Produktion und Visualisierung von bakteriellen Spheroplasts und Protoplasten antimikrobielle Peptide Lokalisierung zu charakterisieren

Dania M. Figueroa; Heidi M. Wade; Katrina P. Montales; Donald E. Elmore; Louise E.O. Darling

doi:10.3791/57904

Methodenartikel

Produktion und Visualisierung von bakteriellen Spheroplasts und Protoplasten antimikrobielle Peptide Lokalisierung zu charakterisieren

DOI:

10.3791/57904

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11. August 2018

Dania M. Figueroa¹ , Heidi M. Wade¹^,² , Katrina P. Montales² , Donald E. Elmore¹^,² , Louise E.O. Darling¹^,³

¹Biochemistry Program, Wellesley College, ²Department of Chemistry, Wellesley College, ³Department of Biological Sciences, Wellesley College

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Gramnegative Escherichia coli (E. Coli) produzieren Spheroplasts und gram-positiven Bacillus Megatherium (B. Megatherium) Protoplasten deutlich sichtbar zu machen und schnell charakterisieren Peptid-Bakterien Interaktionen. Dies bietet eine systematische Methode zur Membran Lokalisierung und translocating Peptide zu definieren.

Zusammenfassung

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Die Verwendung der konfokalen Mikroskopie als eine Methode zur Bewertung von Peptid-Lokalisierung-Muster in Bakterien ist häufig durch die Auflösung Grenzen der konventionellen Lichtmikroskopen gehemmt. Da die Auflösung für einen bestimmten Mikroskop nicht leicht verbessert werden kann, präsentieren wir Protokolle, um die kleinen stabförmigen Gramnegative Escherichia coli (E. Coli) und die gram-positiven Bacillus Megatherium (B. Megatherium) verwandeln in größeren, leicht abgebildeten Sphärische Formen Spheroplasts oder Protoplasten genannt. Diese Transformation ermöglicht Beobachter schnell und eindeutig zu bestimmen, ob Peptide sich in die bakterielle Membran (z.B. Membran Lokalisierung nisten) oder überqueren Sie die Membran die Zelle (z.B. translocating) eingeben. Mit diesem Ansatz stellen wir auch eine systematische Methode zur Charakterisierung von Peptiden als Membran Lokalisierung oder translocating. Während diese Methode für eine Vielzahl von Membran-aktive Peptide und Bakterienstämme verwendet werden kann, zeigen wir die Nützlichkeit dieses Protokolls durch Beobachtung der Interaktion von Buforin II P11A (BF2 P11A), eine antimikrobielle Peptide (AMP), mit E. Coli Spheroplasts und B. Megatherium Protoplasten.

Einleitung

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Antimikrobielle Peptide (AMPs) haben Aufmerksamkeit durch ihre mögliche Verwendung als Alternative zu herkömmlichen Antibiotika¹^,²^,³^,⁴^,⁵gewonnen. Ampere töten Bakterien, indem Sie entweder über die Zellmembran translocating und Interaktion mit intrazellulären Komponenten wie Nukleinsäuren oder durch die Membran verursacht Leckage der Zelle Inhalt⁶permeabilizing. Neben dem Einsatz als Antibiotika kann translocating AMPs für Drug Delivery Anwendungen angepa....

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Protokoll

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1. Vorbereitung der Lösung

Hinweis: Bereiten Sie Lösungen beschrieben Schritte 1.1 – 1,9 und 1,8 – 1.11 um E. Coli Spheroplasts und B. Megatherium Protoplasten, bzw. zu produzieren.

Bereiten Sie 1 M Tris-Cl, pH 7,8 von aufzulösen 10,34 g Tris HCl und 4,17 g Tris OH in 50 mL dH₂O in einer 125 mL Flasche. Sterilisieren durch Filterung durch eine 25 mm-Spritze-Filter mit 0,2 µm Membran und in einem konischen Rohr bei Raumtemperatur lagern.
Bereiten Sie Lösung A (20 mM MgCl₂, 0,7 M Saccharose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8 vor) durch Auflösen von 0,10 g MgCl₂(95,2 g/Mol) und 11,98 ....

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Ergebnisse

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Durch die Vergrößerung der Bakterien und sphärische zu machen, können wir leicht unterscheiden, ob Peptide, die bakterienmembran lokalisieren oder leicht über die bakterienmembran translozieren. Die Auflösung Grenzen der konventionellen Lichtmikroskopen machen es schwierig um zu unterscheiden, ob Peptid Signale aus der Membran oder intrazellulären Raum im normalen Bakterien entstehen, weil die Signale an die Membran lokalisiert angezeigt werden, um Überschneidungen mit den intrazellulären.......

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Diskussion

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Die hier vorgestellten Protokolle machen es möglich für Forscher, schneller größere Stichprobengrößen der bakteriellen Bilder zu erhalten, weil die erweiterten, kugelförmigen Bakterien viel einfacher sind zu finden, orientieren und Bild. Diese verbesserte Fähigkeit, Daten zu sammeln lohnt sich in mehrfacher Hinsicht. Erstens ermöglicht es eine systematischere Quantitative Analyse der Peptid-Lokalisierung-Muster. Während qualitative Entwicklung von kleineren Mengen von Bildern nachgewiesen werden können, nur eine große St.......

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Offenlegungen

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Keine Interessenkonflikte werden erklärt.

Danksagungen

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Forschung wurde vom National Institute of Allergy und Infektionskrankheiten (NIH-NIAID) Award R15AI079685 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Trizma Hydroclorid (Tris HCl)	Sigma	T3253
Trizma Base (Tris OH)	Sigma	T1503
Magnesiumchlorid	Sigma	M8266
Saccharose	Sigma	S7903
Lysozym	Sigma	L6876
Desoxyribonuklease I	Sigma	D4527
Ethylendiamintetraessigsäure	Sigma	106361	Verwendete Sigma 106361 in der ursprünglichen Protokollentwicklung; 106361 abgesetzt mit ED2SS als Ersatz
Cephalexinhydrat	Sigma	C4895
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760
BBL Trypticase-Sojabrühe	Fisher Scientific	B11768
BF2 P11A FITC	NeoScientific	Sonderanfertigung
di-8-ANEPPS	Biotium	61012
DMSO	Sigma	34869	Verwendete Sigma D8779 in der ursprünglichen Protokollentwicklung; D8779 abgekündigt mit 34869 als Ersatz
Maleinsäure	Sigma	M0375
Acrodisc 25 mm Spritzenvorsatzfilter mit 0,2 μ m HT Tuffryn Membrane	Pall Corporation	4192
Konfokales Laserscanning-Mikroskop	Leica Microsystems	TCS SP5 II	Für die Bilderfassung
Leica Application Suite, Advanced Fluorescence	Leica Microsystems		Für die Bildverarbeitung

Referenzen

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Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).
Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicr....

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Protoplast Formation Confocal Microscopy Peptide Membrane Interaction E coli Spheroplasts B megaterium Protoplasts Fluorescent Peptide Tracking Cell Membrane Analysis Peptide Translocation Assay

Produktion und Visualisierung von bakteriellen Spheroplasts und Protoplasten antimikrobielle Peptide Lokalisierung zu charakterisieren

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