Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die bevorzugte Umgebungstemperatur von Drosophila -Larven mit einem kontinuierlichen Temperaturgefälle zu bestimmen.
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Methodenartikel
Ein Temperaturgradient Assay thermische Präferenzen der Drosophila Larven bestimmen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Viele Tiere, einschließlich der Taufliege Drosophila Melanogaster, sind in der Lage, unterscheidende winzige Unterschiede in der Umgebungstemperatur, die ihnen ermöglicht, ihre bevorzugten Thermenlandschaft suchen. Um die Temperatur-Einstellungen von Larven über einen definierten linearen Bereich zu definieren, haben wir einen Test mit einem Temperaturgradienten entwickelt. Um einen Single-direktionalen Verlauf zu etablieren, sind zwei Aluminium-Blöcke mit unabhängigen Wasserbäder, verbunden, die jeweils die Temperatur der einzelnen Blöcke steuert. Die beiden Blöcke setzen die unteren und oberen Grenzen des Farbverlaufs. Der Temperaturgradient entsteht durch eine Agarose-beschichteten Alu-Platte über die zwei Wasser-gesteuerte Blöcke platzieren, damit die Platte erstreckt sich über den Abstand zwischen ihnen. Die Enden der Aluminiumplatte, die oben auf dem Wasser-Blöcke festgelegt ist definiert die minimalen und maximalen Temperaturen und die Regionen zwischen den beiden Blöcken bilden ein linearer Temperaturgradient. Der gradient-Test kann an Larven verschiedener Altersstufen angewendet werden und kann verwendet werden, um durch Mutation entstehende Variationen zu identifizieren, die Ausstellung Phänotypen, wie jene mit Mutationen Gene codieren, TRP-Kanäle und Opsins, die für Temperatur Diskriminierung erforderlich sind.
Einleitung
Thermotaxis wird durch mobile Tiere eingesetzt, um eine Umgebung mit den günstigsten Bedingungen1,2,3auswählen. Wenn das Klima übermäßig heiß oder kalt, dieses Verhalten ist wichtig für das Überleben ist. Darüber hinaus viele Tiere reagieren empfindlich auf sehr kleine Unterschiede in der Temperatur im Bereich von komfortablen und Umgebung mit einer idealen Temperatur aufsuchen. Dies ist von besonderer Bedeutung für wechselwarme Organismen wie Fruchtfliegen, die ihre Körpertemperatur mit der Umgebung equilibrate. Assays, Larven Thermotaxis überwachen wurden maßgeblich bei der....
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Protokoll
1. Ausrüstung Herstellung und Montage Vorrichtung zur Gradient Assays
- Die Aluminiumplatten Assay für die Einzel-direktionale gradient Assay zu fabrizieren.
- Schneiden und Schleifen jedes Assay Aluminiumplatte (Abbildung 1A) aus einem einzigen Stück Aluminium gefertigt mit einer Bandsäge und scharfe vertikale Mühle mit den folgenden Dimensionen: die äußere Größe 140 x 100 x 9 mm und die innere Größe 130 x 90 x 8 mm (Abbildung 1 b). Eloxieren der Innenseite jeder Assay-Platte mit schwarzer Farbe erleichtert das Visualisieren der Larven und Rost zu verhindern.
Hinweis: Herstellung von Alumini....
- Schneiden und Schleifen jedes Assay Aluminiumplatte (Abbildung 1A) aus einem einzigen Stück Aluminium gefertigt mit einer Bandsäge und scharfe vertikale Mühle mit den folgenden Dimensionen: die äußere Größe 140 x 100 x 9 mm und die innere Größe 130 x 90 x 8 mm (Abbildung 1 b). Eloxieren der Innenseite jeder Assay-Platte mit schwarzer Farbe erleichtert das Visualisieren der Larven und Rost zu verhindern.
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Ergebnisse
Um eine 18 ° C - 28 ° C Single-direktionale etablieren soll Gefälle, wir die Temperaturen der zwei Wasserbäder 16,8 ° C und 31 ° C. Wir erreichen die Temperaturen auf 13 Punkte durch Messen der Temperatur bei 26 Positionen innerhalb der oberen und unteren Abschnitte aller 6 Zonen, die Grenzlinien zwischen den Zonen und an den äußersten Enden der Agarose-Gel-Oberfläche (Abbildung 2, 2E). Die Temperaturverteilung entlang der Steigung war fast l.......
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Diskussion
Um den Erfolg dieses Protokolls sicherzustellen, ist es wichtig, Maßnahmen ergreifen, um eine ausreichende Anzahl von Larven, die Experimente durchführen zu erhalten. Dazu gehören Pre-Fütterung die fliegen in Hefe einfügen-haltigen Fläschchen für 2-3-d zur Eiablage zu verbessern. Die Fläschchen müssen platziert in einer Schale mit Wasser Fläschchen und eingeschlossen in eine klare Plastiktüte, die bewahrt der Feuchtigkeit der Nahrung und fördert effektive Fütterung durch die Larven während der Exposition gegenüber normal.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
C.m. wird unterstützt durch die Finanzierung von NEI (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278) und die NIAID (1DP1AI124453).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Gradienten-Assay-Gerät | |||
| PolyScience 9106, gekühltes/beheiztes 6-Liter-Zirkulationsbad | Thomas Scientific | 9106 | Dieses Modell wird nicht mehr hergestellt. Zu den aktualisierten Ersatzmodellen gehören: 1186R00 und 1197U04 für 120 V, 60 Hz oder 1184L08 und 1197U04 für 240 V, 50 Hz. |
| Aluminium-Prüfplatte (für einseitigen Gradienten) | Außenmaße: 14 x 10,1 x 0,9 cm, Innenmaße: 12,9 x 8,7 x 0,8 cm, schwarz eloxiert. | ||
| Aluminiumplatte (für bidirektionales Gefälle) | 25 x 22 x 0,2 cm, schwarz eloxiert. | ||
| Aluminiumblock | Außenmaße: 25,5 x 5 x 1,4 cm, die Parameter der Innenkanäle sind in Abbildung 1D dargestellt. | ||
| Verbinder für Aluminiumblöcke und -schläuche | McMaster-Carr | 91355K82 | |
| Tygon Sanitärsilikonschlauch | Tygon | 57296 | 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" Wand |
| Name | <>Unternehmen< | strong>Katalognummer | <>Kommentare |
| Artikel und Reagenzien für Assay | |||
| Stößel | USA Scientific | 17361 | Stößel für 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen |
| Thermometer | Fluke | 51II | |
| Thermoelement | Fluke | K Typ | |
| Universal Mikroplattendeckel | Corning | 6980A77 | |
| 35 mm Schale | Corning | 9380D40 | |
| Beschriftungsband (für bidirektionalen Gradienten) | Fisher Scientific | 15-951 | Fisherbrand Beschriftungsband 2 Zoll x 14 yds |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | 1%ige Lösung vorbereiten |
| Saccharose | Sigma | S0389-5KG | 18%ige Lösung direkt vor Beginn des Assays |
| Pinsel | Fisher Scientific | 11860 | |
| 50 mL Zentrifugenröhrchen | Denville | C1062-P | |
| Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| 500 mL runde Weithalsflasche | Pyrex | 1395-500 | |
| Zellsieb (300 mm Pore) | PluriSelect | 43-50300 | Optionaler Artikel zum Waschen von Larven |
| Karton (Fläschchenschale) | Genesee Scientific | FS32-124 | |
| Name | Company | <>Katalognummer | Comments |
| Drosophila food | |||
| Destilliertes Wasser | 22.400 mL | ||
| Maismehl, gelb (extra feinmaschig, beflockt) 20 kg | LabScientific Inc. | NC0535320 | 1.609 g |
| Bierhefe 100 lbs | MP Biomedicals | ICN90331280 | 379 g |
| NutriSoy® Sojamehl (10 kg/Einheit) | Genesee Scientific | 62-115 | 221 g |
| Drosophila Agar, Typ II (5 kg) | Genesee Scientific | 66-103 | 190 g |
| Karo leichter Maissirup | Karo | 1.700 mL | |
| Methyl-4-hydroxybenzoat (suspendiert in 200 proof Ethanol) | Sigma Aldrich | H5501-5KG | 72 g/240 mL |
| Propionsäure puriss. p.a., >99,5% (GC) | Sigma Aldrich | 81910-1 L | 108 mL |
| Phosphorsäure ACS-Reagenz, ≥ 85 Gew.-% in H2O | Sigma Aldrich | 438081-500 mL | 8,5 mL |
Referenzen
- Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
- Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
- Vriens, J., Nilius, B.....
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Nachdrucke und Genehmigungen
