Methodenartikel

Produktion und Visualisierung von bakteriellen Spheroplasts und Protoplasten antimikrobielle Peptide Lokalisierung zu charakterisieren

DOI:

10.3791/57904

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11. August 2018

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1Biochemistry Program, Wellesley College, 2Department of Chemistry, Wellesley College, 3Department of Biological Sciences, Wellesley College

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Gramnegative Escherichia coli (E. Coli) produzieren Spheroplasts und gram-positiven Bacillus Megatherium (B. Megatherium) Protoplasten deutlich sichtbar zu machen und schnell charakterisieren Peptid-Bakterien Interaktionen. Dies bietet eine systematische Methode zur Membran Lokalisierung und translocating Peptide zu definieren.

Zusammenfassung

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Die Verwendung der konfokalen Mikroskopie als eine Methode zur Bewertung von Peptid-Lokalisierung-Muster in Bakterien ist häufig durch die Auflösung Grenzen der konventionellen Lichtmikroskopen gehemmt. Da die Auflösung für einen bestimmten Mikroskop nicht leicht verbessert werden kann, präsentieren wir Protokolle, um die kleinen stabförmigen Gramnegative Escherichia coli (E. Coli) und die gram-positiven Bacillus Megatherium (B. Megatherium) verwandeln in größeren, leicht abgebildeten Sphärische Formen Spheroplasts oder Protoplasten genannt. Diese Transformation ermöglicht Beobachter schnell und eindeutig zu bestimmen, ob Peptide sich in die bakterielle Membran (z.B. Membran Lokalisierung nisten) oder überqueren Sie die Membran die Zelle (z.B. translocating) eingeben. Mit diesem Ansatz stellen wir auch eine systematische Methode zur Charakterisierung von Peptiden als Membran Lokalisierung oder translocating. Während diese Methode für eine Vielzahl von Membran-aktive Peptide und Bakterienstämme verwendet werden kann, zeigen wir die Nützlichkeit dieses Protokolls durch Beobachtung der Interaktion von Buforin II P11A (BF2 P11A), eine antimikrobielle Peptide (AMP), mit E. Coli Spheroplasts und B. Megatherium Protoplasten.

Einleitung

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Antimikrobielle Peptide (AMPs) haben Aufmerksamkeit durch ihre mögliche Verwendung als Alternative zu herkömmlichen Antibiotika1,2,3,4,5gewonnen. Ampere töten Bakterien, indem Sie entweder über die Zellmembran translocating und Interaktion mit intrazellulären Komponenten wie Nukleinsäuren oder durch die Membran verursacht Leckage der Zelle Inhalt6permeabilizing. Neben dem Einsatz als Antibiotika kann translocating AMPs für Drug Delivery Anwendungen angepasst werden, weil sie unterbrechungsfrei die wasserundurchlässigen Zellmembran7,8überqueren können. Wir versuchen daher, grundlegende AMP Wirkmechanismen, legen Sie den Grundstein für ihre Nutzung in Wirkstoffdesign zu verstehen.

Konfokalen Mikroskopie bietet eine Möglichkeit, Lokalisierung Muster von eindringmittel beschriftet Ampere in Bakterienzellen, die Einblicke in den Mechanismus der Aktion9,10,11,12, bewerten 13 , 14. durch Kennzeichnung der Membran der Bakterien, kann man feststellen, ob eine eindringmittel beschriftete Peptid, die Membran oder den intrazellulären Raum einer bakteriellen Zelle lokalisiert. Allerdings ist diese Technik durch die kleine Größe und Rod Form von Bakterien, begrenzt die imaging anspruchsvoll durch die Auflösung Grenzen der konventionellen Lichtmikroskopen und die Variable Ausrichtung der Bakterien auf der Folie15machen kann.

Die vorgestellte Methode soll verbesserte Visualisierung der Gewebekulturen beschrifteten Peptid Lokalisierung Muster mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie ermöglichen. Visualisierung wird ergänzt durch Drehen der kleinen, dünnen, stabförmige Gramnegative Escherichia coli (E. Coli) und gram-positiven Bacillus Megatherium (B. Megatherium) Bakterien in erweiterten, sphärische Formen genannt Spheroplasts (bei Gram-negativen Stämme) und Protoplasten (für Gram-positive Stämme)16,17,18,19,20,21. Spheroplasts und Protoplasten sind aufgrund ihrer Größe und ihrer symmetrischen Form, wodurch die Ausrichtung eines Bakteriums auf einer Folie irrelevant für die Bildgebung einfacher zu Bild. Darüber hinaus präsentieren wir einen systematischen Ansatz, um quantitativ konfokalen Mikroskopie Daten auswerten, um AMPs als entweder Membran Lokalisierung oder translocating zu charakterisieren. Anwendung dieser Methoden macht es leichter zu unterscheiden eindringmittel Peptid Lokalisierung Muster beschriftet. Die hier vorgestellten Protokolle können verwendet werden, um die Lokalisierung von einer Vielzahl von Membran-aktive Akteure als Verstärker, einschließlich der Zelle eindringen Peptide zu beurteilen.

Ein Vorteil dieser Technik ist, dass es Einblicke in den Mechanismus der Wirkung von AMPs auf eine einzelne Zelle-Ebene bietet die Heterogenität von Zelle zu Zelle15, im Gegensatz zu anderen Fluoreszenz-Assays häufig verwendet, um ermitteln zu offenbaren, kann die Mechanismen der Wirkung von AMPs, die nur lose Schätzungen9,22,23,24,25zur Verfügung zu stellen. Die Verwendung von Spheroplasts und Protoplasten AMP Zelleintrag Beurteilung ist insbesondere nützlich26 , weil sie mehr physiologisch relevanten15 als andere Modelle zur Bewertung von Zelleintrag wie Lipid Vesicles24sind.

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Protokoll

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1. Vorbereitung der Lösung

Hinweis: Bereiten Sie Lösungen beschrieben Schritte 1.1 – 1,9 und 1,8 – 1.11 um E. Coli Spheroplasts und B. Megatherium Protoplasten, bzw. zu produzieren.

  1. Bereiten Sie 1 M Tris-Cl, pH 7,8 von aufzulösen 10,34 g Tris HCl und 4,17 g Tris OH in 50 mL dH2O in einer 125 mL Flasche. Sterilisieren durch Filterung durch eine 25 mm-Spritze-Filter mit 0,2 µm Membran und in einem konischen Rohr bei Raumtemperatur lagern.
  2. Bereiten Sie Lösung A (20 mM MgCl2, 0,7 M Saccharose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8 vor) durch Auflösen von 0,10 g MgCl2 (95,2 g/Mol) und 11,98 g Saccharose (342.3 g/Mol) in 25 mL dH2O in einer 125 mL Flasche. Hinzufügen von 500 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) und stellen Sie die Lautstärke auf 50 mL. Sterilisieren durch Filterung durch eine 25 mm-Spritze-Filter mit 0,2 µm Membran und in einem konischen Rohr bei Raumtemperatur lagern.
  3. Bereiten Sie Lösung B (10 mM MgCl2, 0,8 M Saccharose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8 vor) durch Auflösen von 0,05 g MgCl2 (95,2 g/Mol) und 13,69 g Saccharose (342.3 g/Mol) in 25 mL dH2O in einer 125 mL Flasche. Hinzufügen von 500 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) und stellen Sie die Lautstärke auf 50 mL. Sterilisieren durch Filterung durch eine 25 mm-Spritze-Filter mit 0,2 µm Membran und in einem konischen Rohr bei Raumtemperatur lagern.
  4. Bereiten Sie 0,8 M Saccharose durch Auflösen von 13,69 g Saccharose (342.3 g/Mol) in 50 mL dH2O in einer 125 mL Flasche vor. Sterilisieren durch Filterung durch eine 25 mm-Spritze-Filter mit 0,2 µm Membran und in einem konischen Rohr bei Raumtemperatur lagern.
  5. Vorbereiten von 5 mg/mL Deoxyribonuclease ich (DNase ich) durch Auflösen von 0,015 g DNase I 3 mL dH2O in ein 50 mL Fläschchen. Sterilisieren Sie durch Filterung durch eine 25 mm-Spritze-Filter mit einer 0,2 µm-Membran. Aliquoten Lösung in Microfuge Tuben und Speicher bei-20 ° C.
  6. Bereiten Sie 0,125 M Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), pH 8,0 durch Auflösen 0,698 g EDTA binatrium entwässern (372.2 g/Mol) in 15 mL dH2O in einer 125 mL Flasche. Sterilisieren durch Filterung durch eine 25 mm-Spritze-Filter mit 0,2 µm Membran und in einem konischen Rohr bei Raumtemperatur lagern.
  7. Bereiten Sie 600 µg/mL Cephalexin durch Auflösen von 0,03 g von Cephalexin Hydrat (365.404 g/Mol) in 50 mL dH2O in einer 125 mL Flasche vor. Sterilisieren durch Filterung durch eine 25 mm-Spritze-Filter mit 0,2 µm Membran und speichern in einem konischen Rohr bei 4 ° C.
  8. Bereiten Sie 5 mg/mL Lysozym durch Auflösen von 0,015 g Lysozym in 3 mL dH2O in ein 50 mL Fläschchen vor. Sterilisieren Sie durch Filterung durch eine 25 mm-Spritze-Filter mit einer 0,2 µm-Membran. Aliquoten Lösung in Microfuge Tuben und Speicher bei-20 ° C.
  9. Bereiten Sie 3 % w/V Trypticase-Soja-Bouillon (TSB vor) durch Auflösen von 30 g TSB in 1 L dH2O in eine 2 L Flasche. Aliquoten die Lösung in Flaschen mit 25 mL oder 100 mL TSB bzw. bei der Vorbereitung von E. Coli Spheroplasts oder B. Megatherium Protoplasten, verwendet werden. Autoklaven-Fläschchen, das flüssige Medium zu sterilisieren. Sterile TSB kann bei Raumtemperatur oder 4 ° c aufbewahrt werden
  10. Bereiten Sie Lösung C (1 M Saccharose, 0,04 M Maleat, 0,04 M MgCl2, pH 6,5 vor) durch Auflösen 34,23 g Saccharose (342.3 g/Mol), 0,46 g Maleic Acid (116.07 g/Mol) und 0,38 g MgCl2 (95.21 g/Mol) in 100 mL dH2O in ein 250-mL-Fläschchen. Stellen Sie ein pH-Wert bis 6,5. Sterilisieren durch Filterung durch eine 25 mm-Spritze-Filter mit 0,2 µm Membran und in einem konischen Rohr bei Raumtemperatur lagern.
  11. Bereiten Sie 200 mL Protoplasten Medium durch Mischen 100 mL 3 % w/V TSB und 100 mL Lösung C in einer 1 L Glasflasche. Autoklaven sterilisieren die Lösung und bei Raumtemperatur lagern.

2. Vorbereitung der Nacht Kultur

Hinweis: Führen Sie Abschnitte 2 bis 4 mit entsprechenden sterile Techniken. Falls gewünscht, kann ein Bakterienstamm ein Plasmid für Antibiotika-Resistenz, Verringerung der möglichen Kontamination enthalten. Bei einer Belastung mit Antibiotika-Resistenz, fügen Sie die notwendigen Antibiotika in Schritte 2.1, 3.1, 3.2 und 4.1 – 4.4.

  1. Bereiten Sie eine Übernachtung Kultur durch Abnehmen eine einzige Kolonie von Bakterien mit einer sterilen Pipettenspitze und stellen Sie es in ein 14 mL-Kultur-Rohr mit 2 – 3 mL 3 % w/V TSB. Inkubation bei 37 ° C unter Schütteln für 16 – 21 h.

3. Vorbereitung der Gram-negativen E. Coli Spheroplasts

  1. In einem 250 mL-Kolben, verdünnen die Nacht Kultur 1: 100 in 25 mL Volumen von 3 % w/V TSB und inkubieren Sie die bakterielle Lösung bei 37 ° C unter Schütteln für ca. 2,5 Stunden, bis die Lösung eine optische Dichte von 0,5 – 0,8 bei 600 erreicht hat nm. Messen Sie die optische Dichte mit einem Spektralphotometer.
  2. In einem 250 mL-Kolben, verdünnen Sie diese Kultur 01:10 in 30 mL 3 % w/V TSB und Inkubation bei 37 ° C unter Schütteln für 2,5 h in Anwesenheit von 60 µg/mL Cephalexin (347.4 g/Mol), einzelne Zelle Filamente von etwa produzieren 50 – 150 µm in der Länge , sind die beobachtbaren unter 1.000 X Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop (Abbildung 1 b).
  3. Ernte der Filamente durch Zentrifugieren die bakterielle Lösung bei 1.500 X g, 4 ° C für 4 min. dekantieren und entsorgen des Überstands, das Pellet zu reservieren.
  4. Waschen Sie die Filamente durch sanft Zugabe von 1 mL von 0,8 M Saccharose, wobei Sie darauf achten, nicht zu stören das Pellet. 1 min inkubieren, und ohne zu stören das Pellet überstand verwerfen.
  5. Fügen Sie 150 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 µL 5 mg/mL Lysozym, 30 µL von 5 mg/mL DNase I und 120 µL 0,125 M EDTA in ihren jeweiligen, um die Pellets und die Lösung bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.
  6. 1 mL der Lösung A nach und nach mehr als 1 min der Projektmappe fügen Sie in 3,5 mit einer Mikropipette, während sanft wirbeln die Lösung von hand zubereitet hinzu. Inkubieren Sie die Lösung für 4 Minuten bei Raumtemperatur.
  7. Genommen Sie 7 mL 4 ° C Lösung B in zwei 15 mL konische Röhrchen. Fügen Sie gleiche Mengen der Lösung in 3.6 zu jedem dieser beiden Röhren vorbereitet. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 1.500 X g, 4 ° C für 4 min.
  8. Mit einer serologischen Pipette, sorgfältig entfernen Sie alle 1–2 mL überstand ohne zu stören das Pellet. Aufschwemmen der Pellets durch sanft nach oben und unten mit einer Mikropipette P1000 pipettieren. Überprüfen Sie visuell Spheroplasts Bildung durch die Beobachtung der Probe bei 1.000 X Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop (Abbildung 1).
  9. Speichern Sie die Spheroplasts bei-20 ° C bis zu einer Woche oder bis sie 3 Gefrier-tau-Zyklen durchlaufen haben.

4. Vorbereitung der gram-positiven B. Megatherium Protoplasten

  1. In einem 250 mL-Kolben, verdünnen die Nacht Kultur 1:1,000 in 100 mL 3 % w/V TSB und inkubieren Sie die bakterielle Lösung bei 37 ° C unter Schütteln für ca. 4.5 h, bis die Lösung eine optische Dichte von 0,9–erreicht hat 1.0 bei 600 nm. Messen Sie die optische Dichte mit einem Spektralphotometer.
  2. Gießen Sie die Flüssigkultur in zwei 50 mL konische Röhrchen und Zentrifuge bei 2.000 X g, 4 ° C für 10 Minuten.
  3. Mit einer serologischen Pipette, verwerfen des Überstands von beiden konischen Rohren. Aufschwemmen Sie jedes Pellet in 2,5 mL Protoplasten Medium und kombinieren Sie die resuspendierte Lösungen in einem einzigen konischem Rohr. Pipette die kombinierte resuspendierte Lösung in einer 125 mL Flasche.
  4. Fügen Sie 1 mL 5 mg/mL Lysozym und beim Schütteln für 1 h bei 37 ° C inkubieren.
  5. Überwachen Sie das Wachstum von Protoplasten unter 1.000 X Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop, Feststellung von Unregelmäßigkeiten, wie z.B. Bakterien, die als geschwollene Stäbe anstelle von Kugeln (Abbildung 2) angezeigt werden. Mit einer serologischen Pipette, die Lösung auf eine 15 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 2.000 X g, 4 ° C für 10 min übertragen.
  6. Abgießen Sie den überstand und wieder auszusetzen Sie das Pellet in 5 mL Protoplasten Medien. Speichern Sie Protoplasten bei-20 ° C bis zu einer Woche oder bis sie 3 Gefrier-tau-Zyklen durchlaufen haben.

5. Vorbereitung des Peptidlösung und Membran Farbstoff für die Bildgebung

  1. Peptidlösung
    1. Lösen sich in einem Microfuge Rohr in Alufolie gewickelt 2 mg FITC beschriftet BF2 P11A 800 µL dH2O. Einsatz ein Peptid enthält mindestens eine Tryptophan-Rückstand um Protein-Konzentration-Messungen durchführen.
    2. Spektrophotometrisch, Messen Sie die Absorption der Peptid-Lösung bei 280 nm in dreifacher Ausfertigung. Berechnen Sie die Peptid-Konzentration mit der molaren Aussterben Koeffizient für Tryptophan (5.700/Mcm).
    3. Verdünnen Sie die Peptid-Konzentration in dH,2O, eine Endkonzentration von 100 – 200 µM. Store in einem Microfuge Rohr bei-20 ° C in Alufolie eingewickelt um vor Licht zu schützen.
  2. Membran-Farbstoff
    1. Bereiten Sie in einem Microfuge Rohr ein 10 mM Lager an di-8-ANEPPS (592.9 g/Mol) durch 5 mg di-8-ANEPPS in 843.3 µL von DMSO auflösen. Lagerung bei 4 ° C, eingewickelt in Alufolie um vor Licht zu schützen.
    2. Bereiten Sie in einem Microfuge Rohr 1 mL von 0,03 mM di-8-ANEPPS 997 µL DMSO 3 µL 10 mM di-8-ANEPPS hinzu. Speichern Sie in einem Microfuge Rohr bei 4 ° C, eingewickelt in Alufolie um vor Licht zu schützen.

(6) Visualisierung von E. Coli Spheroplasts und B. Megatherium Protoplasten verwenden konfokalen Mikroskopie

  1. Pipette 5 µL des Spheroplasts oder Protoplasten in einem Poly-L-Lysin beschichtetes Glas-Folie. Fügen Sie 2 µL FITC AMP (100-200 µM) zur Folie beschriftet und inkubieren Sie 3 min vor Licht geschützt werden.
  2. Fügen Sie 1 µL der Membran Farbstoff di-8-ANEPPS (0,03 mM hinzu) zur Folie und inkubieren Sie für 3 min vor Licht geschützt werden. Mit ein Glas Deckglas abdecken und mit den Nagellack versiegeln.
  3. Schalten Sie das konfokale Mikroskop und Argon-Laser. Der Argonlaser auf 20 % Leistung und 20 % Übertragung einstellen.
  4. Emission Wellenlängenbereiche 499 – 532 nm und 670 – 745 nm für die FITC-markierte Peptid Emission und di-8-ANEPPS-Label Membran Farbstoff Emission Kanal, "bzw." festgelegt.
  5. Bild Protoplasten oder Spheroplasts (Abbildung 1 und Abbildung 2) mit einem 63 X Objektiv. Imaging-Software zu verwenden, zu 8-Bit, 512 x 512 zusammengesetzte Z-Stapel Bilder aus 0,5 µm Scheiben die Gesamtheit des Spheroplast oder des Protoplasten.
    Hinweis: Nehmen Sie Durchbluten und bildgebende Spheroplasts und Protoplasten reiflicher Überlegung, die Emissionen zu reduzieren. Siehe Diskussion für Details.

(7) Charakterisierung der AMP-Lokalisierung

  1. Öffnen Sie das zusammengesetzte Z-Stapel-Bild im imaging-Software. Suchen Sie die Mitte-die meisten Scheibe des Spheroplast oder des Protoplasten und legen Sie eine kreisförmige Region von Interesse (ROI) (0,3 µm im Durchmesser) auf die Membran (ROI 1), in der Mitte des Spheroplast oder des Protoplasten (ROI-2) und vom Spheroplast oder Protoplasten nach Maß die Hintergrundfluoreszenz (ROI 3) (Abbildung 5). Vermeiden Sie die Aufnahme von gesättigten Pixel. Die Fluoreszenzintensität in jedem ROI kann durch imaging-Software berechnet werden.
    Hinweis: In Fällen wenn Peptid nicht auf die Gesamtheit der Membran zu lokalisieren, ziehen Sie ROI 1 auf einer Fläche der Membran, wo das Peptid lokalisiert ist.
  2. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um das Verhältnis von intrazellulären Peptid Fluoreszenzintensität Membran Peptid Fluoreszenz Intensität zu bestimmen:
    figure-protocol-1
    Hinweis: Der Fluoreszenzintensität ROI 3 wird von Fluoreszenz-Intensität im ROI 2 und ROI 1 subtrahiert, um Hintergrundfluoreszenz Rechnung zu tragen.

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Ergebnisse

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Durch die Vergrößerung der Bakterien und sphärische zu machen, können wir leicht unterscheiden, ob Peptide, die bakterienmembran lokalisieren oder leicht über die bakterienmembran translozieren. Die Auflösung Grenzen der konventionellen Lichtmikroskopen machen es schwierig um zu unterscheiden, ob Peptid Signale aus der Membran oder intrazellulären Raum im normalen Bakterien entstehen, weil die Signale an die Membran lokalisiert angezeigt werden, um Überschneidungen mit den intrazellulären...

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Diskussion

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Die hier vorgestellten Protokolle machen es möglich für Forscher, schneller größere Stichprobengrößen der bakteriellen Bilder zu erhalten, weil die erweiterten, kugelförmigen Bakterien viel einfacher sind zu finden, orientieren und Bild. Diese verbesserte Fähigkeit, Daten zu sammeln lohnt sich in mehrfacher Hinsicht. Erstens ermöglicht es eine systematischere Quantitative Analyse der Peptid-Lokalisierung-Muster. Während qualitative Entwicklung von kleineren Mengen von Bildern nachgewiesen werden können, nur eine große St...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Keine Interessenkonflikte werden erklärt.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Forschung wurde vom National Institute of Allergy und Infektionskrankheiten (NIH-NIAID) Award R15AI079685 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Trizma Hydroclorid (Tris HCl)SigmaT3253
Trizma Base (Tris OH)SigmaT1503
MagnesiumchloridSigmaM8266
SaccharoseSigmaS7903
LysozymSigmaL6876
Desoxyribonuklease ISigmaD4527
EthylendiamintetraessigsäureSigma106361Verwendete Sigma 106361 in der ursprünglichen Protokollentwicklung; 106361 abgesetzt mit ED2SS als Ersatz
CephalexinhydratSigmaC4895
AmpicillinFisher ScientificBP1760
BBL Trypticase-SojabrüheFisher ScientificB11768
BF2 P11A FITCNeoScientificSonderanfertigung
di-8-ANEPPSBiotium61012
DMSOSigma34869Verwendete Sigma D8779 in der ursprünglichen Protokollentwicklung; D8779 abgekündigt mit 34869 als Ersatz
MaleinsäureSigmaM0375
Acrodisc 25 mm Spritzenvorsatzfilter mit 0,2 μ m HT Tuffryn MembranePall Corporation4192
Konfokales Laserscanning-MikroskopLeica MicrosystemsTCS SP5 IIFür die Bilderfassung
Leica Application Suite, Advanced FluorescenceLeica MicrosystemsFür die Bildverarbeitung

Referenzen

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ProtoplastenbildungKonfokalmikroskopiePeptid Membran InteraktionE coli SpheroplastenB megaterium ProtoplastenFluoreszenzmarkiertes Peptid TrackingZellmembrananalysePeptid Translokations Assay

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