Ein Temperaturgradient Assay thermische Präferenzen der Drosophila Larven bestimmen

Thermotaxis wird durch mobile Tiere eingesetzt, um eine Umgebung mit den günstigsten Bedingungen^1,2,3auswählen. Wenn das Klima übermäßig heiß oder kalt, dieses Verhalten ist wichtig für das Überleben ist. Darüber hinaus viele Tiere reagieren empfindlich auf sehr kleine Unterschiede in der Temperatur im Bereich von komfortablen und Umgebung mit einer idealen Temperatur aufsuchen. Dies ist von besonderer Bedeutung für wechselwarme Organismen wie Fruchtfliegen, die ihre Körpertemperatur mit der Umgebung equilibrate. Assays, Larven Thermotaxis überwachen wurden maßgeblich bei der Identifizierung und Klärung der Rolle der molekularen Sensoren wie Drosophila Transienten Rezeptor Potential (TRP) Kanäle^4,5,6, rhodopsine^7,8und Ionotropic Rezeptor-Rezeptoren (IRs)⁹, die diese Tiere mit Temperatur Empfindlichkeiten in verschiedenen Temperaturbereichen zu verleihen.

Ein zwei-Wege-Choice-Test bietet einen Ansatz zur Untersuchung der thermischer Präferenzen in Larven^6,7. Der Test beinhaltet zur Gründung zwei unterschiedliche Temperaturzonen und erlaubt den Tieren, eine Seite über die andere auswählen. Die Ergebnisse von zwei-Wege-Choice-Tests sind robust, vor allem wenn die Temperaturunterschiede zwischen den beiden Optionen groß sind. Darüber hinaus da jedes Assay tabellarisieren nur zwei Gruppen umfasst, können die Daten als einfache Präferenz-Index ausgedrückt werden. Die Leichtigkeit und Einfachheit der zwei-Wege-Wahl-Assays sind auch genetische Bildschirme zugänglich. Eine große Einschränkung ist jedoch, dass viele Experimente erforderlich sind, um die gewünschte Temperatur der Wildtyp oder mutierte Tiere zu etablieren.

Ein gradienter Assay bietet die Möglichkeit, die gewünschte Temperatur in einem einzigen Test⁸aufzunehmen. Darüber hinaus ermöglicht es im Gegensatz zu den zwei-Wege-Choice-Test, die Auswertung der Verteilung der einer Gruppe von Tieren, konfrontiert mit einer kontinuierlichen Reihe von Temperaturen. Ein gradient Assay verwendet eine Petrischale und Einzeltiere und eignet sich gut für die Charakterisierung von detaillierten Verhaltens einzelner Tiere¹⁰. Jedoch da Petrischalen Runde sind, die Größen der Temperaturzonen variieren und sind abhängig von der Entfernung vom Zentrum nach und nach kleiner. Dieses Setup ist daher nicht ideal für die Überwachung der Temperatur-Auswahl der Populationen von Tieren.

Eine kontinuierliche thermischen Gradienten Apparat, der gut geeignet, um die Temperatur-Einstellungen von Gruppen von Larven zu beurteilen ist eine rechteckige Arena beschäftigt und wird hier beschrieben. Das Gerät ist einfach zu konstruieren und montieren. Die Steigung ist linear und ist flexibel, da es verwendet werden kann, inwieweit Thermotaxis über große Temperaturbereiche von 10 ° C bis 42 ° C. Der Test ist schnell und unkompliziert durchzuführen und liefert reproduzierbare Daten. Neben der Berichterstattung der bevorzugten Temperatur der Larven, zeigt es die Präferenzen der Bevölkerung von Tieren über eine gesamte lineare Bereich in einem einzigen Experiment. Aufgrund dieser Vorteile ist es eine ausgezeichnete Wahl für die Identifizierung von Genen, die für Thermotaxis erforderlich.

1. Ausrüstung Herstellung und Montage Vorrichtung zur Gradient Assays

1. Die Aluminiumplatten Assay für die Einzel-direktionale gradient Assay zu fabrizieren.
   1. Schneiden und Schleifen jedes Assay Aluminiumplatte (Abbildung 1A) aus einem einzigen Stück Aluminium gefertigt mit einer Bandsäge und scharfe vertikale Mühle mit den folgenden Dimensionen: die äußere Größe 140 x 100 x 9 mm und die innere Größe 130 x 90 x 8 mm (Abbildung 1 b). Eloxieren der Innenseite jeder Assay-Platte mit schwarzer Farbe erleichtert das Visualisieren der Larven und Rost zu verhindern.
      Hinweis: Herstellung von Aluminium-Assay-Platten für den Single-direktionalen Verlauf erfolgt durch eine mechanische Werkstatt. Die Anodisierung wird von einem kommerziellen Anbieter durchgeführt.
   2. Markieren Sie die oberen und unteren Felgen jeder Assay-Platte mit 13 Abgrenzungen, getrennt durch 10 mm mit einem permanent-Marker. Legen Sie die ersten und letzten Abgrenzungen 5 mm von der Innenkante der Assay-Platten (Abb. 1A, B).
2. Um die Aluminiumplatte Assay für den bidirektionalen Verlauf fertigen, eine Alu-Platte mit den folgenden Abmessungen mit Blech Schere ausgeschnitten: 250 x 220 x 2 mm. Eloxieren der Assay-Platten mit schwarzer Farbe.
   Hinweis: Herstellung von Assay Aluminiumplatten für die bidirektionale Gradienten erfolgt durch eine mechanische Werkstatt. Die Anodisierung erfolgt durch einen kommerziellen Anbieter.
3. Die Aluminium-Blöcke zu fabrizieren.
   Hinweis: Zwei Blöcke sind erforderlich für den Single-direktionalen Verlauf und drei Blöcke sind für den bidirektionalen Verlauf erforderlich.
   1. Schneiden Sie die Aluminium-Blöcke (Abbildung 1) aus einem einzigen Stück Aluminium gefertigt mit einer Bandsäge (Abmessungen von 50 x 255 x 14 mm) (Abbildung 1, D).
   2. Der Bohrer den Wasserkanal innerhalb des Blocks (7 mm Durchmesser) mit einer vertikalen Mühle und Thread-Nuten in die offenen Enden auf der einen Seite (Abbildung 1). Schließen Sie die geriffelte Löcher mit Schrauben und Gewinde Dichtung Klebeband um einen u-förmigen Wasserkanal (Abbildung 1, D) zu bilden.
      Hinweis: Die Herstellung von Aluminium-Assay-Blöcken erfolgt durch eine mechanische Werkstatt.
   3. Befestigen Sie den Stecker in die Aluminium-Block (Abbildung 1) mit Gewinde und Gewinde Dichtung Klebeband an einem Ende. Passen Sie das andere Ende mit mehreren Widerhaken in Silikon Schläuche (ID 1/4" x 3/8" OD x 1/16" Wand).
4. Erhalten Sie zwei gekühlt/beheizt zirkulierenden Bäder.
5. Temperaturgeführte Blöcke für den Farbverlauf Testsystem montieren.
   1. Verbinden Sie für den Single-direktionalen Verlauf jeweils die beiden Aluminium-Blöcke zu einem separaten Wasserbad, so dass die Temperaturregelung der einzelnen Blöcke durch einen unabhängigen Wasser zirkulierenden System (Abbildung 2A). Verwenden Sie Silikonschlauch (ID 1/4" x 3/8" OD x 1/16" Wand) Verbindung der Auslass des Wasserbades an den Anschluss auf der inneren Seite des Aluminium-Block (Abbildung 2A). Auch Schläuche an um den Außenseite-Connector auf dem Aluminiumblock mit dem Einlass des Wasserbads zu verbinden.
   2. Platzieren Sie für den bidirektionalen Farbverlauf zwei der drei Blöcke unter dem linken und rechten Seite der Platte zu und verbinden Sie diese mit dem gleichen Wasserbad mit dem Schlauch (Abb. 2 b). Schließen Sie den dritten Aluminiumblock in eine zweite Wasserbad und Ort unterhalb der Mitte der Platte (Abb. 2 b).
      Hinweis: Dieser Apparat und Assay sind nur notwendig wenn die Larven in der Zone zu einer Kante oder die andere Single-direktionale Gradienten sammeln. Wenn ja, ist es wichtig zu beurteilen, ob oder nicht es ein Randeffekt ist. Um diese Möglichkeit zu testen, schaffen Sie einen bidirektionalen Farbverlauf, in dem die Kante Temperatur bevorzugt durch die Larven mit der Single-direktionale Farbverlauf (z.B. 18 ° C) die Temperatur in der Mitte der Platte des bidirektionalen Gradienten (Abbildung 3E ist , F).

2. Larven Synchronisation

1. Nähren Sie fliegen zur Eiablage verwendet werden.
   1. Mix Hefe Granulat und destilliertem Wasser mit einem Stößel zu Hefe einfügen. Gründlich Schleifen Sie und rühren Sie, bis die Konsistenz der Paste Peanut Butter ähnlich ist. Vermeiden Sie übermäßig trockene Paste, die Abblättern, wenn Sie fliegen auf frische Fläschchen übertragen kann, oder nass Paste, die die fliegen fangen konnte.
   2. Mit einem Stößel, fügen Sie die Hefe-Paste in der Nähe von den Innenwänden der standard Drosophila -Fläschchen, knapp über der Oberfläche des Essens.
   3. Anzahl 12-35 Frauen und bis zu halb so viele Männer (aber nicht mehr als 10) auf eine CO₂ Pad, und jede Hefe einfügen, enthält der Weibchen und Männchen hinzufügen.
   4. Um die Fliege zu halten Lebensmittel mit der Hefe-Paste feucht, während die Fliegen ernähren, kombinieren diese Fläschchen in einem Fach, das hält bis zu 100 Durchstechflaschen mit 20 offenen Ampullen mit destilliertem Wasser nur. Das Tablett in eine klare Plastiktüte und verschließen.
   5. Inkubieren Sie das Fach in einem 25 ° C Inkubator für 48 h, so dass die Weibchen angemessen, genährt werden, wodurch sie zu viele Eier zu legen.
2. Fläschchen für die Eiablage eingerichtet.
   1. Übertragen Sie die genährten fliegen in neue Lebensmittel-Fläschchen für Ei-sammeln durch Antippen über. Verwenden Sie keine CO_2, wodurch die fliegen über das folgende kurze Zeitfenster weniger Eier legen.
      Hinweis: Standard Drosophila Essen Fläschchen werden ohne Hefe Paste für die Eizellentnahme verwendet.
   2. Die fliegen zur Eiablage für 3 h bei 25 ° C, so dass alle über eine relativ schmale Zeitfenster Eizellen zu ermöglichen.
      Hinweis: Dies ermöglicht die Larven werden in der gleichen Entwicklungsstufe synchronisiert.
   3. Legen Sie die Fläschchen mit den Eiern in der Schale mit dem Fläschchen Wasser und ziehen Sie die Tasche. Inkubation bei 25 ° C unter 12 h Licht: 12 h dunkel-Zyklen.
   4. Alter der Larven für eine bestimmte Anzahl von Stunden nach der Eiablage (AEL) je nach dem Larvenstadium gewünscht.
      Hinweis: Tabelle 1 ist eine Schätzung des Verhältnisses zwischen den Stunden AEL und das Larvenstadium, die variiert, abhängig von der Fliege bestand Nahrung verwendet, Temperatur etc. die genaue Beziehung zwischen AEL und Entwicklungsstadium muss Aufzucht von jeder Ermittler anhand von physikalischen Kriterien wie die Morphologie der Mund Haken und Luftlöcher¹¹überprüft.

(3) Temperaturgradient Setup

1. Single-direktionalen Verlauf vorbereiten
   1. Um eine feuchte Umgebung während der Tests zu erstellen, platzieren Sie die beiden Aluminium-Blöcke mit zwei Wasserbäder auf nassem Papierhandtücher, getrennt durch 10 cm (Abbildung 2A) verbunden.
   2. Schalten Sie die zwei Wasserbäder ~ 2 h vor Beginn des Tests um genügend Zeit für die Temperatur der Aluminium-Blöcke zu equilibrate.
      Hinweis: Es wird empfohlen, durchführen eine mock Experiment, um die Temperatur der einzelnen Wasserbad zu bestimmen, die erforderlich ist, um den gewünschten linearen Temperaturgradienten zu erreichen. Einige typische Temperatur Paare die Wasserbäder festgelegt sind in Tabelle 2aufgeführt. Beachten Sie jedoch, dass die Oberflächentemperaturen von der Umgebungstemperatur beeinflusst werden. Die Länge der Schläuche auch beeinflusst die Temperaturen da ist die Kühlung in den Rohren. Die Länge des Schlauches in unserem Setup ist 1,5 m.
   3. Mikrowellen-100 mL 1 % Agarose bei der Hochleistungs-Einstellung in einen 500 mL Runde breit-Mund Flasche und Gießen Sie 25 mL/Platte auf einer Ebene Benchtop assay. Bereiten Sie zwei Assay-Platten, die zur gleichen Zeit (Abbildung 2A) auf die Aluminium-Blöcke platziert werden können.
   4. Nachdem die Agarose (10-20 min) erstarrt ist, reiben Sie jede Agarose-Oberfläche mit einem standard küchenschwamm oder Melamin Schwamm um die Agarose Oberfläche etwas grob, so dass beim Sprühen Wasser auf die Agarosegel, eine glatte dünne Wasser Membran erstellt wird, und keine Wassertröpfchen bilden.
   5. Tauchen Sie voll die Platten in einem Behälter mit destilliertem Wasser, bis der Test durchgeführt werden, um zu verhindern, dass die Platten immer ausgetrocknet ist.
2. Bereiten Sie einen bidirektionalen Farbverlauf (optional)
   1. Um eine feuchte Umgebungsbedingungen während der Tests zu erstellen, legen Sie drei Aluminium Blöcke 8 cm auseinander (Abb. 2 b) auf feuchten Küchenpapier.
   2. Schalten Sie die zwei Wasserbäder ~ 2 h vor Beginn des Tests um genügend Zeit für die Temperatur der Aluminium-Blöcke zu equilibrate.
      Hinweis: Es wird empfohlen, ein mock Experiment zur Bestimmung der Temperatur von jedem Wasserbad für den bidirektionalen Verlauf durchführen. Einige typische Temperatur Paare die Wasserbäder festgelegt sind in Tabelle 3aufgeführt. Beachten Sie jedoch, dass die Oberflächentemperaturen von der Umgebungstemperatur beeinflusst werden. Die Länge der Schläuche auch beeinflusst die Temperaturen da ist die Kühlung in den Rohren. Die Länge des Schlauches in unserem Setup ist 1,5 m.
   3. Damit die Agarose nicht verschütten aus der Platte, wickeln Sie die Kanten der Aluminiumplatte mit Kennzeichnung Band um eine 10 mm hohe Wand (Abb. 2 b) zu bilden.
   4. Mit dem Hochleistungs-Einstellung, Mikrowelle 200 mL 1 % Agarose in einem 500 mL Runde breit-Mund Flasche und 120 mL auf eine Test-Platte Gießen.
   5. Nachdem die Agarose (~ 30 min) erstarrt ist, reiben Sie jede Agarose-Oberfläche mit einem standard küchenschwamm oder Melamin Schwamm um die Agarose Oberfläche etwas grob, so dass beim Sprühen Wasser auf die Agarosegel, eine glatte dünne Wasser Membran entsteht und keine Wassertropfen Form.
   6. Voll und ganz Eintauchen der Assay-Platten in einem Behälter mit destilliertem Wasser bis der Test durchgeführt werden, damit sie nicht austrocknen kann.
3. Single-direktionalen Verlauf einrichten
   1. Bereiten Sie Reagenzien und Gegenstände auf einer Bank neben den Farbverlauf Assay-Apparat (siehe die Tabelle der Materialien vor).
   2. Um effiziente Temperatur Transfer zu fördern, füllen Sie Lücken zwischen den Aluminium-Blöcken und die Assay-Platten durch Besprühen mit Wasser an der Schnittstelle zwischen den Blöcken und Platte.
   3. Mit Handschuhen der Assay-Platten von den Wasserbehälter entfernen. Wenn Wasser zwischen die Agarosegel und der Platte dringt und Beulen zu bilden auf der Oberfläche verursacht, entfernen Sie das Wasser mit einer Mikropipette P1000.
   4. Legen Sie die Assay-Platten auf die Aluminium-Blöcke, so dass die Abgrenzungen, die 2 cm von jedem Rand genau sind die Kanten der Aluminium-Blöcke (Abb. 2A, C) entsprechen.
   5. Sprühen Sie Wasser auf die Oberfläche der Platte (eine dünne Wasser-Membran, die die Agarose-Oberfläche ist ausreichend), das Agarosegel Austrocknen verhindert wird. Stellen Sie sicher, dass die Wasser-Membran ist kontinuierlich und frei von Wassertropfen da Larven in Wassertröpfchen verfangen können.
   6. Decken der Gradienten-Systems mit einem Karton, Wasserverdunstung zu reduzieren und die Gel-Oberflächentemperatur zu stabilisieren. Warten Sie ca. 5-10 min damit die Temperatur zu equilibrate.
   7. Überprüfen Sie die Oberflächentemperatur von 12 Punkt auf der Platte (Abbildung 2). Nehmen Sie zwei Messungen in jeder Zone, um festzustellen, ob oder nicht es Variabilität innerhalb einer Zone gibt. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur an beiden Stellen ist innerhalb von ± 0,2 ° C der Temperatur.
      Hinweis: Variabilität innerhalb einer Zone tritt normalerweise auf, da die genauen Entfernungen der beiden Orte an den Rand der Aluminium-Blöcke nicht identisch sind. Passen Sie die Position der Platte auf die Aluminium-Blöcke, um sicherzustellen, dass Abgrenzungen, die 2 cm von jedem Rand genau sind die Kanten der Blöcke Aluminium entsprechen.
   8. Weicht die gemessene Temperaturgradient von der gewünschten Farbverlauf, erhöhen Sie oder verringern Sie die Wasser-Bad-Temperatur-Einstellungen und überprüfen Sie die Oberflächentemperatur, nachdem die Temperatur des Wasser-Badewanne(s) stabilize(s).
   9. Decken Sie die gradient-System mit einem Karton bis Assays ab.
4. Bidirektionale Farbverlauf richten Sie ein (optional)
   1. Bereiten Sie Reagenzien und Gegenstände auf einer Bank neben den Farbverlauf Assay-Apparat (siehe die Tabelle der Materialien vor).
   2. Spritzwasser auf den Oberflächen der drei Aluminium-Blöcke effizient Temperatur Transfer aus den Aluminium-Blöcken an der Assay-Platten zu fördern, durch das Ausfüllen der Lücken zwischen den Flächen.
   3. Der Assay-Platten sorgfältig aus den Wasserbehälter und auf den Aluminium-Blöcken. Wenn Wasser zwischen die Agarosegel und der Platte, die Beulen zu bilden auf der Oberfläche verursachen könnten dringt, entfernen Sie das Wasser mit einer Mikropipette P1000.
   4. Legen Sie die Test-Platte auf die Aluminium-Blöcke, so dass die Mittellinien der ersten und letzten Zonen von jedem Rand die Kanten der beiden seitlichen Aluminium Blöcke (Abb. 2 b, D exakt).
   5. Sprühen Sie Wasser auf die Oberfläche der Platte (eine dünne Wasser-Membran, die die Agarose-Oberfläche ist ausreichend), das Agarosegel Austrocknen verhindert wird. Stellen Sie sicher, dass die Wasser-Membran ist kontinuierlich und frei von Wassertröpfchen, da Larven in Wassertröpfchen verfangen können.
   6. Decken der Gradienten-Systems mit einem Karton, Wasserverdunstung zu reduzieren und die Gel-Oberflächentemperatur zu stabilisieren. Warten Sie ca. 5-10 min um die Temperatur zu equilibrate zu ermöglichen.
   7. Überprüfen Sie die Oberflächentemperatur an zwei Punkten entlang der Mittellinie des jeder der 10 Zonen (Abb. 2D). Nehmen Sie zwei Messungen in jeder Zone, um festzustellen, ob oder nicht es Variabilität innerhalb einer Zone gibt. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur an beiden Stellen ist innerhalb von ± 0,2 ° C der Temperatur.
      Hinweis: Variabilität innerhalb einer Zone tritt normalerweise auf, da die genauen Entfernungen der beiden Orte an den Rand der Aluminium-Blöcke nicht identisch sind. Passen Sie die Position der Platte auf die Aluminium-Blöcke, um sicherzustellen, dass die Mittellinien der ersten und letzten Zonen am nächsten jede Kante genau die Kanten der beiden seitlichen Aluminium Blöcke übereinstimmen.
   8. Weicht die gemessene Temperaturgradient von der gewünschten Farbverlauf, passen Sie der Wasser-Bad-Temperatur-Einstellungen an und überprüfen Sie die Oberflächentemperatur, nachdem die Temperatur des Wasser-Badewanne(s) stabilize(s).
   9. Decken Sie die Blöcke mit einem Karton bis zum Beginn des Tests.

(4) Larven Sammlung und waschen

1. Isolieren Sie saubere Larven (Option 1)
   1. 50 mL Reagenzglas ~ 40 mL 18 % Saccharoselösung hinzufügen. Schöpfen Sie alle Larven aus der Nahrung Ampulle(n) mit Scoopula und Transfer zu den 18 % Saccharose-Lösung.
   2. Mischen Sie gründlich, aber sanft mit einem Scoopula, Larven von die Speisereste zu trennen. Warten Sie 30-60 s bis die Larven Float auf die oberste Schicht des Rohres. Gießen Sie die oberste Schicht, die die Larven (~ 10 mL) enthält, eine weitere 50 mL-Tube und füllen Sie das Rohr mit frischen 18 % Saccharoselösung. Warten Sie 30-60 s bis die Larven Float auf die oberste Schicht erneut.
      Hinweis: Große Speisereste manchmal zusammen mit Larven übertragen und können Larven Thermotaxis beeinflussen, wenn sie nicht entfernt werden. Wenn große Speisereste in die oberste Schicht bleiben, wiederholen Sie die Schritte 4.1.1-4.1.2, oder manuell entfernen sie mit einem Scoopula.
   3. Übertragen Sie die oberste Schicht der Larven (~ 10 mL) zu zwei anderen 50 mL Tubes und füllen Sie die beiden Röhren mit destilliertem Wasser, die Saccharose-Konzentration zu reduzieren, so dass Larven schnell im Wasser versinken. Warten Sie 30-60 s, bis die Larven zu Boden sinken. Führen Sie diese und die folgenden Schritte so schnell wie möglich um die Larven vor dem Ertrinken zu verhindern.
   4. Durch leichtes Kippen der Röhren so viel Wasser wie möglich zu verwerfen. Kombinieren Sie Larven in eine Röhre durch die Larven mit dem restlichen Wasser ausgießen und füllen Sie das Rohr mit destilliertem Wasser.
   5. 30-60 s warten Sie, bis alle Larven nach unten sinken und entfernen Sie so viel Wasser wie möglich durch leichtes Kippen der Rohre. Wiederholen Sie dies Waschen 2-bis 4-Mal auf ganz entfernen Saccharose und alle sichtbaren Essen.
   6. So viel Wasser wie möglich zu verwerfen Sie und übertragen Sie die Larven auf eine leere 35 mm Petrischale durch Dekantieren. Sprühen Sie den Schlauch mit Wasser und verwenden Sie einem kleinen Pinsel, um Übertragung der Larven.
   7. Entfernen Sie überschüssiges Wasser aus der Petrischale mit einem P1000 Mikropipette. ~0.5 mL Wasser zu verhindern Austrocknung der Larven zu verlassen.
   8. Setzen Sie den Deckel auf die Schüssel, die Larven an der Flucht zu verhindern. Drehen Sie den Deckel auf den Kopf gestellt um die Fähigkeit der Larven durch den kleinen Spalt zwischen Deckel und Schüssel entweichen zu reduzieren. Die Larven wieder für 10-20 min zu ermöglichen.
2. Isolieren Sie saubere Larven (Option 2)
   Hinweis: Diese alternative Methode zur Reinigung von Larven mildert die Möglichkeit, die Larven während des Waschvorgangs zu ersticken. Um diese Methode zu verwenden, gehen Sie mit den folgenden Schritten nach dem Ausführen der obigen Schritte 4.1.1-4.1.2.
   1. Legen Sie eine Zelle Sieb (300 µm behält Larven 72 h AEL oder älter) auf ein 50 mL-Tube.
   2. Gießen Sie nachdem Sie bestätigt haben, dass es keine Erwachsenen Körper oder Speisereste schwimmt auf der Oberfläche der Saccharose-Lösung die oberste Schicht enthält die Larven durch das Sieb, die Larven auf dem Sieb zu fangen. Die Larven gründlich mit destilliertem Wasser zu waschen, bis die 50 mL-Tube gefüllt ist.
   3. Entfernen Sie die Zelle Sieb mit den Larven und entsorgen Sie das gebrauchte Wasser aus dem Rohr. Legen Sie das Sieb, die Larven auf der leeren Hülse enthält und waschen Sie die Larven wieder mit destilliertem Wasser zu, bis die 50 mL-Tube gefüllt ist.
   4. Umdrehen Sie das Sieb eine leere 35 mm Petrischale Kopf, und sprühen Sie Wasser vom oberen Rand der Zelle Sieb übertragen die Larven auf der Petrischale. Übertragen Sie die restlichen Larven mit einem kleinen Pinsel.
   5. Weiter zu Schritt 4.1.7 oben, bevor Sie fortfahren mit Schritt 5 fort.

5. Test und Berechnung

1. Entfernen Sie den Karton und überprüfen Sie die Gel-Oberflächentemperatur unmittelbar vor der Larven auf die Platte übertragen. Minimieren Sie die Zeit, die der Karton geöffnet um zu verhindern, die Temperatur Gleichgewichtherstellung zu stören ist. Wenn die Oberfläche trocken ist, Sprühen Sie eine kleine Menge Wasser auf die Oberfläche.
2. Verteilen von 150 ± 50 Larven nahe dem Zentrum von jeder Platte (zwischen den Zonen 3 und 4 aus 6 Zonen) für den Single-direktionalen Verlauf (Freigabe Zone; Abbildung 2).
   Hinweis: Für den bidirektionalen Verlauf 200-400 Larven entlang der mittleren Zone der beiden Hälften verteilen (Abb. 2D).
3. Mikrotestplatte Deckel über jedes Assay-Platte zu verhindern, dass die Larven kriechen heraus. Decken Sie das Setup mit einem Karton, Belichtung, zu verhindern, dass die Larven Wahl auf das Agarosegel beeinträchtigen könnten.
   Hinweis: Für den bidirektionalen Verlauf sollte es nicht notwendig sein, die Platte mit einem Deckel abdecken, weil die Platte größer ist, und die bevorzugte Temperatur der Larven in der mittleren Zone ist. Infolgedessen einige Larven sammeln sich an den Rändern und haben die Möglichkeit, heraus zu kriechen.
4. Ermöglichen Sie der Assay für 10-30 min für den Single-direktionalen Verlauf und für 15-35 min für die bidirektionale Steigung, je nach dem Alter der Larven (Tabelle 4) vorgehen.
5. Entfernen Sie den Karton und die Mikrotestplatte Deckel. Die Platten von oben mit einer Digitalkamera zu fotografieren. Fotografieren Sie zwei jeder Assay-Platte, so dass die Ermittler mit besseren Kontrast und Helligkeit für die Analyse wählen kann.
6. Entfernen Sie alle die Larven von den Assay-Platten und überall außerhalb der Platten durch Absaugen.
7. Reinigen Sie der Assay-Platten, Rohre und die Zelle Sieb gründlich mit destilliertem Wasser. Wiederverwendung der Assay-Platten an diesem Tag vorbereitet, es sei denn, die Oberfläche der Agarose beschädigt ist.
8. Berechnen Sie die prozentuale Verteilung der Larven in jeder Zone.
   1. Öffnen Sie das fotografische Bild die Untersuchungsergebnisse, die Verwendung von Software, die ermöglicht das Hinzufügen von Markierungen auf das Bild. Zeichnen Sie um den Assay-Zonen anzugeben, vertikale Linien, die alle 2 cm der Markierungen auf der Assay-Platte anhand.
   2. Die Anzahl der Larven in jeder Zone, und notieren Sie die Zahlen. Zählen Sie Larven in Regionen 0,5 cm von jedem der Wände nicht. Das Gel ist in der Nähe von die Wände dicker, und die Oberflächentemperaturen sind in diesen Regionen nicht linear.
   3. Berechnen Sie für den Single-direktionalen Verlauf die prozentuale Verteilung in jeder Zone wie folgt:
      (Anzahl der Larven in einer bestimmten Zone 2 cm) / (Gesamtanzahl der Larven in 6 Zonen) X 100.
   4. Berechnen Sie für den bidirektionalen Farbverlauf die prozentuale Verteilung in jeder Zone wie folgt:
      (Anzahl der Larven in einer bestimmten Zone 2 cm) / (Gesamtanzahl der Larven in 5 Zonen auf jeder Seite des Farbverlaufs) X 100.

Um eine 18 ° C - 28 ° C Single-direktionale etablieren soll Gefälle, wir die Temperaturen der zwei Wasserbäder 16,8 ° C und 31 ° C. Wir erreichen die Temperaturen auf 13 Punkte durch Messen der Temperatur bei 26 Positionen innerhalb der oberen und unteren Abschnitte aller 6 Zonen, die Grenzlinien zwischen den Zonen und an den äußersten Enden der Agarose-Gel-Oberfläche (Abbildung 2, 2E). Die Temperaturverteilung entlang der Steigung war fast linear (Y = 0,9672 * X + 16.19, R2 = 0.9961) (Abb. 2E).

Wir untersucht die Temperatur Präferenzen der Kontrolle (w1118) Larven in verschiedenen Altersstufen. 1St (24 ± 1,5 h AEL), 2Nd (48 ± 1,5 h AEL) und frühen 3rd Larven (72 ± 1,5 h) zeigte Gipfeln in die 24 ° C-Zone (Abb. 3A, B). Die Temperatur-Einstellungen geändert während 3rd instar Larvalentwicklung. Der größte Anteil der Mitte 3rd Instar (96 ± 1,5 h AEL) angesammelt in den 18 ° C-Zone (Abb. 3A, B), und diese Tendenz erhöht sich mit zunehmendem Alter. Unter den späten 3rd Instar Larven (Pre-Klettern; 120 ± 1,5 h AEL), ~ 50 % gruppierten in 18 ° C-Zone, und die Auswahl von dieser Temperatur war ~ 4-fach höher als die angrenzenden 20 ° C-Zone (18 ° C-Zone, 50,2 %; 20 ° C-Zone, 15,1 %; Abbildung 3A " B). Die Neigung zu akkumulieren in der 18 ° C-Zone w 1118 lag nicht an ein Randeffekt seit den späten 3rd instar Larven noch angesammelt in der 18 ° C-Zone mit einem bidirektionalen Temperaturgradienten (Abbildung 3E, F ).

Wir testeten auch spät-3rd Instar Larven (120 ± 1,5 h AEL) mit Mutationen in Genen, die für anspruchsvolle Temperaturunterschiede im Bereich von komfortablen erforderlich. Dazu gehören trpA1, was für normale Temperaturwahl in 18 ° C - 24 ° C Reihe5,7,8erforderlich ist. Larven mit einer null-Mutation im trpA1 (trpA11) verteilen sich gleichmäßig über die gesamte 18 ° C-28 ° C Farbverlauf (Abbildung 3). Fehlt nur der A und B Isoformen (trpA1-ABG4) oder der C und D Isoformen (trpA1-CDG4) auch Larven zeigen schwere Beeinträchtigungen (Abbildung 3). Fliegen zwei Isoformen von Phospholipase Cβ (PLC21C und NORPA) kodieren, und Mutationen NorpA (NorpAP24) aber nicht plc21c (plc21cP319) auch stören Akkumulation im Bereich von 18 ° C ( 3D Abbildung).

Abbildung 1: Vorrichtung zur Durchführung von Einzel-direktionale Temperaturgradient Assay. (A) Aluminium Platte verwendet für Untersuchung Larven Thermotaxis Verhalten testen. Die 13 schwarzen Linien am oberen und unteren abzugrenzen 12 Zonen (10 mm). Die Unterseite der Platte ist mit schwarzer Farbe eloxiert, so dass es einfacher ist, die Larven zu visualisieren. (B) Dimensionen der Aluminiumplatte (angegeben in mm). Die äußere Größe der Aluminiumplatte ist 140 x 100 x 9 mm. Die innere Größe der Aluminiumplatte ist 130 x 90 x 8 mm. Die Abgrenzungen sind um 10 mm getrennt. Die erste und letzte Abgrenzung ist 5 mm von den Kanten des inneren Bereichs der Platte. (C) Top und Seitenansichten eines Aluminium-Blöcke verwendet, um die Temperatur des Verlaufs zu kontrollieren. Der Block hat zwei Steckverbinder Anfügen an Silizium-Röhren, die mit einem Wasserbad verbinden. (D) Dimensionen von einem Aluminiumblock. Die äußere Größe der Aluminiumblock ist 255 x 50 x 14 mm. Der Durchmesser des inneren Wasserweg beträgt 7 mm. Zwei 30-mm-Anschlüsse auf der linken Seite verbinden Sie mit Silikon-Schläuche, die auf dem Wasserbad erstreckt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Einzel- und bidirektionale gradient Assay-Setups. (A) Single-direktionale gradient Setup mit zwei Aluminiumplatten Assay auf zwei Aluminium-Blöcken. Die Temperaturen der Aluminium-Blöcke werden durch zirkulierende Wasser aus zwei Wasserbäder gesteuert. (B) die Anordnung der drei Aluminium-Blöcke, Wasserbäder und eine Alu-Platte (250 x 220 mm) für einen bidirektionalen Farbverlauf. Die linken und rechten Blöcke mit dem gleichen Wasserbad verbunden sind und der mittleren Block mit anderen Wasserbad verbunden ist. Assay Aluminiumplatte wird mit Klebeband auf eine 10 mm Wand um 1 % Agarose enthalten bilden umwickelt. (C) Positionen, Temperaturen (durch Punkte gekennzeichnet) zu überprüfen und zu Larven auf der Platte zu lösen. Überprüfen Sie vor der Einleitung eines Experiments die Temperatur an zwei Punkten innerhalb jeder Zone zu bestätigen, dass der gewünschte linearer Temperaturgradient entsteht. Larven werden innerhalb des angegebenen Bereichs in der Nähe der Mittellinie freigegeben. Die Larven werden in jedem der 2-cm-Zonen gezählt. (D) Positionen, Temperaturen (durch Punkte gekennzeichnet) und die Freigabe-Zonen für die Larven auf einer bidirektionalen Steigung zu überprüfen. Eine gleiche Anzahl von Larven werden entlang der Mittellinie des jeweils die Hälfte des bidirektionalen Verlaufs freigegeben. Die Zahl der Larven sind in jedem der 10 (2 cm) Zonen gezählt. Ein typischer Satz von Temperaturen (18 ° C - 26 ° C) auf der Oberfläche der Agarose wird angezeigt. (E) Temperaturen gemessen entlang der Grenzlinien und Mittellinien der einzelnen Zonen in einem Beispiel Single-direktionale Farbverlauf. Darstellung von Daten Mitteltemperaturen ± SD n = 8 Assays (150 ± 50 Larven/Assay). Teile davon werden von Sokabe Et Al. reproduziert. 8 mit geringfügigen Änderungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse mit Single-direktionale und bidirektional gradient Assays. (A, B) Bedeuten Sie Prozentsätze der Larven in 6 Zonen auf der Single-direktionalen Verlauf. Daten umfassen 3rd Instar Larven angegebenen Stunden nach der Eiablage (AEL). n = 6-7. Die Fehlerbalken in ein dar ±SEM. (C) thermische Distributionen des Pre-Klettern Ende 3rd instar Larven der Kontrolle (w1118) und trpA1 Mutanten auf der Single-direktionalen Verlauf. n = 3-4. Die Fehlerbalken darzustellen ±SEM. (D) thermische Verteilungen der späten 3rd Instar Larven der Kontrolle (w1118) und PLCβ Mutanten auf der Single-direktionalen Verlauf. n = 4-6. Die Fehlerbalken darzustellen ±SEM. (E) repräsentative Verteilung der Pre-Klettern, spät-3rd Instar Larven (w1118) auf den bidirektionalen Farbverlauf. Die linken und rechten Assay-Zonen sind durch punktierte Linien gekennzeichnet und getrennt durch die keine-Count-Zone in der Mitte (schattigen Bereich). (F) Prozentsatz des Kletterns bereits Ende 3rd instar Larven (w1118) in jeder Zone entlang das Temperaturgefälle. Larven wurden in der linken und der rechten Seite lassen Sie Zonen. Der Assay-Zonen sind durch eine 3 cm-keine-Graf-Zone in der Mitte getrennt und die Verteilungen werden unabhängig voneinander berechnet. Die Fehlerbalken darzustellen SEMs. n = 3 Assays (200-400 Larven/Assay). Teile davon werden von Sokabe Et Al. reproduziert. 8 mit geringfügigen Änderungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1. Die Beziehung zwischen den Stunden nach der Eiablage (AEL) und Larvenstadien.

Tabelle 2. Typische Temperaturgradienten und die entsprechenden Temperaturen der Wasserbäder und Aluminium Blöcke für einzelne gerichtete Steigungen.

Tabelle 3. Typische Temperaturgradienten und die entsprechenden Temperaturen der Wasserbäder und Aluminium Blöcke für bidirektionale Farbverläufe.

Tabelle 4. Larval Altersgruppen (AEL) und die entsprechenden Assay-Zeiten.

Die Autoren haben nichts preisgeben.