Name: Ein Temperaturgradient Assay thermische Präferenzen der Drosophila Larven bestimmen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Lernen Sie einen kontinuierlichen Temperaturgradienten-Assay zur Bestimmung thermaler Präferenzen von Drosophila melanogaster-Larven. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse zur Somatosensation.

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<ol><li>Fowler, M. A., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+TRP+channels+and+animal+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila TRP channels and animal behavior.</a> Life Sci. 92, 394-403 (2013).</li>
<li>Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals.</a> Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).</li>
<li>Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Peripheral thermosensation in mammals.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).</li>
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<li>Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+thermotactic+discrimination+between+the+optimal+and+slightly+cooler+temperatures+via+a+TRPV+channel+in+chordotonal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons.</a> J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).</li>
<li>Shen, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+rhodopsin+in+temperature+discrimination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila.</a> Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).</li>
<li>Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+switch+in+thermal+preference+in+Drosophila+larvae+depends+on+multiple+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins.</a> Cell Rep. 17, 336-344 (2016).</li>
<li>Ni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ionotropic+Receptors+IR21a+and+IR25a+mediate+cool+sensing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila.</a> Elife. 5, 13254(2016).</li>
<li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigational+decision+making+in+Drosophila+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Navigational decision making in Drosophila thermotaxis.</a> J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+a+laboratory+handbook%22">Drosophila: a laboratory handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Um den Erfolg dieses Protokolls sicherzustellen, ist es wichtig, Maßnahmen ergreifen, um eine ausreichende Anzahl von Larven, die Experimente durchführen zu erhalten. Dazu gehören Pre-Fütterung die fliegen in Hefe einfügen-haltigen Fläschchen für 2-3-d zur Eiablage zu verbessern. Die Fläschchen müssen platziert in einer Schale mit Wasser Fläschchen und eingeschlossen in eine klare Plastiktüte, die bewahrt der Feuchtigkeit der Nahrung und fördert effektive Fütterung durch die Larven während der Exposition gegenüber normal...

Thermotaxis wird durch mobile Tiere eingesetzt, um eine Umgebung mit den günstigsten Bedingungen1,2,3auswählen. Wenn das Klima übermäßig heiß oder kalt, dieses Verhalten ist wichtig für das Überleben ist. Darüber hinaus viele Tiere reagieren empfindlich auf sehr kleine Unterschiede in der Temperatur im Bereich von komfortablen und Umgebung mit einer idealen Temperatur aufsuchen. Dies ist von besonderer Bedeutung für wechselwarme Organismen wie Fruchtfliegen, die ihre Körpertemperatur mit der Umgebung equilibrate. Assays, Larven Thermotaxis überwachen wurden maßgeblich bei der Identifizierung und Klärung der Rolle der molekularen Sensoren wie Drosophila Transienten Rezeptor Potential (TRP) Kanäle4,5,6, rhodopsine7,8und Ionotropic Rezeptor-Rezeptoren (IRs)9, die diese Tiere mit Temperatur Empfindlichkeiten in verschiedenen Temperaturbereichen zu verleihen.
Ein zwei-Wege-Choice-Test bietet einen Ansatz zur Untersuchung der thermischer Präferenzen in Larven6,7. Der Test beinhaltet zur Gründung zwei unterschiedliche Temperaturzonen und erlaubt den Tieren, eine Seite über die andere auswählen. Die Ergebnisse von zwei-Wege-Choice-Tests sind robust, vor allem wenn die Temperaturunterschiede zwischen den beiden Optionen groß sind. Darüber hinaus da jedes Assay tabellarisieren nur zwei Gruppen umfasst, können die Daten als einfache Präferenz-Index ausgedrückt werden. Die Leichtigkeit und Einfachheit der zwei-Wege-Wahl-Assays sind auch genetische Bildschirme zugänglich. Eine große Einschränkung ist jedoch, dass viele Experimente erforderlich sind, um die gewünschte Temperatur der Wildtyp oder mutierte Tiere zu etablieren.
Ein gradienter Assay bietet die Möglichkeit, die gewünschte Temperatur in einem einzigen Test8aufzunehmen. Darüber hinaus ermöglicht es im Gegensatz zu den zwei-Wege-Choice-Test, die Auswertung der Verteilung der einer Gruppe von Tieren, konfrontiert mit einer kontinuierlichen Reihe von Temperaturen. Ein gradient Assay verwendet eine Petrischale und Einzeltiere und eignet sich gut für die Charakterisierung von detaillierten Verhaltens einzelner Tiere10. Jedoch da Petrischalen Runde sind, die Größen der Temperaturzonen variieren und sind abhängig von der Entfernung vom Zentrum nach und nach kleiner. Dieses Setup ist daher nicht ideal für die Überwachung der Temperatur-Auswahl der Populationen von Tieren.
Eine kontinuierliche thermischen Gradienten Apparat, der gut geeignet, um die Temperatur-Einstellungen von Gruppen von Larven zu beurteilen ist eine rechteckige Arena beschäftigt und wird hier beschrieben. Das Gerät ist einfach zu konstruieren und montieren. Die Steigung ist linear und ist flexibel, da es verwendet werden kann, inwieweit Thermotaxis über große Temperaturbereiche von 10 ° C bis 42 ° C. Der Test ist schnell und unkompliziert durchzuführen und liefert reproduzierbare Daten. Neben der Berichterstattung der bevorzugten Temperatur der Larven, zeigt es die Präferenzen der Bevölkerung von Tieren über eine gesamte lineare Bereich in einem einzigen Experiment. Aufgrund dieser Vorteile ist es eine ausgezeichnete Wahl für die Identifizierung von Genen, die für Thermotaxis erforderlich.

<table><tbody><tr><td>Gradienten-Assay-Gerät</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolyScience 9106, gekühltes/beheiztes 6-Liter-Zirkulationsbad</td><td>Thomas Scientific</td><td>9106</td><td>Dieses Modell wird nicht mehr hergestellt. Zu den aktualisierten Ersatzmodellen gehören: 1186R00 und 1197U04 für 120 V, 60 Hz oder 1184L08 und 1197U04 für 240 V, 50 Hz.</td></tr><tr><td>Aluminium-Prüfplatte (für einseitigen Gradienten)</td><td></td><td></td><td>Außenmaße: 14 x 10,1 x 0,9 cm, Innenmaße: 12,9 x 8,7 x 0,8 cm, schwarz eloxiert.</td></tr><tr><td>Aluminiumplatte (für bidirektionales Gefälle)</td><td></td><td></td><td>25 x 22 x 0,2 cm, schwarz eloxiert.</td></tr><tr><td>Aluminiumblock</td><td></td><td></td><td>Außenmaße: 25,5 x 5 x 1,4 cm, die Parameter der Innenkanäle sind in Abbildung 1D dargestellt.</td></tr><tr><td>Verbinder für Aluminiumblöcke und -schläuche</td><td>McMaster-Carr</td><td>91355K82</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Sanitärsilikonschlauch</td><td>Tygon</td><td>57296</td><td>1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" Wand</td></tr><tr><td>Name</td><td><>Unternehmen<</td><td>strong>Katalognummer</td><td><>Kommentare</td></tr><tr><td>Artikel und Reagenzien für Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stößel</td><td>USA Scientific</td><td>17361</td><td>Stößel für 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>Fluke</td><td>51II</td><td></td></tr><tr><td>Thermoelement</td><td>Fluke</td><td>K Typ</td><td></td></tr><tr><td>Universal Mikroplattendeckel</td><td>Corning</td><td>6980A77</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Schale</td><td>Corning</td><td>9380D40</td><td></td></tr><tr><td>Beschriftungsband (für bidirektionalen Gradienten)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-951</td><td>Fisherbrand Beschriftungsband 2 Zoll x 14 yds</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td>1%ige Lösung vorbereiten</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S0389-5KG</td><td>18%ige Lösung direkt vor Beginn des Assays</td></tr><tr><td>Pinsel</td><td>Fisher Scientific</td><td>11860</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Denville</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>Scoopula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>500 mL runde Weithalsflasche</td><td>Pyrex</td><td>1395-500</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb (300 mm Pore)</td><td>PluriSelect</td><td>43-50300</td><td>Optionaler Artikel zum Waschen von Larven</td></tr><tr><td>Karton (Fläschchenschale)</td><td>Genesee Scientific</td><td>FS32-124</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td><>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Drosophila food</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser</td><td></td><td></td><td>22.400 mL</td></tr><tr><td>Maismehl, gelb (extra feinmaschig, beflockt) 20 kg</td><td>LabScientific Inc.</td><td>NC0535320</td><td>1.609 g</td></tr><tr><td>Bierhefe 100 lbs</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN90331280</td><td>379 g</td></tr><tr><td>NutriSoy&reg; Sojamehl (10 kg/Einheit)</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-115</td><td>221 g</td></tr><tr><td>Drosophila Agar, Typ II (5 kg)</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td>190 g</td></tr><tr><td>Karo leichter Maissirup</td><td>Karo</td><td></td><td>1.700 mL</td></tr><tr><td>Methyl-4-hydroxybenzoat (suspendiert in 200 proof Ethanol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H5501-5KG</td><td>72 g/240 mL</td></tr><tr><td>Propionsäure puriss. p.a., >99,5% (GC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81910-1 L</td><td>108 mL</td></tr><tr><td>Phosphorsäure&nbsp; ACS-Reagenz, &ge; 85 Gew.-% in H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>438081-500 mL</td><td>8,5 mL</td></tr></tbody></table>

ein temperaturgradient assay thermische präferenzen der drosophila larven bestimmen

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Viele Tiere, einschließlich der Taufliege Drosophila Melanogaster, sind in der Lage, unterscheidende winzige Unterschiede in der Umgebungstemperatur, die ihnen ermöglicht, ihre bevorzugten Thermenlandschaft suchen. Um die Temperatur-Einstellungen von Larven über einen definierten linearen Bereich zu definieren, haben wir einen Test mit einem Temperaturgradienten entwickelt. Um einen Single-direktionalen Verlauf zu etablieren, sind zwei Aluminium-Blöcke mit unabhängigen Wasserbäder, verbunden, die jeweils die Temperatur der einzelnen Blöcke steuert. Die beiden Blöcke setzen die unteren und oberen Grenzen des Farbverlaufs. Der Temperaturgradient entsteht durch eine Agarose-beschichteten Alu-Platte über die zwei Wasser-gesteuerte Blöcke platzieren, damit die Platte erstreckt sich über den Abstand zwischen ihnen. Die Enden der Aluminiumplatte, die oben auf dem Wasser-Blöcke festgelegt ist definiert die minimalen und maximalen Temperaturen und die Regionen zwischen den beiden Blöcken bilden ein linearer Temperaturgradient. Der gradient-Test kann an Larven verschiedener Altersstufen angewendet werden und kann verwendet werden, um durch Mutation entstehende Variationen zu identifizieren, die Ausstellung Phänotypen, wie jene mit Mutationen Gene codieren, TRP-Kanäle und Opsins, die für Temperatur Diskriminierung erforderlich sind.

Um eine 18 ° C - 28 ° C Single-direktionale etablieren soll Gefälle, wir die Temperaturen der zwei Wasserbäder 16,8 ° C und 31 ° C. Wir erreichen die Temperaturen auf 13 Punkte durch Messen der Temperatur bei 26 Positionen innerhalb der oberen und unteren Abschnitte aller 6 Zonen, die Grenzlinien zwischen den Zonen und an den äußersten Enden der Agarose-Gel-Oberfläche (Abbildung 2, 2E). Die Temperaturverteilung entlang der Steigung war fast l...

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die bevorzugte Umgebungstemperatur von Drosophila -Larven mit einem kontinuierlichen Temperaturgefälle zu bestimmen.

Ein Temperaturgradient Assay thermische Präferenzen der Drosophila Larven bestimmen

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Diese Methode kann verwendet werden, um eine Schlüsselfrage auf dem Gebiet der Somatoempfindung zu beantworten, dem Mechanismus, durch den ein Tier, wie z. B. Drosophila melanogaster, seine bevorzugte Umgebungstemperatur wählt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die bevorzugte Temperatur der Larvengruppe in einem einzigen Assay ermitteln kann, wenn sie mit einem kontinuierlichen Temperaturbereich konfrontiert wird. Neben dem Einblick in die Temperaturpräferenzen von Drosophila-Larven kann die Impress-Platte auch für den Einsatz mit anderen Modellorganismen wie dem Wurm C. elegans angepasst werden.Zuerst Hefepaste herstellen, um Fläschchen für ein Kreuz vorzubereiten. Hefegranulat in destilliertem Wasser mischen und mit einem Stößel zu einer Paste mahlen. Fügen Sie dann einen Klecks Hefepaste in der Nähe der Innenwände von Standard-Drosophila-Fläschchen direkt über der Oberfläche des Lebensmittels hinzu.Um die Larven zu produzieren, sammeln Sie 12 bis 35 Weibchen und bis zu halb so viele Männchen, aber nicht mehr als 10 Männchen. Kombinieren Sie diese Gruppen in der Durchstechflasche mit Hefepaste. Legen Sie die vorbereiteten Fläschchen in ein Tablett mit 100 Fl

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In diesem Artikel zeigen wir, Assays, um thermische Nozizeption in...

Lokale und globale Methoden zur Beurteilung der thermischen Nozizeption in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Dieses Video beschreibt den Geschmackspräferenz-Assay, eine Verhaltensmethode, die verwendet wird, um die Anziehungskraft oder Vermeidung von farbigen Lösungen, die anders schmecken, zu messen, indem die Bauchfärbung der Fliege nach der Einnahme der bevorzugten Substanz bewertet wird. Das vorgestellte Protokoll demonstriert das Verfahren, mit dem die Präferenz von Fliegen für Lösungen mit unterschiedlichen Saccharosekonzentrationen gemessen wird.

Geschmackspräferenz-Assay: Eine Methode zur Messung des Fressverhaltens bei Drosophila

Drosophila-Larven haben dedizierte sensorische Neuronen - Nozizeptoren -, deren Reaktion auf potenziell schädliche thermische Reize aversives – oder sogenanntes "nozifensives" – Verhalten im Tier auslöst. Dieses Video beschreibt eine Methode zur Beurteilung der thermischen Nozizeption durch Aufzeichnung des Larvenverhaltens als Reaktion auf die lokale Anwendung einer Wärmesonde auf die Nagelhaut. Diese Methode wird daher als lokaler Wärmesonden-Assay bezeichnet.

Lokaler Wärmesonden-Assay: Eine Methode zur Beurteilung der Nozizeption hoher Temperaturen bei Drosophila-Larven

Drosophila-Fruchtfliegen können kleine Temperaturänderungen erkennen und daher Umgebungen mit günstigen thermischen Bedingungen auswählen. Dieses Video beschreibt einen Verhaltensassay, der die Temperaturpräferenz von Drosophila-Larven auf einem linearen thermischen Gradienten testet.

Temperaturgradienten-Assay: Eine Methode zum Testen der Temperaturpräferenz bei Drosophila-Larven

Wir haben vor kurzem eine neuartige Drosophila circadiane Ausgabe, Temperaturpräferenz Rhythmus (TPR), in dem die bevorzugte Temperatur in Fliegen steigt während des Tages und fällt während der Nacht identifiziert. TPR wird unabhängig von einem anderen zirkadianen Ausgang, der Motoraktivität, reguliert. Hier beschreiben wir das Design und die Analyse von TPR in Drosophila.

Design und Analyse des Temperaturpräferenzverhaltens und seines circadianen Rhythmus in Drosophila

Dieser Bericht beschreibt eine Methode zur Messung der Larvenaktivität von Drosophila mit dem TriKinetics Drosophila Activity Monitor. Das Gerät nutzt Infrarotstrahlen, um die Bewegungen von bis zu 16 einzelnen Tieren zu erkennen. Die Daten können analysiert werden, um Bewegungsparameter wie Raten und die Positionen der Tiere in den Assay-Kammern darzustellen.

Die Messung der Aktivität in der Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Hier zeigen wir einen neuen Assay kalt Nozizeption in Drosophila - Larven zu studieren. Dieser Test verwendet eine speziell angefertigten Peltier Sonde, die eine Brenn schädliche Kältereiz Anwendung und führt zu einer quantifizierbaren kalt spezifischen Verhaltensweisen. Diese Technik wird weiter zelluläre und molekulare Präparation von kalter Nozizeption ermöglichen.

Neuartige Assay für kalte Nozizeption in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvae

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um automatisch bestimmen die lokomotorische Leistung von Drosophila bei schwankenden Temperaturen mit einer programmierbaren temperaturgeführte Arena, die schnell und präzise Temperaturänderungen in Zeit und Raum produziert.

Eine automatisierte Methode zur Bestimmung der Leistungsfähigkeit von Drosophila als Reaktion auf Temperaturänderungen in Raum und Zeit

Thermische Grenzwerte können die Umwelt, die Organismen tolerieren, vorhersagen, was angesichts des raschen Klimawandels wertvolle Informationen ist. Hier werden Protokolle mit hohem Durchsatz beschrieben, um kritische thermische Minima und Wärmeabstoßzeiten bei Insekten zu bewerten. Beide Protokolle maximieren den Durchsatz und minimieren die Kosten der Assays.

High-Throughput-Tests kritischer thermischer Grenzwerte bei Insekten

Insekten haben einen optimalen Umgebungstemperaturbereich, in dem sie bleiben möchten, und viele externe und interne Faktoren können diese Präferenz ändern. Hier beschreiben wir eine kostengünstige und einfache Methode zur Untersuchung der Temperaturwahl, die es Insekten ermöglicht, ihr natürliches Verhalten frei zu zeigen.

Bestimmung der Temperaturpräferenz von Moskitos und anderen Ektothermen

Dieser Bericht beschreibt eine Methode zur Messung der Zeit bis zum Knockdown bei adulten Drosophila melanogaster mit einem Drosophila Activity Monitor (DAM2) als Reaktion auf einen Luftleitungs-Wärmestressor in einer Inkubatorkammer. Das DAM2 misst die Aktivität, indem es einzelne Flugbewegungen aufzeichnet, wenn sie einen Infrarotstrahl überqueren. Die Datenanalyse wird durch eine neuartige ausführbare Datei erleichtert, die von den Autoren erstellt wurde.

Hitzetoleranz-Assays mit dem Drosophila Activity Monitor System: Ein Leitfaden für eine ausführbare Anwendung zur Datenanalyse

Lernen Sie einen kontinuierlichen Temperaturgradienten-Assay zur Bestimmung thermaler Präferenzen von Drosophila melanogaster-Larven. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse zur Somatosensation.

Ein Temperaturgradient Assay thermische Präferenzen der Drosophila Larven bestimmen

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