge ist dies online verfügbar. Vorlegen Sie 47 die Strahl-Zeit-Vorschlag nach allen Richtlinien für eine erfolgreiche Einreichung.
  3. Wenn deuterierte Protein erforderlich (siehe 2.2) ist, werden Neutron Scattering Einrichtungen oft von Labors und Kompetenz widmet sich der Herstellung von deuterierte Materialien unterstützt. Um Zugang zum Bio-Deuterierung Lab (BDL) im ORNL anzufordern, wählen Sie die BDL als das zweite Instrument im Vorschlag System. Während der SANS-Vorschlag auf Machbarkeit und von einem wissenschaftlichen Ausschuss überprüft wird, werden BDL Anfragen nur auf Machbarkeit überprüft. Hilfe für den BDL Machbarkeit Beitrag einreichen einer ausgefüllten Informationen Anfrage Form48 , die das Protein Ausdruck Protokoll und geschätzten Ertrag beschreibt (vorhanden online).
  4. Bestätigen Sie nach erfolgreicher Begutachtung des vorgeschlagenen Zeit Strahl die ausgezeichnete Strahlzeit im Voraus über das Experiment. Stellen Sie sicher, dass alle Muster und Puffer Daten und Formeln in den Vorschlag für die ordnungsgemäße Überprüfung korrekt aufgeführt sind. Änderungen an der vorgeschlagenen Versuchsplan, einschließlich Änderungen in der Probe und Puffer Zusammensetzung erfordern Benachrichtigung der Anlage.
    Hinweis: Änderungen sollten so bald wie möglich mit der zugewiesenen NSS besprochen werden.

2. bestimmen Sie Neutron Kontrast Matchbälle und nötigen Kontrast für Protein-Messung

  1. Informieren Sie sich (von Lieferanten Produktinformationen, Online-Datenbanken, veröffentlichten Werte, etc.) im Zusammenhang mit atomaren Kompositionen und Volumina für die Waschmittel Systemkomponenten Kontrast angepasst werden. Diese Informationen wird verwendet, um Neutronen-Streuung Länge dichten (SLDs) zu bestimmen und somit Kontrast Matchbälle (CMPs) in Lösung, die entscheidend für die Qualität SANS Daten und strukturelle Informationen für das Membranprotein von Interesse im Zusammenhang mit einer PDC. Eine Tabelle fasst die physikalischen Eigenschaften und Kontrast Matchbälle für Reinigungsmittel, die üblicherweise bei biophysikalischen Studien von Membranproteinen ist enthalten (Tabelle 1).
  2. Neutron SLDs verwenden die Webanwendung MULCh zu bestimmen: Module für die Analyse der Kontrast Variation Daten49 (verfügbare Online-50 free-of-Charge). Ein Link zu der Bedienungsanleitung befindet sich auf der Startseite. Zugriff auf die Website und lesen Sie die zugehörige Dokumentation. Abbildung 1 und Abbildung 2 geben einen Überblick über Kontrast-Modul ein- und Ausgang für zwei verwandte Beispiele.
    Hinweis: Andere Websites für die Berechnung von SLDs sind verfügbar, wie die durch das National Institute of Standards and Technology (NIST) Center für Neutronenforschung beibehalten. 51
    1. Öffnen Sie das Kontrast-Modul, indem Sie auf "Kontrast" befindet sich im linken Navigationsbereich. Geben Sie Text für einen Projekttitel und geben Sie weiter unten für zwei Komponenten (z. B. Waschmittel Kopfgruppe und Tail) als "Untereinheit 1' und ' Untereinheit 2'.
    2. Geben Sie die Summenformel für jede Komponente im Feld "Formel".
      Hinweis: das Optionsfeld bin "eine molekulare Formel geben unter"Art des Stoffes"ausgewählt werden muss. Darüber hinaus mithilfe der Buchstaben 'X' in der Formel leicht austauschbaren Wasserstoffatome an. Protein, RNA oder DNA-Sequenzen können eingegeben werden, wenn die entsprechenden 'P', 'R', oder hatte "Optionsfelder ausgewählt. Wenn mehrere Kopien einer Komponente innerhalb der Untereinheit vorhanden sind, kann der Wert für "Nmolecules" entsprechend geändert werden. Hier ein praktisches Beispiel bezieht sich auf Lipid-wie Reinigungsmittel, enthält zwei identische Schwänzen, so dass die Formel für eine Rute mit Nmolecules gleich 2 eingegeben werden.
    3. Geben Sie das Volumen in Kubikmeter Angström für jede Komponente in das Feld unter "Lautstärke (Å3)". Verwenden Sie Tanfords Formel28 für Alkyl-Ketten der Länge n, V-Tail = 27,4 + n * 26,9, ungefähre Heck Volumen berechnen, oder Molekulare Bände von Produktinformationen erhalten zur Verfügung gestellt oder Werte in veröffentlicht der Literatur.
    4. Geben Sie Details für Puffer-Komponenten. Ändern Sie die "Anzahl aufgelöst Arten in dem Lösungsmittel" mit dem Dropdown-Menü hinzufügen oder Entfernen von Zeilen für jede Komponente Puffer. Im Falle der Micelle bilden Reinigungsmittel, beinhalten die kostenlose Waschmittel Monomere als separaten Puffer Komponenten in das Waschmittel critical Micelle Konzentration (CMC).
    5. Klicken Sie auf "Absenden" um das Neutron Kontrast Berechnungen durchführen und eine Ergebnisseite, die Streuung Länge Dichte und Kontrast Matchbälle sowie Formeln zur Ermittlung dieser Parameter bei jedem bestimmten Prozentsatz der D2O in eine Tabelle zu erzeugen der Puffer. Überprüfen Sie die Streuung Parameter mit besonderem Augenmerk auf die Komponente CMPs. Wenn die Matchbälle ähneln (innerhalb 10 % D2O) und die kostenlose Micelle Konzentration ist niedrig, die durchschnittliche CMP kann verwendet für den Kontrast-Abgleich der Waschmittel Beiträge. In den meisten Fällen wird die CMP Waschmittel Kopfgruppe und Schwanz unterscheiden sich um mehr als 10-15 %, produzieren einen Kern-Schale-Formfaktor in den SANS-Daten die direkte Erhebung der streusignal aus dem Protein allein verschleiert.
  3. Bewerten Sie den Kontrast zwischen Waschmittel Kopfgruppe und Tail. Wenn das Waschmittel Kopf Gruppe und Alkyl Kette Heck CMPs sind nicht gut aufeinander abgestimmt, können die Verfügbarkeit und die Einbindung eines Waschmittels Deuterium ersetzt erlauben Streuung Länge dichten von ausgewählten Komponenten manipuliert zu werden. In den meisten Fällen erfordert dies eine gemischte Micelle durch den Einbau einer identischen Waschmittel mit Deuterium ersetzt Alkyl-Ketten bilden. Die Zugabe von Deuterium wirft die Streuung Länge Dichte des Kerns durch den Alkyl Kette Schwänzen gebildet. Der gewünschte Endpunkt ist in diesem Fall so, dass die Kopfgruppe Schale CMP und Alkyl Kette Kern CMP annähernd gleiche Werte haben.
    1. Heben Sie die CMP Waschmittel Micelle Kern zu ungefähr gleich der CMP der Kopfgruppe Schale durch die Bestimmung des geeigneten Verhältnis der Vermischung zwischen h-Schwänzen und d-Tails, die Abgleich mit den Kopfgruppen Gegensatz erzielt. Voraussetzung für diese Bestimmung ist die Kenntnis des CMP für eine Deuterium ersetzt Alkyl Kette Tail. Kommerziell erhältliche Pendant zum n-Dodecyl-β-D-maltosid (DDM) steht mit allen Alkyl Kette Wasserstoff durch Deuterium (d25-DDM) ersetzt. Wiederholen Sie die Kontrast-Berechnungen gemäß Schritt 2.1 für eine hatte-Tail "anstelle von"h-Tail".
    2. Berechnen Sie das Maulwurf Verhältnis von h-Tail, d-Heck für den Kontrast-Abgleich mit der Kopfgruppe CMP erforderlich. Die folgende Formel kann mit dieser Entschlossenheit unterstützen:
      CMPKopf = CMPh-Tail * χh-Tail + CMPd-Heck * χd-Tail
      wo ist CMP die Streuung Länge Dichte und χ der Volumenanteil der Waschmittel Kopf, h-Tail oder d-Tail-Komponente. Für gepufferte Lösungen der DDM produziert Einbau von 44 GHT (43 % von Mole) das total Waschmittel als d25-DDM mit Deuterium ersetzt Alkyl-Ketten einen einzigen CMP in 48,5 % D2O für Kopf und Schweif Komponenten.
  4. Prüfen Sie den Grad der Deuterium-Ersatz für das Membranprotein. Um ausreichende streusignal aus dem Protein zu messen, sollte der CMP für das Protein mindestens 15 % D2O in Lösung abseits des Waschmittels CMP und Messbedingungen. Das Signal steigt mit dem Quadrat der % Unterschied. Da die CMP eine unbeschriftete Protein tritt in der Regel mit ~ 42 % D2O in Lösung (CMP ähnlich viele Waschmittel Kopfgruppen), ist Deuterium Kennzeichnung des Proteins fast immer eine Notwendigkeit. 52

(3) zum Ausdruck bringen und Reinigen der Membranprotein des Interesses

  1. LB (Lysogeny Brühe) Medium vorzubereiten und wachsen Escherichia coli (E. Coli) Zellen beherbergen einen induzierbaren Expressionsvektor für die Zielsequenz Protein.
    1. Minimale Medien vorbereiten. H2O oder D2O, auflösen 7,0 g/L (NH4)2SO4, 5,25 g/L Na2HPO4, 1,6 g/L KH2PO4, 0,50 g/L Diammonium Wasserstoff Citrat, 5,0 g/L Glycerin, 1,0 mL/L von 20 % w/V MgSO 4·7H2O und 1,0 mL/L der Holme Spurenmetalle (0,50 g/L CaCl2·2H2O, 0,098 g/L CoCl2, 0,102 g/L CuSO4, 16,7 g/L FeCl3·6H2O, 0,114 g/L MnSO4· H2O, 22,3 g/L Na2EDTA·2H2O und 0,112 g/L ZnSO4· H2O). 53 , 54
    2. Bereiten Sie geeignete Antibiotika Stammlösungen mit H2O oder D2O.
    3. Bereiten Sie eine Isopropyl-β-D-1-Thiogalactopyranoside-Stammlösung mit H2O oder D2O.
    4. Steril-Filter alle Lösungen in trockenen, sterilen Behälter mittels Vakuum Flaschenverschluss und Spritze Filter mit einer Porengröße von 0,22 Mikron.
  2. Anzupassen Sie E. Coli Zellen zu Deuterium-Label mittlere vor der Skalierung für Überexpression eines deuterierte Proteins.
    1. 3 mL LB-Medium mit einer isolierten Kolonie von einer Lysogeny Brühe (LB) Agarplatte oder Zellen aus einem gefrorenen Glycerin bestand zu impfen. Wachsen Sie Zellen bei 37 ° C in einem schütteln Inkubator bei 250 u/min oder reduzieren Sie die Temperatur auf 30 ° C oder darunter um Überwucherung der Kultur bei Inkubation über Nacht zu vermeiden.
      Hinweis: Das Verfahren der Anpassung kann variiert werden. 55 , 56 , 57
    2. Sobald die LB-Kultur zu einer optischen Dichte bei 600 gewachsen nm (OD600) von ~ 1, verdünnen Sie es 01:20 in 3 mL H2O minimaler Medium und wachsen zu einem OD-600 ~ 1. Wiederholen Sie die 01:20 Verdünnungen mit minimaler Medium, 50, 75 und 100 % D2O (oder bis zu dem gewünschten Prozentsatz der D-2O) enthalten.
      Hinweis: als die D-2O-Gehalt erhöht, Wachstumsraten sinkt. Die Beziehung zwischen der D2O Prozentsatz in der Wachstum Medien und Deuterium-Substitution im Protein wurde in der Literatur berichtet. 58 , 59 , 60
    3. Weiter wachsen die Kultur in einem Bioreaktor, erhöhen die Ausbeute an deuterierte Zellmasse (Abbildung 3).
      Hinweis: Schrittweise Anweisungen für den Betrieb der Bioreaktor wurden an anderer Stelle überprüft. 61 , 62 , 63 , 64
  3. Ernte und lösen Sie E. Coli Zellen für Membran-Extraktion und Protein-Reinigung
    1. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei ~ 6.000 x g für ca. 30-45 min bei 4 ° C.
    2. Erweichen Sie die Zelle Pellet durch Einweichen in Puffer für ~ 30 min auf Eis. Dann sanft Aufschwemmen der Zelle Pellet in Puffer durch sanft Pipettieren mit einer serologischen pipettieren oder sanftes Schaukeln auf einem 2D Rocker, um eine Endkonzentration von ~ 1 g Nasszelle Masse/10 mL Puffer.
      Hinweis: ein Beispiel-Puffer ist 50 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure), pH 7,5, 200 mM NaCl ergänzt mit einem Protease-Inhibitor-Tablet.
    3. Lösen Sie die resuspendierte Zellen mit drei Durchläufe durch einen Hochdruck-Homogenisator bei 10.000 Psi beim Kühlen des Abfluss.
      Hinweis: Je nach der erforderlichen Größenordnung möglicherweise andere Lyse Methoden verwendet (z. B. durch die französische Presse oder Beschallung).
    4. Pellet-zellenrückstand durch Zentrifugation bei ~ 4.000-5.000 x g für 15 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis der Überstand geklärt ist.
    5. Ultrazentrifuge (~ 150.000 x g für 30-45 min) der Überstand aus dem vorherigen Schritt, enthält die löslichen und Membran Brüche. Das Pellet nach Ultrazentrifugation enthält die Membran-Fraktion.
    6. Aufschwemmen Sie Membran-Pellets in einem großen Dounce-Homogenisator und isolieren Sie die Membran Bruchteil wieder durch Ultrazentrifugation (Schritt 3.3.5). Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens einmal um lose gebundenen Proteine zu entfernen.
    7. Solubilisieren Sie Membranen durch sanftes Schaukeln für ~ 30 min bei 4 ° C in einem Puffer mit Waschmittel für die Reinigung geeignet. Solubilisierung ergibt sich, wenn die Aussetzung von bewölkt nach transparent wechselt. Unlöslichen Material durch Ultrazentrifugation (~ 150.000 x g für 30-45 min) entfernen.
      Hinweis: Ein Beispiel-Puffer ist 50 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 20 mM Imidazol und 4 % (w/V) DDM für die Reinigung von Ni2 + Affinitätschromatographie.
  4. Reinigen Sie das Protein nach einem Protokoll zuvor für protonierten Formen entwickelt.
    Hinweis: Naing Et Al. für ein Beispiel-Reinigung-Protokoll für einen Hexahistidine getaggt M. Marisnigri JR1 Intramembrane Aspartyl Protease (d-MmIAP) zu sehen. 65 die letzte Ausbeute war ~ 1 mg deuterierter aus 5 L deuterierter Zellwachstum Kultur, die diente in der SANS-Experiment (Abbildung 4).
  5. Tauschen Sie gereinigte Protein in den "letzten Exchange Puffer" nach passenden Kontrast.
    1. Bereiten Sie 200 mL "Endgültige Austausch Puffer", enthält die richtige Mischung für Kontrast Anpassung, z. B.20 mM HEPES, pH 7,5, 250 mM NaCl und 0,05 % insgesamt DDM (0,028 % DDM und 0,022 % d25-DDM) in 49 % D2O.
    2. Ausschluss einer Spalte "Größe", mit Equilibrate > 2 Spalte Volumen (CV) des "Letzten Exchange Puffer" in 3.5.1 mit einem schnellen Protein Liquid Chromatography (FPLC) System.
    3. Führen Sie nach der Injektion der Probenmaterials die Spalte und isolieren Sie Fraktionen entsprechend das Protein des Interesses zu.
    4. Das Protein auf die gewünschte Endkonzentration (2-5 mg/mL) zu konzentrieren.
      Hinweis: Ein Volumen von ca. 300 μL ist erforderlich, um ein 1 mm zylindrische Quarz Küvette für SANS verwendet füllen.
    5. Reservieren Sie ein Aliquot der übereinstimmenden Puffer für SANS Hintergrundabzug.
      Hinweis: Die aliquoten kann direkt aus dem vorbereiteten Puffer, oder im Idealfall von einem sauberen Elution Bruchteil am Ende des Laufs FPLC eingenommen werden.

4. nehmen Sie Letzte Vorbereitungen für die Strahlzeit und sammeln SANS Daten

  1. Nachdem der Vorschlag angenommen wurde und Zugriff auf die Website genehmigt wurde, füllen Sie alle erforderlichen Schulungen im Vorfeld zugewiesene Strahlzeit. Dazu gehören Prearrival, Web-basiertes training sowie vor-Ort-radiologische, Labor und Instrument-spezifische Ausbildung.
    Hinweis: Schulungsanforderungen kann voraus Ankunft zum ersten Mal Nutzer vorschreiben. Weitere Informationen sind online verfügbar. 66
  2. Laden Sie Proben und Puffer für die Datenerfassung.
    Hinweis: Einen Überblick über die biologischen kleine Winkel Neutronenstreuung (Bio-SANS) Instrument Probe Umweltbereich ist in Abbildung 5dargestellt.
    1. Laden Sie Proben und Puffer in Quarz-Zellen. Quarz-Zellen zur Verfügung aus dem Instrument Wissenschaftler oder Anlage. Verwenden Sie Gel-laden-Tipps, um die schmale Öffnung der meisten Sample-Zellen zuzugreifen.
    2. Stellen Sie sicher, dass der Strahl Verschluss geschlossen ist, dann nähern Umgebung Aufnahmebereichs und legen Sie die Quarz-Zellen in den Probenwechsler. Probe-Wechsler Stellung für jede probenzelle aufnehmen.
    3. Überprüfen Sie den Bereich und sicherzustellen Sie, dass der Strahlengang ist frei von Verstopfung, dann verlassen Sie Bereich Beispiel Umwelt und öffnen Sie den Strahl-Verschluss zu.
      Hinweis: Sorgfältig folgen Sie alle Anlage Vorschriften und Regeln zu, gehorchen Sie alle Buchungen und beherzigen Sie die Ratschläge des Wissenschaftlers Instrument. Proben können nicht entfernt aus dem Strahl und manipuliert nach Exposition gegenüber den Lichtstrahl ohne folgende besondere Vorsichtsmaßnahmen. Mit einer radiologischen Kontrolle Techniker (RCT) vor diesen Verfahren zu konsultieren.
  3. Table-Scan für die automatisierte Datenerfassung ausführen
    1. Betreiben Sie das Gerät durch benutzerdefinierte Steuerelement LabVIEW basierende Software, Spektrometer Instrument Control Environment (Gewürz). Befolgen Sie die Anweisungen für die Bedienung des Geräts von der Neutron Scattering Wissenschaftler zur Verfügung gestellt. Ein Überblick über die Tabelle Scan Betrieb Fenster ist in Abbildung 6zur Verfügung gestellt.
    2. Nach Eingabe der Informationen in den entsprechenden Bereichen erforderlich, die Tabellenscan ausführen und eine automatisierte Datenerfassung beginnt. Überwachung der Fortschritte über den Reiter "Table Scan-Status".

(5) reduzieren Sie SANS Daten von 2D-Bild auf 1D Grundstück

  1. Jede Probe und Puffer Datendatei aus den aufgezeichneten Scan Zahlen zu identifizieren. Jede Messung wird eine einzigartige Scan-Nummer zugeteilt. Diese Informationen sind hilfreich bei Datenreduktion, jede entsprechende Probe und Puffer-paar zu identifizieren.
  2. Verwenden Sie MantidPlot Software und Python-Skript für Reduktion
    1. Neutron Scattering Benutzer sind mit Kontodaten Zugriff auf ihre Daten auf dem Remote-Analyse-Cluster zur Verfügung gestellt. 67 melden Sie sich bei der Remote-Analyse-Cluster und "MantidPlot" von der Befehlszeile aus ausführen. Abbildung 7 und Abbildung 8 zur Verfügung gestellt, um diese Schritte zu unterstützen.
    2. Erhalten Sie eine Benutzer-Reduktion-Skript aus dem Neutron Scattering Wissenschaftler (Dies geschieht in der Regel während des Experiments); Dieses Skript ist Python-basiert und enthält die notwendige Kalibrierung und Skalierung Anpassungen an das Bild 2D Streuung in einem 1D Grundstück von verstreuten Intensitäten als Funktion der Streuwinkel, I(Q) zu reduzieren.
    3. Öffnen Sie das bereitgestellte Benutzer Reduktion Skript in MantidPlot und platzieren Sie die entsprechenden Scan-Nummern oder die Kennung für die Probe und Puffer-Paare in der entsprechenden Liste.
    4. Führen Sie das Skript zum reduzierte Daten als vier-Säulen-Text-Datei zu generieren (die Reihenfolge der Spalten ist Q, I(Q), I(Q) Fehler "," Q-Fehler) in der angegebenen Position. Den entsprechenden Arbeitsbereich in MantidPlot einen Rechtsklick und wählen Sie "Plot mit Fehlern..." für eine erste Prüfung der Streuung Profile.

6. analysieren Sie Daten für Strukturparameter von Streuung Partikel

  1. Übertragen Sie die reduzierten Daten-Datei aus dem Analysis-Server auf einem lokalen Computer mit secure FTP-File-Transfer. Dies kann mit dem Einsatz von Software wie z.B. FileZilla oder CyberDuck durchgeführt werden. Zusätzliche Anleitungen und Informationen für den Anschluss an die Analyse-Server-Datei-System sind auf der analysis.sns.gov-Login-Seite zur Verfügung gestellt.
  2. Laden Sie die ATSAS Software Suite65,68 (ganze ATSAS Suite). 69 einzelne Programme70 sind auch online verfügbar für SANS Datenanalyse, nämlich Strukturparameter und ab-initio -Modelle bestimmen.
    Hinweis: Viele Optionen sind verfügbar für SANS Datenanalyse von biomakromoleküle. 45
  3. PRIMUS71 für Daten zu Plotten, Puffern Sie Skalierung und Subtraktion und Guinier Analyse zu.
    1. Starten Sie den ATSAS "SAS-Daten-Analyse" Anwendung und Belastung der reduzierten Daten Dateien entsprechend der Probe / Puffer-Paar.
      1. Um den Puffer richtig zu skalieren, wählen Sie einen Datenbereich bei hoher Q (Q > 0,5 Å-1) wo beide Profile sind ähnlich und flach, und klicken Sie auf "Skalierung" befindet sich unter "Vorgänge" Registerkarte. Ein Skalierungsfaktor wird in den Puffer angewendet werden, so dass diese zwei flachen Regionen überlappen sollten. Vorsicht: sollte eine plausible physikalische Ursache, die Skalierung der Puffer Intensität entsprechend die Probe rechtfertigt. Wenn die Abweichung groß ist, finden Sie einen Instrument Wissenschaftler gültigen Ansätze zur Hintergrundabzug. 44 , 45 , 72
      2. Erhöhen Sie den Datenbereich um alle Punkte zu sehen. Klicken Sie auf "Subtrahieren", um diesen Vorgang durchzuführen. Die Puffer subtrahiert Datendatei in der Legende einen Rechtsklick und speichern Sie diese Datei für die spätere Analyse. Abbildung 9 zeigt die Verwendung der Registerkarte "Operations".
    2. Führen Sie eine Guinier Analyse der Puffer subtrahiert Beispieldaten verwenden der Registerkarte "Analyse" des Programms "SAS-Daten-Analyse".
      1. Achten Sie darauf, dass die entsprechende Datei in der Liste ausgewählt ist und klicken Sie auf "Radius of Gyration". Automatisierte wurde versucht, eine Guinier passen auszuführen erhalten Sie durch Anklicken des Buttons "Autorg".
      2. Ausbau des Angebots an Daten umfassen alle Low-Q-Daten und beginnen, Verengung des Datenbereichs durch High-Q Punkte wegnehmen, bis die Qmax * Rg Grenze liegt unter 1.3. Verwenden Sie die Handlung der Residuen um zu überprüfen, ob Daten im Bereich von Fit linear sind. Die Guinier passen ergibt eine ungefähre Rg und I0 für die streuenden Partikeln.
      3. Kleine Anpassungen an der Fit Region und überwachen die Empfindlichkeit dieser Werte auf den Bereich der Daten in der Passform. Abbildung 10A veranschaulicht die Verwendung des Werkzeugs "Radius of Gyration".
  4. Erhalten Sie die Wahrscheinlichkeit Verteilungsfunktion (P(r)) in GNOM. 73 die Ausgabedatei erzeugt hier wird als Eingabe für die ab-initio Modellierungsprozess verwendet werden.
    1. Start der Entfernung Verteilungskonfigurations-Assistenten innerhalb der "Analyse" tab. erhalten eine gute Anpassung an die Daten ist wichtig, ein hochwertiges Modell zu erhalten. Weitere Informationen über Erhalt genau passt entnehmen Sie bitte den Beitrag74 von Putnam, Et al.
      Hinweis: der GNOM-Programm bietet zusätzliche Informationen über die Passung jenseits der Ferne Verteilungskonfigurations-Assistenten. Abbildung 10 zeigt korrekte Verwendung des Werkzeugs "Abstand Verteilung" und Abbildung 11 zeigt einige der auftretenden Fehler aufgetreten.
    2. Bestimmen Sie Dmax, der maximale interatomare Abstand innerhalb des Moleküls.
      1. Einen Wert für Dmax zu schätzen, indem Sie deaktivieren das Kontrollkästchen erzwingen Rmax = 0 und einen großen Wert für Dmax eingeben (150 Å, zum Beispiel). Der erste X-Schnittpunkt in der Handlung des P(r) ergibt diese Schätzung.
      2. Änderungen Sie inkrementelle an dieser Dmax Wert und der Datenbereich verwendet oder die Anzahl der Punkte in der Passform zur Optimierung der GNOM passen zu den Daten und der daraus resultierenden P(r) Kurve verwendet.
    3. Weiter verfeinern die GNOM-Passform und speichern die GNOM-Ausgabedateien mit guter Parameter für nachfolgende ab-initio Modellierung Schritte.
  5. SANS-Profile von hochauflösenden PDB-Modellen mit Hilfe des Programms CRYSON simulieren. 75
    1. Öffnen Sie das Programm und wählen Sie die Option "0". Wählen Sie den Namen der PDB-Datei im Datei-Browser Popup. Drücken Sie die Eingabetaste um die Standardeinstellungen, mit Ausnahme der Angabe Kette Deuterierung Brüche und der Anteil der D2O in dem Lösungsmittel zu den richtigen Kontrast-Parameter übernehmen.
    2. Passen Sie das Modell auf experimentellen Daten durch Eingabe von "Y" und Auswahl der Datendatei im Datei-Browser Popup. Übernehmen Sie die übrigen Standardwerte und Output-Dateien werden in den Speicherort der PDB-Datei geschrieben werden. Die '.fit'-Datei enthält Informationen für das vorhergesagte Streuung Profil aus dem hochauflösenden 3D Modell.

7. Erstellen Sie Ab-Initio -Modelle aus der SANS Daten.

Hinweis: DAMMIF76 und77 in der ATSAS-Software-Suite DAMMIN wird verwendet, um dummy Atom-Modelle (Dämmen) mit einem simulierten glühprozess aus dem GNOM ausgegeben, enthält P(r) Daten oder Informationen über die Wahrscheinlichkeit zu rekonstruieren oder Häufigkeit der interatomare Entfernungen innerhalb des Partikels Streuung. Diese Programme können im Batch-Modus oder auf dem ATSAS-online-Web-Server ausgeführt werden.

  1. Starten Sie den PRIMUS-Form-Assistenten von der 'Dammif'-Taste auf der Registerkarte "Analyse" des "SAS-Daten-Analyse", und verwenden Sie eine manuelle Auswahl der Parameter. Die Eingabe für den Assistenten ist in Abbildung 12dargestellt.
    1. Definieren Sie die Guinier reichen von der Passform (Schritt 6.3.2) und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, die mithilfe der Navigationsschaltflächen. Definieren Sie Fit-Werte aus dem P(r) Plot (Schritt 6.4) und mit dem nächsten Schritt fortfahren.
    2. Geben Sie Parameter für die ab-initio Modellierungsprozess. Geben Sie einen Präfix für die Modell-Ausgabe-Dateinamen (z. B. SANSEnvelope), wählen Sie entweder "schnell" oder "langsam" Modus-Modellierung, geben Sie einen Wert für die Anzahl der Modelle (17 empfohlen für statistische Signifikanz), wählen Sie aus den verfügbaren Optionen für Partikel Symmetrie, Anisometry und eckige Skala (falls bekannt). Stellen Sie sicher, dass die Boxen, um durchschnittliche Modelle mit DAMAVER überprüft werden und verfeinern das endgültige Modell mit DAMMIN.
    3. Starten Sie den Prozess mithilfe der Schaltfläche "Commit". Sobald der Vorgang abgeschlossen ist, zeigen Sie an und speichern Sie das Arbeitsverzeichnis.
      Hinweis: die typischen Modellierungsprozess für ein einzelnes kleines Protein kann bis zu ein paar Stunden mit einem typischen PC dauern. Die Dateien werden in temporären Verzeichnissen bis gespeichert.
  2. Overlay und überlagern das Finale SANS Umschlag mit einem zugehörigen hochauflösenden Modell mit SUPCOMB im ATSAS. Legen Sie eine Kopie des Modells hochauflösende PDB SANS Umschlag im Arbeitsverzeichnis fit zu sein. SUPCOMB von der Befehlszeile aus ausführen mit der PDB-Dateinamen als zwei Argumente mit der Template-Struktur zuerst aufgeführt: $ Supcomb HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    Hinweis: Der zweite Dateiname aufgeführt wird als eine neue Datei mit einem "R" zu Ende und mit neuen Koordinaten für die Überlagerung auf die Template-Struktur angehängt umgeschrieben werden.
  3. Visualisieren Sie die ab-initio Modellergebnisse mit PyMOL (pymol.org), eine molekulare 3D-Grafik anzeigen Programm. Abbildung 13 gibt einen Überblick über die PyMOL-Operationen.
    Hinweis: Es gibt Publikation Richtlinien für strukturelle Modellierung von kleinen Winkel Streuung von Biomolekülen in Lösung. 78
    1. Starten Sie die Anwendung von PyMOL und öffnen Sie die PDB-Dateien entsprechend der 3D SANS Umschlag und die SUPCOMB ausgerichteten hochauflösende Struktur betrachtet werden.
    2. Visualisieren Sie den SANS Umschlag durch die Darstellung dieses Modells als Oberfläche. Klicken Sie auf die "Button neben dem Modell und wählen Sie" zeigen: als: Oberfläche ".
    3. Visualisieren Sie die hochauflösenden Proteinstruktur Rückgrat durch die Darstellung dieses Modells als eine Karikatur. Wählen Sie die "neben diesem Modell und wählen Sie" zeigen: als: Cartoon ". Anzeigen die Kette wie ein Regenbogen aus N-C Terminus durch Klicken auf die Schaltfläche 'C' und ' durch Kette: Chainbows'.
    4. Ändern Sie die Transparenz der Oberfläche Darstellung aus Gründen der Übersichtlichkeit. Über das Menü "Einstellungen", wählen Sie "Transparenz» Oberfläche» 40 %".
    5. Machen Sie den Hintergrund weiß und nicht blickdicht. Wählen Sie aus der Menüleiste 'Display', ' Hintergrund» "und wählen Sie"Undurchsichtig", deaktivieren diese Option und"Weiße"markieren Sie diese Farbe für den Hintergrund.
      Hinweis: zusätzliche Vorgänge und Anwendungen für PyMOL finden Sie unter PyMolWiki.org.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein Strahl Zeit und Instrument Vorschlag sollte eindeutig vermitteln alle Informationen benötigt, um die Review Committee, dass eine gültige vorgeschlagene Experiment beurteilt werden können. Kommunikation mit einem NSS ist für unerfahrene Anwender dringend empfohlen. Die NSS kann erste Machbarkeit und Führer Antragstellung, Machbarkeit, Sicherheit und das Potenzial für hohe Schlagzähigkeit Wissenschaft betonen beurteilen. Die Angaben in dem Vorschlag gehören Hintergrundinformationen und ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strukturbiologie Forscher nutzen Sie ergänzende strukturelle Techniken wie Lösung Streuung, Biochemische und strukturelle Details (z. B. Größe und Form) von Biomolekülen in Lösung zu erhalten. SANS ist eine besonders attraktive Technik zur Bestimmung geringer Auflösung Strukturen von Membranproteinen, ein Schwerpunkt der modernen Strukturbiologie und Biochemie. SANS erfordert Mengen der gereinigten Proteine vergleichbar mit denen von kristallographischen Studien (1 mg/Probe). Die vor kurzem wachsende kommerzielle Verfügb...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss und Ryan C. Oliver sind vertraglich durch UT-Battelle mit uns DOE zur Unterstützung der Neutron Science Anwenderprogramm und Bio-SANS Instrument am Oak Ridge National Laboratory in diesem Artikel verwendet.

Diese Handschrift ist von UT-Battelle, LLC, unter Vertrag DE-AC05-00OR22725 mit der uns Department of Energy (DOE) Co-Autor gewesen. Behält sich die US-Regierung und der Verlag durch die Annahme des Artikels zur Veröffentlichung, räumt ein, dass die US-Regierung eine nicht-ausschließliches, eingezahlte, unwiderrufliche, weltweite Lizenz behält zu veröffentlichen oder das veröffentlichte Formular dieser Handschrift zu reproduzieren oder zu ermöglichen andere zu tun, für die US-Regierung Zwecke. DOE bieten den Zugang der Öffentlichkeit zu diesen Ergebnissen der vom Bund geförderte Forschung im Einklang mit dem DOE den Zugang der Öffentlichkeit zu planen. 82

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Büro von biologischen und Umweltforschung unterstützt Forschung im ORNL Center für strukturelle Molekularbiologie (CSMB) und Bio-SANS mit Einrichtungen, unterstützt durch die wissenschaftlichen Nutzer Einrichtungen Division, Office Basic Energiewissenschaften, US Department der Energie. Strukturarbeiten am Membranproteine im Labor Lieberman wurde von NIH (DK091357, GM095638) unterstützt und NSF (0845445).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Amicon Ultra MWCO 50KDa Konzentrator EMD MilliporeUFC905096Laborbedarf
Ammoniumcitrat zweibasigFisher ScientificA663
Mittelkomponente AmmoniumsulfatEMD Millipore2150Mittelkomponente
Bioflo 310 Bioreaktor SystemEppendorfM1287-2110Ausrüstung
Calciumchlorid-DihydratAcros423525000Mittelkomponente
CarbenicillinIBI ScientificIB02025Antibiotikum
ChloramphenicolEMD Millipore3130Antibiotikum
Kobalt(II)-chloridAcrosAC21413-0050Mittelkomponente
Kupfer (II)-sulfatAcrosAC19771-1000 mittlere Komponente
DeuteriumoxidSigma-Aldrich756822mittelkomponentiger
Drierit-GasreinigerW.A. Hammond Drierite Co., Ltd.27068
EDTA, Dinatrium, DihydratEMD Millipore4010Mittelkomponente
Emulsiflex-C3AvestinEF-C3Ausrüstung
& Auml; kta Luftreiniger UPC100GE Healthcare Ausrüstung
GlycerinSigma-AldrichG5516Mittelkomponente
HEPESSigma-AldrichH4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR SäuleGE Healthcare 
ImidazolVWR97064-622
IPTGTeknovaI3325
Eisen(III)-chloridhexahydratMP BiochemikalienICN19404590mittlere Komponente
LB Agar MillerFisher ScientificBP1425-2
Magnesiumsulfat-HeptahydratVWR97062-134mittlere Komponente
Mangan(II)-sulfat-MonohydratAcrosAC20590-5000Mittelkomponente
MaxQ 6000 Inkubations-/KühlschüttlerThermo ScientificSHKE6000-7 Ausrüstung
n-Dodecyl-d25-β-D-MaltopyranosidAnatraceD310T
n-Dodecyl-β-D-MaltopyranosidAnatraceD310A
Kaliumphosphat monobasischVWR97062-346Mittelkomponente
RC 6 Plus ZentrifugeThermo Scientific Sorvall46910Ausrüstung
SIGMAFAST Proteasehemmer Cocktail Tabletten, EDTA-freiesSigma-AldrichS8830
NatriumchloridSigma-AldrichS3014
NatriumhydroxidSigma-Aldrich795429
Natriumphosphat dibasischSigma-AldrichS7907Mittelkomponente
Steriler 25-mm-Spritzenvorsatzfilter mit 0,2 μm; m PES-MembranVWR28145-501Laborbedarf
Steriler Einweg-Flaschenaufsatzfilter mit 0,2 & Mikro; m PES-MembranThermo Scientific596-4520 Laborbedarf
Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare 
Superose-12 10/300 GL Spalte GE Healthcare 
Ultrospec 10 ZelldichtemessgerätGE Healthcare 80211630Ausrüstung
Zinksulfat-MonohydratAcrosAC38980-2500 mittlere Komponente
171167011751750117517301

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wallin, E., Heijne, G. V. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Science. 7 (4), 1029-1038 (1998).
  2. Tautermann, C. S. GPCR structures in drug design, emerging opportunities with new structures. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24 (17), 4073-4079 (2014).
  3. Cournia, Z., et al. Membrane protein structure, function, and dynamics: A perspective from experiments and theory. The Journal of Membrane Biology. 248 (4), 611-640 (2015).
  4. Doerr, A. Membrane protein structures. Nature Methods. 6, 35(2008).
  5. Bill, R. M., et al. Overcoming barriers to membrane protein structure determination. Nature Biotechnology. 29, 335(2011).
  6. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  7. Sanders, C. R., Sönnichsen, F. Solution NMR of membrane proteins: Practice and challenges. Magnetic Resonance in Chemistry. 44 (S1), S24-S40 (2006).
  8. Garavito, R. M., Ferguson-Miller, S. Detergents as tools in membrane biochemistry. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 32403-32406 (2001).
  9. Privé, G. G. Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins. Methods. 41 (4), 388-397 (2007).
  10. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  11. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  12. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  13. Skar-Gislinge, N., et al. Elliptical structure of phospholipid bilayer nanodiscs encapsulated by scaffold proteins: Casting the roles of the lipids and the protein. Journal of the American Chemical Society. 132 (39), 13713-13722 (2010).
  14. Sanders, C. R., Schwonek, J. P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry. 31 (37), 8898-8905 (1992).
  15. Vestergaard, M., Kraft, J. F., Vosegaard, T., Thøgersen, L., Schiøtt, B. Bicelles and other membrane mimics: comparison of structure, properties, and dynamics from MD simulations. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (52), 15831-15843 (2015).
  16. Popot, J. -L., et al. Amphipols From A to Z. Annual Review of Biophysics. 40 (1), 379-408 (2011).
  17. Tribet, C., Audebert, R., Popot, J. -L. Amphipols: Polymers that keep membrane proteins soluble in aqueous solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (26), 15047(1996).
  18. Fernández, C., Wüthrich, K. NMR solution structure determination of membrane proteins reconstituted in detergent micelles. FEBS Letters. 555 (1), 144-150 (2003).
  19. Hiruma-Shimizu, K., Shimizu, H., Thompson, G. S., Kalverda, A. P., Patching, S. G. Deuterated detergents for structural and functional studies of membrane proteins: Properties, chemical synthesis and applications. Molecular Membrane Biology. 32 (5-8), 139-155 (2015).
  20. Krueger-Koplin, R. D., et al. An evaluation of detergents for NMR structural studies of membrane proteins. Journal of Biomolecular NMR. 28 (1), 43-57 (2004).
  21. Linke, D. Methods in Enzymology. Burgess, R. R., Deutscher, M. P. 463, Academic Press. 603-617 (2009).
  22. Oliver, R. C., et al. Tuning micelle dimensions and properties with binary surfactant mixtures. Langmuir. 30 (44), 13353-13361 (2014).
  23. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
  24. Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Biomembranes. 457 (2), 133-170 (1976).
  25. Tulumello, D. V., Deber, C. M. Efficiency of detergents at maintaining membrane protein structures in their biologically relevant forms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (5), 1351-1358 (2012).
  26. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. Tanford, C. The Hydrophobic Effect: Formation of Micelles and Biological Membranes. , 2nd edn, John Wiley. (1980).
  29. Littrell, K., Urban, V., Tiede, D., Thiyagarajan, P. Solution structure of detergent micelles at conditions relevant to membrane protein crystallization. Journal of Applied Crystallography. 33 (3 Part 1), 577-581 (2000).
  30. Oliver, R. C., et al. Dependence of micelle size and shape on detergent alkyl chain length and head group. PLOS ONE. 8 (5), e62488(2013).
  31. Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  32. Hong, X., Weng, Y. -X., Li, M. Determination of the topological shape of integral membrane protein light-harvesting complex LH2 from photosynthetic bacteria in the detergent solution by small-angle X-ray scattering. Biophysical Journal. 86 (2), 1082-1088 (2004).
  33. Vinothkumar, K. R. Membrane protein structures without crystals, by single particle electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 33, 103-114 (2015).
  34. Pérez, J., Koutsioubas, A. Memprot: A program to model the detergent corona around a membrane protein based on S-SAXS data. Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 86-93 (2015).
  35. Oliver, R. C., Pingali, S. V., Urban, V. S. Designing mixed detergent micelles for uniform neutron contrast. The Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (20), 5041-5046 (2017).
  36. Hiruma-Shimizu, K., Kalverda, A. P., Henderson, P. J. F., Homans, S. W., Patching, S. G. Synthesis of uniformly deuterated n-dodecyl-β-D-maltoside (d39-DDM) for solubilization of membrane proteins in TROSY NMR experiments. Journal of Labelled Compounds & Radiopharmaceuticals. 57 (14), 737-743 (2014).
  37. Midtgaard, S. R., et al. Invisible detergents for structure determination of membrane proteins by small-angle neutron scattering. The FEBS Journal. 285 (2), 357-371 (2018).
  38. Gabel, F. Biological Small Angle Scattering: Techniques, Strategies and Tips. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S. , Springer. Singapore. 201-214 (2017).
  39. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO Block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50 (6), 2484-2494 (2017).
  40. Liyana-Arachchi, T. P., et al. Bubble bursting as an aerosol generation mechanism during an oil spill in the deep-sea environment: Molecular dynamics simulations of oil alkanes and dispersants in atmospheric air/salt water interfaces. Environmental Science: Processes & Impacts. 16 (1), 53-64 (2014).
  41. Dos Santos Morais, R., et al. Contrast-matched isotropic bicelles: A versatile tool to specifically probe the solution structure of peripheral membrane proteins using SANS. Langmuir. 33 (26), 6572-6580 (2017).
  42. Maric, S., et al. Stealth carriers for low-resolution structure determination of membrane proteins in solution. Acta Crystallographica Section D. 70 (2), 317-328 (2014).
  43. Pedersen, J. S., Svaneborg, C., Almdal, K., Hamley, I. W., Young, R. N. A small-angle neutron and x-ray contrast variation scattering study of the structure of block copolymer micelles: Corona shape and excluded volume interactions. Macromolecules. 36 (2), 416-433 (2003).
  44. Urban, V. S. Characterization of Materials. Kaufmann, E. N. , John Wiley and Sons. (2012).
  45. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S., et al. Advances in Experimental Medicine and Biology. Cohen, I. R. 1009, Springer Singapore. Singapore. 1-268 (2017).
  46. Neutron Facilities WorldWide. , Available from: http://neutronsources.org (2018).
  47. Submitting a Research Proposal. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/users/proposals (2018).
  48. Accompanying Bio-Deuteration Laboratory Proposal. , Available from: https://www.ornl.gov/sites/default/files/BDL_info_request.docx (2014).
  49. Whitten, A. E., Cai, S., Trewhella, J. MULCh: Modules for the analysis of small-angle neutron contrast variation data from biomolecular assemblies. Journal of Applied Crystallography. 41 (1), 222-226 (2008).
  50. MULCh: ModULes for the Analysis of Contrast Variation Data. , Available from: http://smb-research.smb.usyd.edu.au/NCVWeb/ (2018).
  51. Scattering Length Density Calculator by National Institute of Standards and Technology (NIST) Center for Neutron Research. , Available from: https://www.ncnr.nist.gov/resources/activation/ (2018).
  52. Ibel, K., Stuhrmann, H. B. Comparison of neutron and X-ray scattering of dilute myoglobin solutions. Journal of Molecular Biology. 93 (2), 255-265 (1975).
  53. Holme, T., Arvidson, S., Lindholm, B., Pavlu, B. Enzymes: Laboratory-scale production. Process Biochemistry. 5 (9), 62-66 (1970).
  54. Larsson, G., Enfors, S. -O. Protein release and foaming in Escherichia coli cultures grown in minimal medium. Bioprocess Engineering. 15 (5), 231-237 (1996).
  55. Artero, J. -B., Hartlein, M., McSweeney, S., Timmins, P. A comparison of refined X-ray structures of hydrogenated and perdeuterated rat [gamma]E-crystallin in H2O and D2O. Acta Crystallographica Section D. 61 (11), 1541-1549 (2005).
  56. Paliy, O., Bloor, D., Brockwell, D., Gilbert, P., Barber, J. Improved methods of cultivation and production of deuteriated proteins from E. coli strains grown on fully deuteriated minimal medium. Journal of applied microbiology. 94 (4), 580-586 (2003).
  57. Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Science. 18 (5), 936-948 (2009).
  58. Hoopes, J. T., Elberson, M. A., Preston, R. J., Reddy, P. T., Kelman, Z. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 27-44 (2015).
  59. Leiting, B., Marsilio, F., O'Connell, J. F. Predictable deuteration of recombinant proteins expressed in Escherichia coli. Analytical Biochemistry. 265 (2), 351-355 (1998).
  60. Perkins, S. J. Estimation of deuteration levels in whole cells and cellular proteins by 1H n.m.r. spectroscopy and neutron scattering. Biochemical Journal. 199 (1), 163-170 (1981).
  61. Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J. Operation of a benchtop bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (79), e50582(2013).
  62. Duff, A. P., Wilde, K. L., Rekas, A., Lake, V., Holden, P. J. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 3-25 (2015).
  63. Haertlein, M., et al. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 566, Academic Press. 113-157 (2016).
  64. Meilleur, F., Weiss, K. L., Myles, D. A. A. T Micro and Nano Technologies in Bioanalysis. Methods in Molecular Biology. 544, 281-292 (2009).
  65. Naing, S. -H., Oliver, R. C., Weiss, K. L., Urban, V. S., Lieberman, R. L. Solution structure of an intramembrane aspartyl protease via small angle neutron scattering. Biophysical Journal. 114 (3), 602-608 (2018).
  66. Training Requirements for First Time and Repeat Users. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/users (2018).
  67. Remote Analysis Cluster. , Available from: https://analysis.sns.gov (2018).
  68. Franke, D., et al. ATSAS 2.8: A comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).
  69. Software Suite. , Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html (2018).
  70. Software Individual Programs. , Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/software.html (2018).
  71. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: A Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1277-1282 (2003).
  72. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Science. 19 (4), 642-657 (2010).
  73. Svergun, D. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25 (4), 495-503 (1992).
  74. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40 (3), 191-285 (2007).
  75. Svergun, D. I., et al. Protein hydration in solution: Experimental observation by x-ray and neutron scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2267-2272 (1998).
  76. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 342-346 (2009).
  77. Svergun, D. I. Restoring Low Resolution Structure of Biological Macromolecules from Solution Scattering Using Simulated Annealing. Biophysical Journal. 76 (6), 2879-2886 (1999).
  78. Jacques, D. A., Guss, J. M., Svergun, D. I., Trewhella, J. Publication guidelines for structural modelling of small-angle scattering data from biomolecules in solution. Acta Crystallographica Section D. 68 (6), 620-626 (2012).
  79. Heller, W. T., et al. The Bio-SANS instrument at the High Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory. Journal of Applied Crystallography. 47 (4), 1238-1246 (2014).
  80. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735(2003).
  81. Johnson, J. L., Kalyoncu, S., Lieberman, R. L. Heterologous Expression of Membrane Proteins: Methods and Protocols. Mus-Veteau, I. , Springer. New York. 281-301 (2016).
  82. Department of Energy Public Access Plan. , Available from: http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan (2018).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Membranproteinanalysedeuteriummarkiertes ProteinGuinier AnalyseGr enausschlusschromatographieNeutronenkontrastanpassungSANS DatenreduktionPyMOL Visualisierung

Verwandte Artikel