Ein Temperaturgradient Assay thermische Präferenzen der Drosophila Larven bestimmen

Diese Methode kann verwendet werden, um eine Schlüsselfrage auf dem Gebiet der Somatoempfindung zu beantworten, dem Mechanismus, durch den ein Tier, wie z. B. Drosophila melanogaster, seine bevorzugte Umgebungstemperatur wählt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die bevorzugte Temperatur der Larvengruppe in einem einzigen Assay ermitteln kann, wenn sie mit einem kontinuierlichen Temperaturbereich konfrontiert wird. Neben dem Einblick in die Temperaturpräferenzen von Drosophila-Larven kann die Impress-Platte auch für den Einsatz mit anderen Modellorganismen wie dem Wurm C. elegans angepasst werden.

Zuerst Hefepaste herstellen, um Fläschchen für ein Kreuz vorzubereiten. Hefegranulat in destilliertem Wasser mischen und mit einem Stößel zu einer Paste mahlen. Fügen Sie dann einen Klecks Hefepaste in der Nähe der Innenwände von Standard-Drosophila-Fläschchen direkt über der Oberfläche des Lebensmittels hinzu.

Um die Larven zu produzieren, sammeln Sie 12 bis 35 Weibchen und bis zu halb so viele Männchen, aber nicht mehr als 10 Männchen. Kombinieren Sie diese Gruppen in der Durchstechflasche mit Hefepaste. Legen Sie die vorbereiteten Fläschchen in ein Tablett mit 100 Fläschchen.

Legen Sie 20 offene Fläschchen mit Wasser in die Schale, um für Feuchtigkeit zu sorgen. Verschließen Sie dann das Tablett in einer durchsichtigen Plastiktüte und inkubieren Sie es 48 Stunden lang bei 25 Grad Celsius. Nach 48 Stunden Fütterung und Paarung füllen Sie die Fliegen in neue Futterfläschchen um, um Eier zu sammeln.

Tippen Sie darauf. Verwenden Sie kein Kohlendioxid. Lassen Sie die Fliegen dann drei Stunden lang bei 25 Grad Celsius Eier legen.

Nehmen Sie später die erwachsenen Tiere heraus und legen Sie die Fläschchen mit den Eiern zurück in die Schale mit den Wasserfläschchen und schließen Sie den Beutel. Dann entwickeln Sie die Eier bei 25 Grad Celsius bis zum gewünschten Larvenstadium. Um einen einzelnen Richtungsgradienten vorzubereiten, erstellen Sie zunächst eine menschliche Umgebung für den Assay.

Legen Sie zwei Aluminiumblöcke, die zu separaten Wasserbädern verbunden sind, im Abstand von 10 Zentimetern auf nasse Papiertücher. Die Wasserbäder müssen im Vorfeld aufgewärmt werden. Stellen Sie anschließend 100 Milliliter 1%Agarose her und geben Sie 25 Milliliter auf jede Assay-Platte auf einer ebenen Fläche.

Sobald die Agarose fest geworden ist, reiben Sie die Oberfläche vorsichtig mit einem Melaminschwamm ab, um sie leicht grob zu machen. Um eine effiziente Temperaturübertragung zu fördern, füllen Sie dann alle Lücken zwischen den Aluminiumblöcken in den Assay-Platten mit Wasser, das aus einer Sprühflasche geliefert wird. Platzieren Sie nun die Testplatten auf den Aluminiumblöcken und stellen Sie sicher, dass die Abgrenzungen zwei Zentimeter von jeder Kante entfernt sind, um genau mit den Kanten der Aluminiumblöcke übereinzustimmen.

Sprühen Sie anschließend einen Wasserfilm auf die Oberfläche der Platten, damit die Gele nicht austrocknen. Decken Sie als Nächstes das System mit einem Karton ab, um die Verdunstung zu reduzieren und die Temperatur der Geloberfläche zu stabilisieren. Warten Sie fünf bis 10 Minuten, damit sich die Temperatur ausgleichen kann.

Überprüfen Sie dann die Oberflächentemperatur auf der Platte an mindestens 12 Stellen, um sicherzustellen, dass überall eine gleichmäßige Temperatur von zwei Grad Celsius herrscht oder nicht. Setzen Sie dann den Deckel der Box wieder auf, bis der Assay durchgeführt wird. Um saubere Larven zu isolieren, geben Sie zunächst etwa 40 Milliliter 18%ige Saccharoselösung in ein 50-Milliliter-Reagenzglas.

Setzen Sie dann die Larven aus den Futterhaufen mit einer Scoopula in die Lösung um. Als nächstes mischen Sie die Larven mit der Scoopula gründlich in der Lösung herum. Warten Sie nun 30 bis 60 Sekunden, bis die Larven in die oberste Schicht der Röhre geschwommen sind.

Gießen Sie dann die Lösung mit den Larven in ein weiteres 50-Milliliter-Röhrchen ab und füllen Sie sie mit frischer 18%iger Saccharose auf. Warten Sie erneut, bis die Larven aufschwimmen. Das Vorhandensein von Lebensmitteln kann die Ergebnisse beeinflussen.

Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, ist es daher wichtig, die Larven gründlich zu reinigen, um die Kontamination mit Lebensmitteln zu minimieren. Tun Sie dies vorsichtig, um Schäden an den Larven zu vermeiden. Legen Sie als Nächstes ein 300-Mikron-Zellsieb auf ein 50-Milliliter-Röhrchen und entfernen Sie dann alle toten Körper und Treibstoffe von der Oberfläche der Saccharoselösung.

Gießen Sie nun die Larven durch das Sieb, um sie auf dem Maschensieb zu sammeln. Lassen Sie dann zweimal etwa 50 Milliliter Wasser durch das Sieb laufen, um die Larven weiter zu reinigen. Spülen Sie dann auf eine leere 35-Millimeter-Schale die meisten Larven mit Wasser vom Sieb ab.

Verwenden Sie einen Pinsel, um die restlichen Larven auf das Netz zu übertragen. Saugen Sie dann den größten Teil des Wassers mit einer Mikropipette aus der Schale ab. Legen Sie dann den Deckel verkehrt herum auf die Schale, damit die Larven nicht entweichen können.

Lassen Sie die Larven nun 10 bis 20 Minuten lang sich erholen, bevor Sie den Assay starten. Entfernen Sie zuerst den Karton über dem Gel und überprüfen Sie schnell die Oberflächentemperatur des Gels. Wenn die Oberfläche trocken ist, sprühen Sie eine kleine Menge Wasser auf die Oberfläche.

Wenn das Gel gut ist, dann laden Sie 100 bis 200 Larven mit einem kleinen Pinsel in die Mitte jeder Platte. Setzen Sie dann einen Deckel über jede Testplatte, um die Larven einzufangen, und decken Sie das Setup mit einem Karton ab, um Lichteinwirkung zu verhindern. Die Analyse ist derzeit im Gange.

Entfernen Sie nach 10 bis 30 Minuten den Karton und den Mikrotiterplattendeckel. Fotografieren Sie dann die Platten von oben, um die Position der Larven festzuhalten. Platzieren Sie die Box über der Kamera, um Reflexionen auf der Oberfläche des Gels zu vermeiden.

Um die Platte zu reinigen, saugen Sie alle Larven dort ab, wo sie sich verstreut haben. Berechnen Sie nun die prozentuale Verteilung der Larven in jeder Zone mit Hilfe einer Bildanalysesoftware. Ziehen Sie alle zwei Zentimeter Linien, basierend auf den Abgrenzungen auf der Testplatte, und zählen Sie die Anzahl der Larven in jeder Zone.

Ignorieren Sie bei der Zählung Larven, die in Rillen mit einem Abstand von 0,5 Zentimetern von jeder Kante verteilt sind, da die Geldicke und die Temperaturbedingungen in der Nähe der Kante nicht einheitlich sind. Bei 18 Grad Celsius bis 28 Grad Celsius wurde ein einseitiger Gradient mit Wasserbädern von 16,8 Grad Celsius und 31 Grad Celsius erzeugt. Es zeigte sich, dass die Temperaturverteilung entlang des Gradienten nahezu linear ist.

Kontrolllarven wurden in verschiedenen Altersstufen untersucht. Die erste, zweite und frühe dritte Larve des Stadiums zeigten Spitzenpräferenzen für die 24-Grad-Celsius-Zone. In der Mitte des dritten Stadiums sammelten sich die meisten Larven im 18-Grad-Celsius-Bereich an.

Nicht wandernde Larven im späten Drittel des Stadiums waren dicht gedrängt in der 18-Grad-Celsius-Zone. Die Neigung zur Akkumulation in der 18-Grad-Celsius-Zone im Kontrollstamm, bei dem es sich um White 1118 handelte, war nicht auf einen Kanteneffekt zurückzuführen, da sich die Larven des späten Drittels immer noch in der 18-Grad-Celsius-Zone ansammelten, wobei ein bidirektionaler Gradient verwendet wurde. Als wir Larven im späten Drittel des Stadiums analysierten, die Mutationen beherbergten, die für die Temperaturunterscheidung erforderlich sind, änderten sich die Ergebnisse.

Larven mit einer Nullmutation in trpA1, die gleichmäßig über den gesamten Gradienten von 18 Grad Celsius bis 28 Grad Celsius verteilt sind. Larven, denen nur die A- und B-Isoformen oder die C- und D-Isoformen von trpA1 fehlten, zeigten ebenfalls starke Beeinträchtigungen. Larven mit einer Mutation in einem von zwei Genen, die für Phospholipase c beta, norpA, kodieren, wurden ebenfalls gestört.

Larven mit einer Mutation in einem Gen, das für die andere Phospholipase c beta, plc21c, kodiert, verhielten sich jedoch normal. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein klares Verständnis davon haben, wie Sie mit einem kontinuierlichen thermischen Gradienten reproduzierbare Ergebnisse erzielen können, der es Ihnen ermöglicht, die Temperaturpräferenzen von Wildtyp- und mutierten Drosophila-Larven zu vergleichen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 30 Minuten für einen einzigen Assay durchgeführt werden.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, auf den Zustand der Fliegenfläschchen zu achten und die Larven nicht zu verwenden, wenn sie ausgetrocknet sind. Diese Technik vereinfacht die Entdeckung neuer Gene, die Drosophila-Larven benötigen, um ihre Lieblingstemperatur im angenehmen Bereich zu wählen.