Gewebespezifische MiRNA Expression Profiling in Maus Herz Abschnitte In Situ Hybridisierung

Summary

Mikro-RNAs (MiRNAs) sind kurz und stark homologe RNA-Sequenzen, dienen als Posttranskriptionale Regulatoren der Messenger-RNAs (mRNAs). Aktuelle MiRNA Nachweismethoden unterscheiden sich in der Sensitivität und Spezifität. Wir beschreiben eine Protokoll, die in Situ Hybridisierung und Immunostaining für die gleichzeitige Erkennung von MiRNA und Protein-Moleküle auf Maus Herz Gewebeschnitte verbindet.

Abstract

Mikro-RNAs (MiRNAs) sind einsträngige RNA-Transkripte, die an Messenger-RNAs (mRNAs) binden und deren Übersetzung hemmen oder fördern ihren Abbau. Bisher waren MiRNAs in eine große Anzahl von biologischen und Krankheit Verfahren verwickelt, die die Notwendigkeit für die zuverlässige Nachweismethoden MiRNA Transkripte bezeichnet hat. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für Digoxigenin-markierten (DIG) gesperrt Nukleinsäure (LNA) testbasierte MiRNA-Erkennung, kombiniert mit Protein Immunostaining auf Maus Herz Abschnitte. Zunächst führten wir eine in Situ Hybridisierung-Technik mit der Sonde, um MiRNA-182 Ausdruck im Herzen Abschnitte von Kontrolle und Herzhypertrophie Mäuse zu identifizieren. Als nächstes führten wir Immunostaining für kardiale Troponin T (cTnT) Protein, auf die gleichen Abschnitte, MiRNA-182 mit den Cardiomyocyte Zellen Co zu lokalisieren. Unter Verwendung dieses Protokolls, konnten wir erkennen, dass MiRNA-182 durch eine alkalische Phosphatase farbmetrischen Assay und cTnT durch fluoreszierende Färbung basiert. Dieses Protokoll kann verwendet werden, den Ausdruck der jede MiRNA des Interesses durch LNA DIG-markierten Sonden und entsprechende Protein-Expression auf Maus Herz Gewebeschnitte erkennen.

Introduction

Mikro-RNAs (MiRNAs) sind kurz (18-25 Nukleotide), einzelsträngig, Forensisches RNAs, die als negativer Regulator der Genexpression auf Posttranskriptionale Ebene funktionieren durch Hemmung der Boten-RNA (mRNA) Übersetzung und/oder Förderung der mRNA Abbau ¹. MiRNAs sind transkribiert von Introns und Exons der Codierung oder Forensisches Gene und sind im Zellkern durch DROSHA, zum Vorläufer MiRNAs (Pre-MiRNAs), die kurzen Stiel-Loop-Strukturen von 70 Nukleotide²sind gespalten. Export nach zytoplasmatischen, Pre-MiRNAs weiterverarbeitet werden von DICER in Reife MiRNAs, die 18-25 Nukleotide^3,<....

Protocol

Maus Herz Gewebeproben für diese Studie wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Gesetzen und Richtlinien und wurden von Yale Universität institutionelle Animal Care und Use Committee genehmigt.

1. Vorbereitung der Lösung

1. RNase frei DdH₂O vorbereiten, indem man 5 L DdH₂O mit 5 mL 0,1 % Diethylpyrocarbonate (DEPC) über Nacht (O/N), bei Raumtemperatur (RT). Autoklaven (121 ° C), die DEPC zu deaktivieren. Verwendung DEPC-behandeltem DdH₂O für die Vorbereitung der nachgelagerte Lösungen als angegeben.
   Achtung: DEPC ist ein bekanntes Karzinogen, nur in der Dunstabzugshaube zu behandeln.
....

Results

MiRNA in Situ Hybridisierung wurde auf Maus Herz Abschnitte mit einem Gerangel MiRNA und U6-SnRNA, diente als negativ-und Positivkontrollen bzw. optimiert. Positive Färbung wird angegeben in blau, während die negative Färbung durch die fehlende Farbentwicklung angezeigt wird (Abbildung 1A-1 b). Cardiomyocyte Konkretisierung der MiRNA-182 wurde abschnittsweise Herz von Kontrolle und PlGF überexprimierenden Mäusen bewertet. Die Mäuse t.......

Discussion

MiRNA-Transkript-Erkennung kann durch verschiedene Techniken erreicht werden, die in Sensitivität, Spezifität und quantitative Leistung variieren. Hier zeigen wir die Kopplung von MiRNA in Situ Hybridisierung mit Immunostaining und ein Protokoll, das ermöglicht eine gleichzeitige Beurteilung der Ausdruck Niveaus von MiRNA und Protein-Moleküle, auf die gleichen Herzen Abschnitte beschreiben. Wir zeigen zunächst wie in Situ Hybridisierung von DIG-Label LNA MiRNA Sonden auf Paraffin eingebettet Herz Abschn.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diethylpyrocarbonat	Sigma Aldrich	D5758	DEPC
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung	Sigma Aldrich	P4417	PBS
Tween-20	American Bioanalytical	AB02038	nichtionisches Tensid
Histoclear	National Diagnostics	HS-200
Proteinase K, rekombinant, PCR Grade	Sigma Aldrich	3115879001	ProK
Paraformaldehyd	Sigma Aldrich	P6148	PFA
Natriumchlorid	ThermoFisher	S271	NaCl
Magnesiumchlorid Hexahydrat	ThermoFisher	M33	MgCl2
Tris	Sigma Aldrich	T6066
Salzsäurelösung, 1 N	ThermoFisher	SA48	HCl
Salzsäurelösung, 12 N	ThermoFisher	S25358	HCl
1-Methylimidazol	Sigma Aldrich	336092
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimidhydrochlorid	Sigma Aldrich	39391	EDC
Wasserstoffperoxidlösung H2O2	Sigma Aldrich	216763	H2O2
Trinatriumcitrat-Dihydrat	Sigma Aldrich	S1804	Natriumcitrat
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)	Qiagen	339450	Scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 Detektionssonde	QIagen	YD00615701	5'-DIG und 3'-DIG markiertes
Levamisolhydrochlorid	Sigma Aldrich	31742
Rinderserumalbumin	Sigma Aldrich	A9647	BSA
NBT/BCIP Tabletten	Sigma Aldrich	11697471001	NBT-BCIP
Kaliumchlorid	ThermoFisher	P217	KCl
DAPI Lösung (1mg/ml)	ThermoFisher	62248	DAPI
Glasdeckglas	ThermoFisher	12-545E	Glasdeckglas
Deckglas Deckglas Deckglas	Grace Bio-Labs	HS40 22mmX40mmX0,25mm	RNA-ase freies Kunststoffdeckglas
Anti-Digoxigenin-AP, Fab-Fragmente	Sigma Aldrich	11093274910	DIG Antikörper
Hydrophober Barrierestift	Vector Laboratories	H-4000	Pap Pen
Anti-Cardiac Troponin T Antikörper	Abcam	ab92546	cTnT
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) kreuzresorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 568	ThermoFisher	A-11011	Anti-Kaninchen-568-Antikörper
Dako Fluoreszenz-Eindeckmedium	DAKO	S3023	Eindeckmedium Eindeckmedium
Schafsserum	Sigma Aldrich	S3772
Ziegenserum	Sigma Aldrich	G9023
deionisiertes Formamid	Amerikanisch Bioanalytischer	AB00600
Hybridisierungsofen	ThermoFisher	UVP HB-1000 Hybridizer