Methodenartikel

Chemischen Rückfall von herkömmlichen menschlichen pluripotenten Stammzellen in eine naiv-artigen Zustand mit verbesserten Multilineage Differenzierung Potenz

DOI:

10.3791/57921

⸱

10. Juni 2018

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für die effiziente, Bulk und schnelle chemische Rückfall von konventionellen Linie grundiert menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSC) in einen Epigenomically-Stall naiv Präimplantations Epiblast-ähnliche pluripotenten Zustand. Diese Methode ergibt verringerte Abstammung grundiert Genexpression und deutliche Verbesserung der gerichteten multilineage Differenzierung über ein breites Repertoire von konventionellen hPSC Linien.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naive menschliche pluripotenten Stammzellen (N-hPSC) mit verbesserter Funktionalität möglicherweise einen großen Einfluss in der regenerativen Medizin. Das Ziel dieses Protokolls ist effizient Abstammung grundiert, konventionellen menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSC) gepflegt Feeder-frei oder Feeder-abhängige Bedingungen ein naiv anmutenden Pluripotenz mit verbesserter Funktionalität wiederherzustellen. Diese chemischen naiv Rückfall-Methode setzt den klassischen Leukämie hemmenden Faktor (LIF), GSK3β, MEK/ERK Hemmung und cocktail (LIF-2i), ergänzt mit nur einem Tankyrase Inhibitor XAV939 (LIF-3i). LIF-3i wird konventionelle hPSC einen stabilen pluripotenten Zustand Annahme biochemische, transkriptionelle und epigenetischen Merkmale des Menschen vor der Implantation Epiblast zurückgesetzt. Diese LIF-3i-Methode erfordert minimale Zelle Kultur Manipulation und ist in ein breites Repertoire an humanen embryonalen Stammzellen (hESC) und Transgen-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSC) Linien sehr reproduzierbar. Die LIF-3i-Methode erfordert keinen erneut grundieren Schritt vor der Differenzierung; N-hPSC unterscheiden sich direkt mit sehr hohen Wirkungsgraden und pflegen karyotypic und epigenomischen Stabilitäten (unter Einschluss der aufgedruckten Loci). Um die Universalität der Methode zu erhöhen, werden die konventionellen hPSC zuerst in der LIF-3i-Cocktail, ergänzt durch zwei zusätzliche kleine Moleküle, die Proteinkinase (Forskolin) und sonic Hedgehog (sHH) (Purmorphamine) Signalisierung (LIF-5i) potenzieren kultiviert. Dieser kurze LIF-5i Anpassung Schritt deutlich verbessert die erste klonale Expansion der konventionellen hPSC und ihnen erlaubt, anschließend naiv-zurückversetzt mit LIF-3i allein in Großmengen, damit die Notwendigkeit einer Kommissionierung/subcloning seltene N-hPSC vermieden werden später Kolonien. LIF-5i-stabilisierten hPSCs anschließend in LIF-3i allein ohne die Notwendigkeit von Anti-apoptotische Molekülen bestehen. Am wichtigsten ist, verbessert LIF-3i Rückfall deutlich die funktionelle Pluripotenz ein breites Repertoire von konventionellen hPSC durch Verringerung ihrer Abstammung grundiert Genexpression und löschen die Interline-Variabilität der gerichteten Differenzierung häufig unter den unabhängigen hPSC Linien beobachtet. Repräsentative Charakterisierungen von LIF-3i-zurückversetzt N-hPSC sind vorgesehen ist, und experimentelle Strategien für funktionale Vergleiche der isogenen hPSC in Linie grundiert Vs. naiv-ähnliche Zustände werden beschrieben.

Einleitung

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Das Kultursystem 2i (MEK/ERK und GSK3β-Hemmer) wurde ursprünglich entwickelt, um heterogene Serum-Maus embryonale Stammzellen (mESC) Kulturen in eine einheitliche Grundzustand der Pluripotenz verwandt mit der Maus Präimplantations Epiblast1zu verfeinern. 2i unterstützt jedoch nicht die stabile Erhaltung der menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSC) Linien2. Die verschiedenen komplexe niedermolekularer Wachstumsfaktor ergänzt, und transgene Ansätze vor kurzem berichtet wurde, vermeintlich erfassen ähnlich menschlichen naiv anmutenden pluripotenten Molekulare heißt es2. Jedoch viele der "naiv-Like" Staaten schuf mit diesen Methoden auch ausgestellt karyotypic Instabilität, epigenomischen Mängel (z. B. globale Verlust der elterlichen genomische Prägung) oder Differenzierungspotenzial beeinträchtigt.

In Kontrast, des Cocktails der dreifache chemische Hemmung der GSK3β, ERK und Tankyrase Signalisierung und Leukämie hemmenden Faktor (LIF-3i) war ausreichend für die stabile naiv anmutenden Umkehr ein breites Repertoire von konventionellen hPSC Linien3. LIF-3i-zurückversetzt naiv hPSC (N-hPSC) gepflegt normalen Karyotyp und erhöht ihre Ausdrücke der naiv-spezifische menschliche Präimplantations Epiblast-Gene (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i Rückfall auch übertragenen hPSC mit einer Reihe von molekularen und biochemischen Eigenschaften einzigartig für mESC-wie naiv Pluripotenz, die enthalten erhöhte phosphorylierten STAT3 Signaltechnik, verringerte ERK Phosphorylierung, global 5 Methylcytosine CpG Hypomethylierung, genomweite CpG Demethylierung an embryonalen Stammzellen (ESC)-spezifisches Gen Promotoren und dominanten distal OCT4 Enhancer Verwendung. Darüber hinaus im Vergleich zu anderen naiv Rückfall-Methoden, die akzessorisch hypomethyliert führten eingeprägt genomic Loci, LIF-3i-zurückversetzt N-hPSC waren frei von systematischen aufgedruckten CpG Muster oder Verlust der DNA Methyltransferase Ausdruck (z.B. DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.

Eine direkte LIF-3i-Kultur einer breiten Palette von konventionellen humanen embryonalen Stammzellen (hESC) und menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSC) auf Feeder oder E8 Feeder-freien Bedingungen angebaut erzielt schnelle und Schüttgut eine Rückkehr zu einem naiven Epiblast-ähnlichen Zustand. Direkten LIF-3i naiv Rückfall kann jedoch ineffizient in einigen Sparten instabil konventionellen hPSC aufgrund der inhärenten genomic und Abstammung grundiert Variabilitäten aus dem Spender genetisch vielfältigen Hintergründe sein.

So, um das Dienstprogramm der LIF-3i-Methode zu erweitern, eine schrittweise Optimierung wurde entwickelt und wird hier präsentiert ermöglicht universelle naiv Rückfall mit fast jedem herkömmlichen hESC oder Transgen-freie HiPSC Linie auf Feeder kultiviert. Diese universalisierte naiv Rückfall Methode setzt einen transiente anfängliche Kultur Schritt in konventionellen hPSC, die die LIF-3i-Cocktail mit zwei zusätzlichen kleinen Molekülen (LIF-5i) ergänzt, die Proteinkinase (Forskolin) und sonic Hedgehog (sHH) (potenzieren Purmorphamine) signalisiert. Eine erste Passage der konventionellen hPSC in LIF-5i passt sie an nachfolgende stabile LIF-3i Rückfall in Großmengen. Anfängliche LIF-5i Anpassung steigert deutlich die ersten Einzeller klonalen Proliferation von konventionellen hPSC auf E8 oder Feeder (vor ihren späteren stabilen, kontinuierlichen Übergang in LIF-3i allein) angebaut. Konventionelle hPSC Linien angepasst tolerieren zunächst auf eine Passage in LIF-5i nachfolgende Masse klonalen passagierung naiv-zurückversetzt Zellen in LIF-3i Bedingungen, die entfällt die Notwendigkeit für die Kommissionierung und subcloning von den seltenen stabile Kolonien oder den routinemäßigen Einsatz von Anti-apoptotische Moleküle oder Rho-assoziierten Protein Kinase (ROCK)-Inhibitoren.

Die LIF-3i-Methode erfolgreich eingesetzte stabil ausbauen und pflegen ein breites Repertoire von > 30 unabhängige, genetisch vielfältigen konventionellen hPSC Zeilen für > 10 – 30 Passagen mit beiden Methoden nicht-enzymatische oder enzymatischen Dissoziation und ohne Nachweis der Induktion von chromosomalen oder epigenomischen Abweichungen, einschließlich Anomalien am aufgedruckten gen-Loci. Darüber hinaus sequentielle LIF-5i/LIF-3i-Kultur ist die einzige naiv Rückfall Methode, die bisher berichtet wurde, die die funktionale Pluripotenz ein breites Repertoire von konventionellen hPSC Linien verbessert durch eine Verringerung ihrer Abstammung grundiert Genexpression und dramatisch verbessern ihre multipotenten Differenzierung Potenz. Die LIF-3i naiv Rückfall Methode löscht die inhärente interline-Variabilität der Differenzierung der Linie grundiert, konventionelle hPSC Linien und haben einen großen Nutzen der Anwendung in der regenerativen Medizin und zelluläre Therapien.

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Protokoll

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Alle tierische Verfahren wurden nach Tierbetreuung Leitlinien und Protokolle von der Johns Hopkins Schule von Medizin Institut der Tierpflege und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt durchgeführt.

1. Vorbereitung der Maus embryonalen Fibroblasten (MEF) für Feeder-abhängige konventionelle (hESC Medium/MEF) oder naiv-zurückversetzt (LIF-3i Medium/MEF) hPSC Kultur

  1. Kaufen oder Inhouse Low-Passage Lieferungen von MEF Feeder von CF1 oder CF1 x DR4 Hybrid E13.5 mausembryonen nach veröffentlichten Protokolle4vorbereiten.
    1. Tiefgefrieren niedrigen Durchgang (p1-p2) MEF Kulturen vor (für langfristige Lagerung) oder (für bis zu 6 Monate) nach Bestrahlung und Store in flüssigem Stickstoff wie oben beschrieben4.
    2. Bestrahlen (5.000 rad) bulk erweiterte MEF unter p5 mit einem γ - oder X-ray-Brutapparat und Aliquote 1,5 x 106 Zellen pro Fläschchen für kurzfristige Lagerung (weniger als 6 Monate) bei-80 ° C in eine extrem niedrige Temperatur Gefrierschrank vorbereiten.
    3. Platte zwischen 1,2 x 106 (frisch bestrahlt nicht konserviert) und 1,5 x 106 (bestrahlt kryokonserviert) MEF pro ein verkleisterte 6-Well-Platte für die Zubereitung von Feeder Kulturen, wie unten beschrieben.
  2. Bereiten Sie Gelatine beschichtet 6-Well sterile Gewebekultur imprägnierte Platten durch Zugabe von 1,5 mL sterile 0,1 % Gelatine-Lösung in jede Vertiefung in einem biologischen Sicherheitsschrank.
  3. Inkubieren Sie Gelatine beschichtete Platten bei 37 ° C für mindestens 1 Stunde oder über Nacht in einem Labor CO2 Inkubator.
  4. Am nächsten Tag Auftauen niedrigen Durchgang (z. B. P2, P4) DMSO kryokonserviert und bestrahlten (5.000 rad) MEF entsprechend den Schritten unten angegeben.
    Hinweis: Nicht bestrahlten MEF sollte auch werden aufgetaut, erweitert und unmittelbar vor Gebrauch bestrahlt.
  5. Legen Sie eine kryokonservierten MEF aliquoten im Wasserbad 37 ° C. Sterilisieren Sie beim Auftauen das Rohr mit Ethanol zu und sofort verdünnen Sie die DMSO kryoprotektivum mindestens 10-divisibel mit MEF Mittel (Tabelle 1) innerhalb eines Biosafety Kabinett (z.B. Transfer 1 mL DMSO-MEF aliquoten in 9 mL MEF Medium in einer sterilen 15 mL (konisch).
  6. Zentrifugieren Sie die verdünnten MEF-Zellen bei 200 X g für 5 min in sterilen 15 mL konische Röhrchen.
  7. In ein Kabinett Biosafety Aspirieren und zellfreie überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 – 2 mL frisches MEF Medium.
  8. Sanft verwerfen Sie die Gelatinelösung zu und 2 mL MEF Re MEF Mittel-und in jede Vertiefung eine verkleisterte 6-Well-Platte ausgesetzt wie oben angegeben. Graf MEF Zellen und Platte 1,2 x 106 (frisch bestrahlt nicht kryokonserviert) oder 1,5 x 106 (bestrahlt kryokonserviert) MEF pro ein verkleisterte 6-Well-Platte.
    Hinweis: Alle Zellplatten Kultur, die die Biosicherheit Kabinett aus dem CO2 Inkubator übertragen werden können mit Ethanol besprüht Papier vorsichtig abgewischt werden aber sollte nicht direkt auf gesprüht mit 70 % Ethanol Ethanol Verbreitung in den Vertiefungen zu vermeiden.
  9. Inkubieren Sie MEF Platten bei 37 ° C über Nacht in einem Labor CO2 Inkubator (5 % CO2, feuchter Atmosphäre) um die Anlage, vor der Verwendung ermöglichen.

2. Stabilisierung des konventionellen hPSC Kulturen für nachfolgende naiv Rückfall mit einem kurzen LIF-5i Anpassung Schritt bulk

  1. Überprüfen Sie alle herkömmlichen hPSC Linien für einen normalen Karyotyp von G-banding, vor Beginn LIF-5i/LIF-3i Rückfall zu besitzen.
    Hinweis: LIF-3i Rückfall des hoch-Passage konventionellen hPSC Linien (zB., P > 40 – 50) sollte vermieden werden, da diese Kulturen bereits genomische Aberrationen, die stabil, effizient und Bulk LIF-3i Umkehrung negativ können grundiert beherbergen können, Convetional hPSC Linien.
  2. Pflegen Sie und erweitern Sie herkömmliche hPSC Kulturen mit validierten normalen Karyotyp eine MEF-basierte Kultursystem (wie in Abschnitt 1 beschrieben) oder ein Feeder-freie Kultursystem (nach Wahl der Prüfer).
    Hinweis: Beide Feeder-abhängige hPSC/MEF Kokulturen (z. B. hESC Medium (Tabelle 1) ergänzt mit 4 – 10 ng/mL bFGF) oder Feeder-freie (zB., E8 5 oder mTSER 6 Medien (nach Angaben des Herstellers auf Vitronectin-beschichtete Platten) Methoden sind kompatibel mit Masse naiv Rückfall mit dem LIF-5i/LIF-3i/MEF-System (Abbildung 1). Nicht-enzymatische Methoden werden bevorzugt passagierung der konventionellen hPSC vor bereitet sie für die Umkehr. LIF-5i und LIF-3i Medien Formulierungen enthalten keine Antibiotika oder Antimykotika. Normalbetrieb Regeln für die biologische Sicherheit Kabinett Sterilität und Wartung sollen konsequent eingehalten werden, um eine bakterielle oder Pilzinfektionen Kontamination zu vermeiden.
  3. Die MEF-basierte Kultursystem Vorbereitung MEF Feeder in die verkleisterte 6-Well-Platte wie in Abschnitt 1 beschrieben mindestens einen Tag vor passagierung LIF-5i-angepasste konventionelle hPSC Kulturen.
  4. Nach konventionellen hPSC Kulturen ~ 50 % Konfluenz (d. h. 3 – 5 Tage nach der ersten Beschichtung) erreicht haben, ersetzen Sie das standard hESC Kulturmedium mit LIF-5i Medium (2 mL pro Bohrloch; ( Tabelle 1).
    Hinweis: Führen Sie diese Schritte in eine biologische Kabinett.
  5. Kultur und konventionellen hPSC/MEF für bis zu 2 Tage in LIF-5i im CO2 Inkubator (5 % CO2, feuchter Atmosphäre) zu erhalten. Verändern Sie das LIF-5i Medium täglich, um sie für ihre anschließende Verabschiedung und stabile Rückfall in LIF-3i anzupassen.
  6. Alternativ für die Feeder-freien konventionellen Kulturen (z. B.in E8), Kultur hPSC in LIF-5i nur Übernachtung vor passagierung am nächsten Morgen.
    Hinweis: LIF-5i und LIF-3i Kulturen können sowohl mit atmosphärischen (21 % O2) oder physiologische (5 % O2) Sauerstoff Niveaus in den CO-2 -Inkubator (5 % CO2, feuchter Atmosphäre) gepflegt werden.
  7. Platzieren Sie vor passagierung die Kultur-Platten in einem Biosafety-Schrank, waschen Sie LIF-5i-angepasste konventionelle hPSC einmal mit PBS und fügen Sie 1 mL der Zelle Dissoziation Reagenz in jede Vertiefung. 5 min bei 37 ° C in einem CO2 Inkubator inkubieren und sanft mit einer Pipette in eine einzelne Zelle Suspension zurück in die Biosicherheit Kabinett genannte.
    Hinweis: Nicht-enzymatische Dissoziation Puffer können alternativ zur Vorbereitung, dass einzelner Zellen passagierung verwendet werden.
  8. Die Zellsuspension in hESC Medium (mindestens 2-fold Verdünnung) in eine sterile 15 mL konische Röhrchen zu sammeln, und sanft genannte Zellen durch pipettieren, um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten.
  9. 300 X g für 5 min zentrifugieren Absaugen/entsorgen des Überstands und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 – 2 mL des Mediums LIF-5i im Kabinett der Biosicherheit. Zählen Sie die Zellen mit einer Hemocytometer oder eine automatische Zelle Zähler.
  10. Waschen vor vergoldete MEF-Platte zweimal mit PBS (2 mL pro Bohrloch in 6-Well Platten) und 1 – 2 x 106 Zellen (in 2 mL LIF-5i Mittel) auf 1 auch der PBS gewaschen MEF Platte verteilen.
  11. Anpassung und Optimierung der ersten Beschichtung dichten für jede einzelne hPSC Linie zu naiv-zurückversetzt, wie replating Effizienz sehr variabel sein kann. Legen Sie die Platte in eine CO2 -Inkubator (5 % CO2, feuchter Atmosphäre).
    Hinweis: Die routinemäßige Verwendung von Anti-apoptotische Reagenzien ist für die meisten hPSC Linien mit dieser Methode nicht empfohlen. Das LIF-5i-System erhöht bereits erste Masse klonalen neu Galvanik Wirkungsgrade von konventionellen hPSC Linien. Jedoch eine einmalige Verwendung von ROCK-Inhibitor (5 – 10 μM Y-27632) kann weiter zu verbessern die anfängliche LIF-5i klonale neu Galvanik Effizienz der konventionellen hPSC Kulturen in der ersten Passage für einige instabile Abstammung grundiert hPSC Linien mit der Neigung zu spontanen Differenzierung.
  12. Wenn ausgehend von Feeder-freie Kulturen (z.B., E8), direkt einen Brunnen der dissoziierten konventionellen hPSC angepasst in LIF-5i in übertragen bestrahlt man MEF-plated gut (d.h. 1:1 Durchgang).
  13. Am nächsten Tag sanft Schwenken die Platte zu heben alle fraktionslosen Zellen, Aspirieren Sie das Medium (PBS waschen ist optional) und ersetzen Sie mit 2 mL LIF-5i Medium. Führen Sie diesen Schritt in eine biologische Kabinett täglich für 3 bis 5 Tage oder bis die Zellen sind 60 – 70 % Zusammenfluss (Abbildung 1). Legen Sie die Platte in eine CO2 -Inkubator (5 % CO2, feuchter Atmosphäre).

3. langfristige Pflege und Ausbau der N-hPSC in LIF-3i Medium

  1. Nach anfänglichen LIF-5i Anpassung Durchgang nachfolgende stabile LIF-3i Kulturen alle 3 – 4 Tage in eine biologische Kabinett oder wenn Kulturen werden 60 – 70 % Zusammenfluss (Abbildung 1).
    Hinweis: LIF-3i Kulturen erfordern konsequente Wartung und damit N-hPSC Kulturen, hohe Konfluenz/Zelldichte von längeren Kultur zu erreichen (zB., > 4 Tage) verringert sich anschließenden klonalen neu Galvanik Effizienz und fördert die spontane Differenzierung.
  2. In eine biologische Kabinett, das Kulturmedium zu verwerfen und waschen jeweils gut von LIF-5i/LIF-3i Kulturen durch sanft Zugabe von 2 mL PBS. Verwerfen Sie PBS zu, und fügen Sie 1 mL der Zelle Ablösung Lösung. 5 min bei 37 ° C in einem CO-2 -Inkubator (5 % CO2, feuchter Atmosphäre) inkubieren.
  3. Sammeln Sie die Zellsuspension, hESC Medium hinzufügen (ohne Inhibitoren oder Wachstumsfaktoren (Tabelle 1); mindestens 2-fold Verdünnung) wiederherstellen alle hPSC und sanft genannte Zellen durch pipettieren, um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten. Übertragen Sie die Aussetzung auf eine sterile 15 mL konische Rohr.
  4. 300 g für 5 min zentrifugieren Sie und Absaugen/entsorgen des Überstands. Wieder aussetzen der Zelle Pellet in LIF-3i Medium. Zählen Sie die Zellen mit einer Hemocytometer oder eine automatische Zelle Zähler.
  5. Platte ~ 2 x 105 Zellen pro Bohrloch auf der bestrahlten MEF in die verkleisterte 6-Well-Platte für routinemäßige passagierung LIF-3i Kulturen. Für die ersten LIF-5i-angepasst Kulturen Platte eine anfänglich höhere Dichte (4 x 105 Zellen/na) vor der ersten Durchfahrt in LIF-3i/MEF.
  6. Neu Platte und LIF-5i-angepasst hPSC auf frische PBS gewaschen bestrahlten MEF Feeder Teller (wie oben beschrieben am Vortag vorbereitet) in das LIF-3i-Medium zu verteilen. Ersetzen Sie täglich das LIF-3i-Medium.
  7. Durchgang N-hPSC für wenigsten Passagen 4 – 7 kontinuierliche Massen in die mittlere vor der LIF-3i in funktionelle Studien oder Kryokonservierung von N-hPSC verwenden. Notieren Sie die Anzahl der Passagen des N-hPSC entweder konventionell oder LIF-3i Medien.
    Hinweis: LIF-3i Rückfall der hoch-Passage (z. B. > p40) Linie grundiert, konventionelle hPSC Linien wird nicht empfohlen. Sollte versucht werden konventionelle hPSC Linien an der niedrigsten Stelle zurückkehren, dass sie verfügbar sind. Darüber hinaus empfiehlt sich die Verwendung von LIF-3i-zurückversetzt hPSC, die größer als 10 LIF-3i Passagen unterzogen wurden nicht für funktionelle Studien, da so N hPSC Kulturen karyotypisch abnorme Klone aufgrund längerer klonalen Zellenauswahl Kultur beherbergen können. Frische LIF-5i/LIF-3i Kellergalerie Low-Passage konventionellen hPSC Linien für funktionelle Studien durchgeführt werden sollten, wenn Vorräte an N-hPSC mit < 10 Passagen in LIF-3i stehen nicht zur Verfügung.

4. Kryokonservierung und Auftauen des LIF-3i-zurückversetzt N-hPSC

  1. Erweitern Sie wiederhergestellte N-hPSC für mindestens 5-7 Passagen in LIF-3i, wie oben erwähnt, vor der Verwendung in funktionelle Studien oder langfristige Kryokonservierung. Notieren Sie die Anzahl der Durchgänge unter herkömmlichen Bedingungen und in LIF-3i Bedingungen auf jeder kryokonservierten Fläschchen.
    Bemerkung: Überschuss LIF-3i-zurückversetzt N-hPSC nicht in funktionelle Assays verwendet kann kryokonservierten bei jedem Durchgang, aber eiskalten unteren Post-Rückfall Passagen (z.B.., < p3) kann Armen oder sehr variabel nach dem Tauwetter Erholung Effizienz führen.
  2. In ein Kabinett Biosafety Aspirieren das Kulturmedium, Waschen mit PBS-Puffer (2 mL pro Well) Zellen, Aspirieren PBS und distanzieren hPSC Kolonien in Einzelzellen mit Zelle Ablösung Lösung (1 mL pro Well). Legen Sie die Platte für 5 min bei 37 ° C in einem CO-2 -Inkubator (5 % CO2, feuchter Atmosphäre). Verdünnen Sie die Zelle Ablösung Lösung mit dem LIF-3i-Medium (2-fach), sammeln hPSC in einem sterilen 15 mL konisch, Zellen bei 200 X g für 5 min zentrifugieren und Aufschwemmen der Zelle Pellet in LIF-3i Medium (1 – 2 mL pro Brunnen-Äquivalent). Die Anzahl der Zellen mit einer Hemocytometer oder eine automatische Zelle Zähler.
  3. Zentrifugieren Sie N-hPSC im LIF-3i Medium (200 X g für 5 min) und Aufschwemmen Sie Zellen in einem Biosafety-Schrank in die eiskalte Lösung (Tabelle 2), bei einer Dichte von mindestens 1 x 106 Zellen/mL.
  4. Zellen in die langfristige Lagerung Kryo Röhrchen und in einen Behälter langsam-einfrieren. Lassen Sie die Proben in einem-80 ° C Gefrierschrank über Nacht einfrieren.
  5. Übertragen Sie am nächsten Tag, die Cryovials in flüssigem Stickstoff Gefrierschrank für langfristige Lagerung.
  6. Zum Auftauen, platzieren Sie das gefrorene Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad für ~ 2 min. entkeimen das Fläschchen (z. B. Ethanol Spray), übertragen Sie hPSC in einem sterilen 15 mL konische und verdünnen Sie langsam die Zellen 10-divisibel in hESC Medium (Tabelle 1) ergänzt mit 5 μM von Rho-assoziierten Protein Kinase (ROCK)-Inhibitor Y-27632 in eine sterile biologische Schutzhaube Kabinett.
  7. Zentrifuge bei 200 X g für 5 Minuten. In ein Kabinett Biosafety zellfreie überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in LIF-3i Medium (1 – 2 mL) mit 5 μM ROCK Inhibitor Y-27632 ergänzt.
    Hinweis: Ausschluss des Y-27632 führt zu schlechter nach dem Auftauen Erholung Effizienz (Abbildung 2).
  8. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen in LIF-3i/ROCK-Hemmer auf die PBS gewaschen MEF-plated Brunnen Nukleinsäuretablette. Tiefgefrieren Sie LIF-3i Kulturen bei einer Dichte von 1 x 106 Zellen pro Fläschchen. Tauen Sie diese Fläschchen auf Anleger in einem Brunnen der gelatinierte 6-Well-Platte.
  9. Starten Sie am nächsten Tag regelmäßige LIF-3i mittlerer Ausdehnung ohne Rho-Kinase-Inhibitor.

(5) Feeder Entfernung zur Erfassung von N-hPSC Proben

  1. Proben von LIF-3i/MEF (oder hESC/MEF konventionelle) Kulturen vorzubereiten (d. h.für die Genexpression (z. B. quantitative RT-PCR, Microarrays) oder Eiweiß (z.B. Western-Blot) Analysen zum Abbau LIF-3i Kulturen aus den MEF-Stationen mit Magnetische aktiviert Zelle Sortieren (MACS) mit Anti-TRA-1-81 Antikörper beschichtet Microbeads laut Protokoll des Herstellers.
  2. Alternativ nutzen Sie die folgende einfache Pre-Beschichtung-Methode um Kulturen der Feeder, zum Abbau, wie unten beschrieben.
  3. In eine sterile biologische Schutzhaube Kabinett zellfreie überstand verwerfen Sie, waschen Sie das Pellet mit steril 2 mL PBS pro Bohrloch. Lösen Sie anhaftende LIF-3i/MEF-Kulturen mit Zelle Ablösung Lösung (1 mL/na). Inkubieren Sie für 5 min in eine CO2 -Inkubator (5 % CO2, feuchter Atmosphäre). HPSC in einem sterilen 15 mL konisch zu sammeln. Waschen 2-fold in hESC Medium, Transfer-Zellen in die sterile 15 mL konische und Zentrifuge bei 200 X g für 5 Minuten.
  4. In ein Kabinett Biosafety erneut suspendieren jedes gut von den Zellen der LIF-3i/MEF getrennt in 2 mL des Mediums LIF-3i und direkt übertragen auf einen neuen Brunnen von einem 6-Well-Platte, die frisch mit 0,1 % Gelatine überzogen wurde.
  5. LIF-3i/MEF hPSC Zellen für 1 h bei 37 ° C in einem CO-2 -Inkubator (5 % CO2, feuchter Atmosphäre) inkubieren. Nicht-anhaftende Zellen mit einer Pipette in eine neue konische Rohr zu sammeln. Sanft fügen Sie 2 mL hESC Medium in jede Vertiefung und Schwenken Sie, um die verbleibenden nicht-anhaftende Zellen zu sammeln.
    Hinweis: Der Großteil der bestrahlten MEF wird die verkleisterte Platte in 1 h beimessen verlassen die meisten der hPSC in der Schwebe.
  6. Kombinieren Sie und Zentrifugieren Sie Zellen bei 300 X g für 5 min Waschen in PBS. Snap-Freeze Zelle Pellet in flüssigem Stickstoff nach Zentrifugation oder alternativ wieder auszusetzen Sie Pellets in einem lysiereinrichtung Puffer, der mit der nachgeschalteten Protein oder Nukleinsäure-Analyse (Abbildung 2B) kompatibel ist.
  7. Durchführen Sie Charakterisierungen von LIF-3i hPSC Linien mit einem passenden konventionellen grundiert isogenen hPSC Kontrolle.
    Hinweis: Aufgrund intrinsischer Variabilität zwischen und innerhalb der grundiert Kulturen, relevanten Steuerelemente an eine passende Timepoint in Kultur oder vor dem naiven Rückfall vorbereitet werden. Detaillierte Protokolle und Materialien für nachgeschaltete immunofluorescent Bioimaging, flow Cytometry, Western blotting, Genexpression (RT-PCR-Assays und Microarrays), Methylierung Studien (Dot-Blot, CpG Methylierung Microarray), OCT4 proximalen und distalen enhancer Dominanz-Reporter-Assays und Signalisierung Inhibitor-Assays sind an anderer Stelle3vorgesehen.

6. post naiv Reversion: Validierung von Genomic Integrität und Aufbewahrung der elterliche Abdrücke von LIF-3i-zurückversetzt N-hPSC vor dem Einsatz im funktionellen Assays

  1. Bildschirm der Ausgangspunkt grundiert, konventionelle hPSC Kulturen für den Besitz von einen normalen Karyotyp (z. B.mit Giemsa-Band befleckenden Analyse mit veröffentlichten Methoden 7) vor der Einleitung von LIF-5i/LIF-3i Rückfall.
    Hinweis: Dies ist herkömmlichen hPSC Populationen zu beseitigen, die abnorme genomische Veränderungen hegen kann die artifizielle selektive Überlebensvorteil in klonalen LIF-3i Bedingungen fahren können.
  2. Für ein optimales Ergebnis frisch wiederherstellen konventionellen hPSC Kulturen, eine naiv-artigen Zustand mit LIF-3i mehrere Wochen vor ihrer Verwendung in funktionelle Studien oder Differenzierung gerichtet.
    Hinweis: Routine verlängert "Instandhaltung" Kultur in LIF-3i Bedingungen für mehr als 10 stellen folgende naive Rückfall ist nicht empfehlenswert. Routinemäßige Ausbau und die Erhaltung der hESC und HiPSC Linien durchgeführt werden mit herkömmlichen Kultur-Systemen (z. B. in E8 oder MEF/hESC mittlere mit bFGF).
  3. Nach dem wiederhergestellte N-hPSC Linien zu bewerten, für die Beibehaltung des normalen 5 – 7 Passagen nach LIF-3i Rückfall karyotypes (zB., mit Giemsa-Band befleckenden Analyse7, oder jede andere Methode der Wahl).
  4. Bewerten Sie alle wiederhergestellte N-hPSC Linien für die Aufbewahrung von normalen elterlichen genomische Abdrücke durch eine DNA-Methylierung Analyse der Wahl (z. B.Protokolle für CpG-DNA Microarray Analyse der elterlichen Prägungen in LIF-3i-zurückversetzt N-hPSC angeboten anderswo3 ) nach 5 – 10 Passagen des LIF-3i Rückfall.

7. Post naiv Reversion: Experimentelle Design-Richtlinien für Quantitative gerichtete Differenzierung Assays mit LIF-3i-zurückversetzt N-hPSC

  1. Nutzen Sie direkt LIF-3i N-hPSC in etablierten gerichtete Differenzierung Protokolle ohne zusätzliche Zelle Kultur Manipulationen.
    Hinweis: Erneut grundieren (z. B. Umwandlung von N-hPSC zurück zu herkömmlichen grundiert Voraussetzungen vor ihrer Verwendung in gezielten Differenzierung Assays) ist nicht notwendig mit der LIF-3i-Methode und wird nicht empfohlen.
  2. Kontrolle für die Auswirkungen des Assays und interline-Variabilität in der Funktionsprüfung der einzelnen hPSC Linien, Kreuz-Validierung der Geschlecht-spezifische Differenzierung Potenzen durch den Einsatz von unabhängigen Differenzierung Protokolle mit mindestens drei hPSC Linien von unabhängigen genetische Hintergründe abgeleitet (d. h. mehrere Spender abgeleitet HiPSC und hESC).
  3. Für funktionale Vergleiche Geschwister, bei gleichwertigen Passagenanzahl und aus der gleichen (isogenen) hPSC Linie parallel zu den üblichen Linie grundiert und LIF-3i-zurückversetzt hPSC Kulturen eingerichtet. Grundiert/naiv Geschwister isogenen hPSC Kulturen in ihren jeweiligen Medien zu erhalten (zB., E8 Vs. LIF-3i), und gleichzeitig differenzieren mit identischen Differenzierung Protokolle und Materialien, um jede experimentelle Bias (Abbildung 4) zu beseitigen.
  4. Für vs. naiv hPSC Vergleiche isogenen grundiert, Anpassung und Optimierung erste Beschichtung dichten für jedes individuelle Differenzierung-Assay.
    Hinweis: Ausführliche Protokolle für neurale Vorläuferzellen, definitive Entoderm und hämato-endothelialen gerichtete Differenzierung der LIF-3i-zurückversetzt N-hPSC sind an anderer Stelle 3vorgesehen. LIF-3i-zurückversetzt N-hPSC haben robuster proliferative und Differenzierung Kapazität in die gezielte Differenzierung Assays als konventionelle hPSC. N-hPSC erfordert in der Regel eine geringere Konzentration der ursprünglichen Beschichtung als die herkömmlichen hPSC, und im Gegensatz zu ihren herkömmlichen grundiert hPSC Gegenstücke, erfordern nicht die Verwendung von Anti-apoptotische Reagenzien zur Verbesserung ihrer klonalen Überlebens nach enzymatischer Verdauung in Differenzierung Assays.

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Ergebnisse

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Dieses Protokoll optimiert effizient naiv anmutenden Rückfall mit LIF-3i in beiden Feeder-abhängige und Feeder-unabhängige Linie grundiert konventionellen hPSC Kulturen (Abbildung 1). Das ausführliche Protokoll beschriebenen Umrisse fortlaufende Anpassung an LIF-3i entweder Feeder-abhängige oder Feeder-freien konventionellen hPSC Bedingungen (z. B. E8 Mittel) ab.

Vertreter ergibt sich für d...

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Diskussion

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Das LIF-3i-System wendet eine modifizierte Version des klassischen murinen 2i naiv Rückfall cocktail1 auf menschlicher pluripotenter Stammzellen. Die Selbsterneuerung der hPSC (die in 2i allein erweitern kann) wird in LIF-2i durch Ergänzung dieser Cocktail mit dem Tankyrase-Inhibitor XAV939 stabilisiert. LIF-3i Kultur ermöglicht Bulk und effiziente Umkehrung der konventionellen hPSC in einen pluripotenten Zustand ähnlich der menschlichen Präimplantations Epiblast-

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Offenlegungen

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Unter einem Lizenzvertrag zwischen Life Technologies und der Johns Hopkins University (JHU) hat Dr. Zambidis Anspruch auf einen Anteil des Königtums erhielt von der Universität für die Lizenzierung von Stammzellen. Die Bedingungen dieser Vereinbarung werden von JHU gemäß seinen Interessenkonflikt Richtlinien verwaltet. Dies ändert nichts an Autoren Einhaltung Zeitschrift Richtlinien auf den Austausch von Daten und Materialien.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse vom NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein Innovation Award, The Maryland Stem Cell Research Fund (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk Science Forum Award und die Moseley Foundation unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugatedBD Biosciences561716use 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibodySigma AldrichHPA029708use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibodyAbcamab6276use at 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated BD Biosciences550315use 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugatedeBioscience17-0319-42use 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kitMiltenyi Biotec130-091-935
anti-NANOG antibodyAbcamab109250use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibodySigma AldrichHPA005455use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibodyCell Signaling4695use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibodyCell Signaling4370use at 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibodyCell Signaling9145use at 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylatedAgilentE0432use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated R&D SystemFAB1435Ause 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugatedR&D SystemNLLC1435Guse at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibodyCell Signaling9139use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-STELLA/DPPA3 antibodyMilliporeMAB4388use at a 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated R&D SystemNLLC4770Ruse at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugatedStemgent09-0068use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugatedStemgent09-0069use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugatedBD Biosciences560193use 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugatedBD Biosciences560161use 10µL per assay (FACS)
APEL2-LiStemCell Technologies5271
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA3311
CellAdhere dilution bufferStemCell Technologies7183dilutent for Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouseCharles river023
CHIR99021R&D SystemL5283reconstitute at 100mM in DMSO
confocal microscope systemZeissLSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC lineThermo Fisher ScientificA18945also referred as 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well platesCorning3506
Countess  cell counting chamber slideThermo Fisher ScientificC10228
Countess automated cell counterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific11995-065
DMEM-F12Thermo Fisher Scientific11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide)Sigma AldrichD2650
DR4 mouseThe Jackson Laboratory3208
Essential 8 (E8) mediumStemCell Technologies5940
Fetal bovin serum (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30071.03
ForskolinStemgent04-0025reconstitute at 100mM in DMSO
Gelatin (porcine)Sigma AldrichG1890-100Gresuspend in water and sterilize with an autoclave
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828-028
L-Glutamine (100X)Thermo Fisher Scientific25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
mTeSR1 mediumStemCell Technologies85850
Nalgene cryogenic vialsThermo Fisher Scientific5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide SystemFisher Scientific154534
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% in PBSUSB Corporation 19943
PD0325901Sigma AldrichPZ0162reconstitute at 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
Phosphate buffered saline (PBS)Biological Industries02-023-1A
PurmorphamineStemgent04-0009reconstitute at 10mM in DMSO
recombinant human Activin APeprotechAF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4Peprotech120-05ETresupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human FGF-basic (bFGF)Peprotech1

Referenzen

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Naive pluripotente StammzellenLIF 3i Methodehumane embryonale Stammzelleninduzierte pluripotente StammzellenFeeder freie KulturZellpassageimmunfluoreszierende F rbungWestern Blot AnalyseTeratom Differenzierung

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