Chemischen Rückfall von herkömmlichen menschlichen pluripotenten Stammzellen in eine naiv-artigen Zustand mit verbesserten Multilineage Differenzierung Potenz

Zusammenfassung

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für die effiziente, Bulk und schnelle chemische Rückfall von konventionellen Linie grundiert menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSC) in einen Epigenomically-Stall naiv Präimplantations Epiblast-ähnliche pluripotenten Zustand. Diese Methode ergibt verringerte Abstammung grundiert Genexpression und deutliche Verbesserung der gerichteten multilineage Differenzierung über ein breites Repertoire von konventionellen hPSC Linien.

Zusammenfassung

Naive menschliche pluripotenten Stammzellen (N-hPSC) mit verbesserter Funktionalität möglicherweise einen großen Einfluss in der regenerativen Medizin. Das Ziel dieses Protokolls ist effizient Abstammung grundiert, konventionellen menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSC) gepflegt Feeder-frei oder Feeder-abhängige Bedingungen ein naiv anmutenden Pluripotenz mit verbesserter Funktionalität wiederherzustellen. Diese chemischen naiv Rückfall-Methode setzt den klassischen Leukämie hemmenden Faktor (LIF), GSK3β, MEK/ERK Hemmung und cocktail (LIF-2i), ergänzt mit nur einem Tankyrase Inhibitor XAV939 (LIF-3i). LIF-3i wird konventionelle hPSC einen stabilen pluripotenten Zustand Annahme biochemische, transkriptionelle und epigenetischen Merkmale des Menschen vor der Implantation Epiblast zurückgesetzt. Diese LIF-3i-Methode erfordert minimale Zelle Kultur Manipulation und ist in ein breites Repertoire an humanen embryonalen Stammzellen (hESC) und Transgen-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSC) Linien sehr reproduzierbar. Die LIF-3i-Methode erfordert keinen erneut grundieren Schritt vor der Differenzierung; N-hPSC unterscheiden sich direkt mit sehr hohen Wirkungsgraden und pflegen karyotypic und epigenomischen Stabilitäten (unter Einschluss der aufgedruckten Loci). Um die Universalität der Methode zu erhöhen, werden die konventionellen hPSC zuerst in der LIF-3i-Cocktail, ergänzt durch zwei zusätzliche kleine Moleküle, die Proteinkinase (Forskolin) und sonic Hedgehog (sHH) (Purmorphamine) Signalisierung (LIF-5i) potenzieren kultiviert. Dieser kurze LIF-5i Anpassung Schritt deutlich verbessert die erste klonale Expansion der konventionellen hPSC und ihnen erlaubt, anschließend naiv-zurückversetzt mit LIF-3i allein in Großmengen, damit die Notwendigkeit einer Kommissionierung/subcloning seltene N-hPSC vermieden werden später Kolonien. LIF-5i-stabilisierten hPSCs anschließend in LIF-3i allein ohne die Notwendigkeit von Anti-apoptotische Molekülen bestehen. Am wichtigsten ist, verbessert LIF-3i Rückfall deutlich die funktionelle Pluripotenz ein breites Repertoire von konventionellen hPSC durch Verringerung ihrer Abstammung grundiert Genexpression und löschen die Interline-Variabilität der gerichteten Differenzierung häufig unter den unabhängigen hPSC Linien beobachtet. Repräsentative Charakterisierungen von LIF-3i-zurückversetzt N-hPSC sind vorgesehen ist, und experimentelle Strategien für funktionale Vergleiche der isogenen hPSC in Linie grundiert Vs. naiv-ähnliche Zustände werden beschrieben.

Einleitung

Das Kultursystem 2i (MEK/ERK und GSK3β-Hemmer) wurde ursprünglich entwickelt, um heterogene Serum-Maus embryonale Stammzellen (mESC) Kulturen in eine einheitliche Grundzustand der Pluripotenz verwandt mit der Maus Präimplantations Epiblast¹zu verfeinern. 2i unterstützt jedoch nicht die stabile Erhaltung der menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSC) Linien². Die verschiedenen komplexe niedermolekularer Wachstumsfaktor ergänzt, und transgene Ansätze vor kurzem berichtet wurde, vermeintlich erfassen ähnlich menschlichen naiv anmutenden pluripotenten Molekulare heißt es²

Protokoll

Alle tierische Verfahren wurden nach Tierbetreuung Leitlinien und Protokolle von der Johns Hopkins Schule von Medizin Institut der Tierpflege und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt durchgeführt.

1. Vorbereitung der Maus embryonalen Fibroblasten (MEF) für Feeder-abhängige konventionelle (hESC Medium/MEF) oder naiv-zurückversetzt (LIF-3i Medium/MEF) hPSC Kultur

1. Kaufen oder Inhouse Low-Passage Lieferungen von MEF Feeder von CF1 oder CF1 x DR4 Hybrid E13.5 mausembryonen nach veröffentlichten Protokolle⁴vorbereiten.
   1. Tiefgefrieren niedrigen Durchgang (p1-p2) MEF Kulturen vor (für lang....

Ergebnisse

Dieses Protokoll optimiert effizient naiv anmutenden Rückfall mit LIF-3i in beiden Feeder-abhängige und Feeder-unabhängige Linie grundiert konventionellen hPSC Kulturen (Abbildung 1). Das ausführliche Protokoll beschriebenen Umrisse fortlaufende Anpassung an LIF-3i entweder Feeder-abhängige oder Feeder-freien konventionellen hPSC Bedingungen (z. B. E8 Mittel) ab.

Vertreter ergibt sich für d.......

Diskussion

Das LIF-3i-System wendet eine modifizierte Version des klassischen murinen 2i naiv Rückfall cocktail¹ auf menschlicher pluripotenter Stammzellen. Die Selbsterneuerung der hPSC (die in 2i allein erweitern kann) wird in LIF-2i durch Ergänzung dieser Cocktail mit dem Tankyrase-Inhibitor XAV939 stabilisiert. LIF-3i Kultur ermöglicht Bulk und effiziente Umkehrung der konventionellen hPSC in einen pluripotenten Zustand ähnlich der menschlichen Präimplantations Epiblast-

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated	BD Biosciences	561716	use 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibody	Sigma Aldrich	HPA029708	use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibody	Abcam	ab6276	use at 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated	BD Biosciences	550315	use 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugated	eBioscience	17-0319-42	use 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kit	Miltenyi Biotec	130-091-935
anti-NANOG antibody	Abcam	ab109250	use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibody	Sigma Aldrich	HPA005455	use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody	Cell Signaling	4695	use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody	Cell Signaling	4370	use at 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody	Cell Signaling	9145	use at 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated	Agilent	E0432	use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated	R&D System	FAB1435A	use 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated	R&D System	NLLC1435G	use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibody	Cell Signaling	9139	use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-STELLA/DPPA3 antibody	Millipore	MAB4388	use at a 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated	R&D System	NLLC4770R	use at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated	Stemgent	09-0068	use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated	Stemgent	09-0069	use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated	BD Biosciences	560193	use 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated	BD Biosciences	560161	use 10µL per assay (FACS)
APEL2-Li	StemCell Technologies	5271
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A3311
CellAdhere dilution buffer	StemCell Technologies	7183	dilutent for Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouse	Charles river	023
CHIR99021	R&D System	L5283	reconstitute at 100mM in DMSO
confocal microscope system	Zeiss	LSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC line	Thermo Fisher Scientific	A18945	also referred as 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates	Corning	3506
Countess  cell counting chamber slide	Thermo Fisher Scientific	C10228
Countess automated cell counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Thermo Fisher Scientific	11995-065
DMEM-F12	Thermo Fisher Scientific	11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	D2650
DR4 mouse	The Jackson Laboratory	3208
Essential 8 (E8) medium	StemCell Technologies	5940
Fetal bovin serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30071.03
Forskolin	Stemgent	04-0025	reconstitute at 100mM in DMSO
Gelatin (porcine)	Sigma Aldrich	G1890-100G	resuspend in water and sterilize with an autoclave
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828-028
L-Glutamine (100X)	Thermo Fisher Scientific	25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140-050
mTeSR1 medium	StemCell Technologies	85850
Nalgene cryogenic vials	Thermo Fisher Scientific	5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System	Fisher Scientific	154534
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% in PBS	USB Corporation	19943
PD0325901	Sigma Aldrich	PZ0162	reconstitute at 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Phosphate buffered saline (PBS)	Biological Industries	02-023-1A
Purmorphamine	Stemgent	04-0009	reconstitute at 10mM in DMSO
recombinant human Activin A	Peprotech	AF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4	Peprotech	120-05ET	resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human FGF-basic (bFGF)	Peprotech	1