Analyse von Protein-Architekturen und Protein-Ligand-komplexen durch Integrative strukturelle Massenspektrometrie

Summary

Massenspektrometrie (MS) hat als ein wichtiges Instrument für die Untersuchung der Struktur und Dynamik der makromolekularen Versammlungen entstanden. Hier integrieren wir MS-basierte Ansätze, um komplexe Proteinbildung und Liganden Bindung zu befragen.

Abstract

Proteine sind eine wichtige Klasse von biologischen Makromolekülen, die viele wichtige Rollen im zellulären Funktionen einschließlich der Genexpression spielen, katalysieren Stoffwechselreaktionen, DNA-Reparatur und Replikation. Daher ein detailliertes Verständnis dieser Prozesse bietet wichtige Informationen darüber, wie Zellen funktionieren. Integrative strukturelle MS-Methoden bieten strukturelle und dynamische Informationen über Protein komplexen Baugruppe, komplexe Verbindungen, Untereinheit Stöchiometrie, Protein Oligomerisierung und Ligand-Bindung. Jüngste Fortschritte in der integrativen strukturelle MS haben für die Charakterisierung von anspruchsvollen biologische Systeme, einschließlich große DNA-bindende Proteine und Membranproteine erlaubt. Dieses Protokoll beschreibt die vielfältigen MS Daten zu integrieren, wie z. B. native MS und Ionen-Mobilität-Massenspektrometrie (IM-MS) mit Molekulardynamiksimulationen Einblicke in eine Helikase-Nuklease DNA Reparatur-Protein-Komplex. Der daraus resultierende Ansatz bietet einen Rahmen für detaillierte Studien der Liganden Bindung an andere Proteinkomplexe wichtige biologische Prozesse beteiligt.

Introduction

Native massenspektrometrische Analyse von intakten Proteinen und ihre komplexe erfolgt mit Electrospray und Nano-Elektrospray-Ionisation (nESI), die Proteinfaltung zu bewahren und nicht-kovalente Wechselwirkungen während der Ionisation Prozess^{1, 2}. In native MS die Struktur der Proteine und ihre komplexe in einem in der Nähe von nativen Zustand in der Gasphase^3,4festgehalten. Native MS erkennt mehrere geladene Protein-Ionen, die nach ihrer Masse Verhältnis (m/Z), so dass die Masse des Eiweiß oder Protein-Ligand laden getrennt sind komplexe berechnet werden. Diese Information ermöglicht die Bestimmung der einer intakten Proteins Stöchiometrie, Untereinheit Zusammensetzung Ligand-Bindung und Interaktion Netze^3,4,5,6. Native MS hat mehrere Vorteile im Vergleich zu anderen Techniken solche Röntgenkristallographie und magnetischen Kernresonanz-Spektroskopie-⁵. Erstens ist native MS eine schnelle und hochempfindliche Technik erfordert nur wenige Mikroliter (2-3 µL) der Probe bei relativ niedrigen komplexe Endkonzentrationen im hohen nM zu niedrigem µM Bereich⁶. Zweitens kann native MS verwendet werden, um heterogene Proteinproben macht es möglich, mehrere Proteine und Oligomere Staaten gleichzeitig analysieren zu verhören. Drittens erfordert die native MS keine Proteinproben vor der Analyse durch chemische Vernetzung oder Protein Kennzeichnung geändert werden. Diese Vorteile haben strukturelle MS ein leistungsfähiges Werkzeug für die strukturelle Untersuchung von Proteinkomplexen gemacht.

Native MS kombinierbar mit IONENBEWEGLICHKEIT (IM), eine Technik, die die Zeit misst braucht eine Eiweiß-Ionen durch ein elektrisches Feld, Reisen ermöglichen die Elektronenstruktur Querschnitt (CCS) bestimmt werden. CCS bietet mit niedriger Auflösung Strukturinformationen, die Topologie und Konformationsänderungen Heterogenität Informationen von Proteinen zu erreichenden ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht es die Untersuchung von Protein Strukturmodelle durch rechnerische Ansätze generiert.

Gasphase proteinstabilität kann mit Kollision induzierte Entfaltung (CIU) gemessen von IM-MS untersucht werden. Während des Prozesses CIU sind Eiweiß-Ionen beschleunigt und aktiviert durch erhöhte Beschleunigung Kollisionen mit einem inerten Puffer Gas innerhalb eines Massenspektrometers^7,8,9. Diese Elektronenstruktur Aktivierung bewirkt, dass das Protein zu teilweise entfalten, was zu einem Anstieg der CCS übersetzt. Diese Änderung in CCS und die Energie für das Protein entfalten kann, gemessen IM-MS. mithilfe dieses Ansatzes, die Wirkung der Liganden bindend proteinstabilität kann gemessene¹⁰. Subcomplexes können in Lösung mit in Lösung Störung Methoden wie die Zugabe von organischen Lösungsmitteln, Native-ähnlichen Topologien von Proteinkomplexen überwachen generiert werden. Störung der Proteinkomplexe ist vor allem wegen der Störung der Intra nicht-kovalente Wechselwirkungen. Die Sub-komplexe Native-ähnlichen Topologien zu erhalten und bei MS-Detektion, Aufschluss über Inter Untereinheit Konnektivität.

Integrative Ansätze in der Strukturbiologie kombinieren verschiedene Methoden zur Untersuchung der Struktur und Dynamik der Proteine und ihre komplexe^3,4,5,6. Native MS und IM-MS wurden verwendet, um die molekularen Details anspruchsvolle biologische Systeme zu entdecken. Es wurden mehrere Beispiele von Anwendungen, einschließlich der Untersuchung von Protein Montage Wege^11,12,13,14, Studium der Proteinprotein Interaktion Netze^{15 , 16 , 17}, Membran Proteine^{6,18,19,20,21}und Protein-Ligand-Interaktionen wie Nukleinsäuren^{22,23 ,24}.

Native MS hat jedoch auch seine Grenzen. Native MS-Messungen erfolgen oft in flüchtigen Puffer wie wässrigen Ammoniumacetat, in denen einige Proteine nicht ihre gefalteten nativen Zustand^{3,25 behalten}. Dennoch hat die jüngsten Arbeiten gezeigt, dass diese Einschränkung kann, durch die Optimierung überwunden werden des Sprühens Nadel Kopfkreis (Tipps, 0,5 mm), so dass Eiweiß und Protein-Komplex-Ionen direkt aus einem nichtflüchtigen Puffern mit hohen Ionenstärke gebildet werden können, die besser die physiologische Umgebung²⁶zu imitieren. Darüber hinaus nutzt native MS Electrospray ionisieren und nicht-kovalente Baugruppen aus Lösung in der Gasphase übertragen; Daher kann die relative Häufigkeit der erkannten komplexe nicht vollständig in Lösung^5,27darstellen. Darüber hinaus im Vergleich zu in Lösung, die Gas Phase hydrophobe Wechselwirkungen schwächer und elektrostatische Wechselwirkungen stärker geworden und daher^3,28begünstigt.

In diesem Artikel bieten wir Protokolle, Datenanalyse und Interpretation für Proteinidentifizierung und Liganden binden mit native MS, IM-MS, CIU, in Lösung Störung und Modellierung. Die DNA-Repair-Komplex, HerA-NurA, dient als Modellsystem. DNA-Doppelstrang-Brüchen (DSB) sind eines der zytotoxischen und schädlichen Formen von DNA-Schäden in genetische Instabilität und die spätere Entwicklung von Krebs beim Menschen. Homologe Rekombination ist der Repair-Mechanismus der DSB, einen Prozess beseitigt, die durch die ATP abhängige Helikase-Nuklease Komplex, HerA-NurA²²orchestriert.

Kombination von native MS und IM-MS mit funktionellen Assays und Modellierung erlaubt die Untersuchung von: (i) die Rolle der NurA in der Montage, Anpassung und Stabilität des Komplexes, (Ii) die Interaktion zwischen DsDNA und der Komplex und seinen Einfluss auf den Gesamteindruck Stabilität des Komplexes, und Iii) die Stöchiometrie und die Auswirkungen der ATP-Bindung auf die Montage-²². Insgesamt führte diese Arbeit zu einem besseren Verständnis der molekularen Grundlagen des HerA-NurA-komplexes durch die Verknüpfung von Protein Komplex Konformationsänderungen und Stabilität mit Nukleotid-Bindung. Dieses Protokoll ist für jedes Protein-complex(es), die in Wechselwirkung mit einem oder mehreren Ligand(s) Arten generisch.

Protocol

(1) Probenvorbereitung für Native MS von Protein und Protein-Ligand-komplexen

Hinweis: Um ein Verständnis der molekularen Grundlagen von einem Proteinkomplex und Ligand-Bindung mit native MS zu gewinnen, ist geeignete Probenvorbereitung Schlüssel. Das Ziel dieses Abschnitts ist, markieren Sie die wesentlichen Probe Vorbereitungsschritte vor MS-Analyse mit Hilfe des HerA-NurA-Komplexes die DNA und Nukleotiden als Beispiel bindet.

1. Bereiten Sie 20 µL-Aliquots der konzentrierten gereinigtes Protein (in der Regel 15-30 µM) in einer 1,5 mL Tube.
2. Für die Analyse von ATP oder ADP Bindung
   Hinweis: Fügen Sie steigende Konzentrationen von den nicht-hydrolysierbare ATP analoge Adenosin 5 ‘-O-(3-thiotriphosphate), Tetralithium Salz (ATP-γ-S) oder Adenosin-5′-Diphosphat (ADP). Non-hydrolysierbare ATP Derivate erzeugen eine stabile komplexe, die ATP-gebundenen Proteins zu erfassenden ermöglichen würde. Anderen nicht wasserlöslicher ATP-Analoga, die getestet werden können gehören AMP-PNP und ATP-γ-S-Mg^{2 +}.
   1. Mix für HerA-NurA Studien, 5 µM gereinigtes Protein mit ATP-γ-S und ADP in Konzentrationen von 0-1 mM.
   2. Gleichzeitige ATP-γ-S und ADP Bindung zu erfassen, fügen Sie beide Nukleotide in den gleichen oder unterschiedlichen Konzentrationen.
   3. Fügen Sie 2 mM MgCl₂ und bei 25 ° C in einem Trockenbad-Inkubator für 1 h inkubieren.
      Hinweis: Analyse der Nukleotid-Bindung mit nESI native MS artifizielle Bindung bei hohen Konzentrationen führen können, muss daher unspezifischen Bindung Konto²⁹berücksichtigt werden. Um unspezifische Schwergängigkeit zu untersuchen, fügen Sie eine höhere Konzentration von Nukleotiden zwischen 2-5 mM).
3. Für die DNA-Bindung Analyse
   1. Mischen Sie das Protein und DNA in einem molaren Verhältnis, das Protein-DNA-Komplexbildung ermöglicht. Mischen Sie für HerA und HerA-NurA 5 µM gereinigtes Protein mit DNA im Verhältnis 1:1.
   2. Inkubieren Sie HerA-NurA oder HerA – DNA-Mischung für 30 min bei 25 ° C in einem Trockenbad Inkubator bis Gleichgewicht erreicht. Die Dauer und Temperatur der Inkubation variieren je nach Protein untersucht.
   3. Puffer Austausch Proteinproben auf MS kompatibel Puffer. Im Allgemeinen werden wässrige Ammonium-Acetat-Lösung zwischen 5 mM-1 M bei pH 7-8 verwendet. Anderen kompatiblen MS-Puffer sind Ethylenediammonium Diacetat (EDDA) und Triethylammoniumhydrochlorid Acetat (TEAA)³⁰. Benutzen Sie für HerA-NurA Studien 200 mM Ammonium Acetat pH 7.
      Hinweis: Es gibt mehrere Methoden zum Buffer Tausch vor der Analyse von MS wie die Verwendung eines Spin-Konzentrator oder Chromatographiesäulen. Native MS wird meist durch die Qualität der Probe begrenzt, wie z. B. puffert und Addukte während der Reinigung verwendet. Daher unbedingt durchführen, ausreichende Entsalzung um gelöst Gipfeln zu erhalten.
   4. Für HerA-NurA Ligand verbindliche Studien Puffern Sie Austausch Proben 6 – 8 Mal in 200 mM Ammoniumacetat mit einem Konzentrator. Obwohl diese Methode mehr Zeit in Anspruch nimmt, sorgt dafür, dass die aufgelösten Gipfel erreicht werden und ermöglicht eine exakte Massenbestimmung von ATP/ADP gebundenen Arten.

(2) native MS-Erfassung und Analyse für die Untersuchung von Protein-komplexe und Protein-Ligand-komplexen

Hinweis: MS Bedingungen sollten optimiert werden, um hoch aufgelösten Spitzen um präzise massenmessungen ermöglichen zu erreichen. Dieser Abschnitt beschreibt optimierte Parameter auf ein Q-ToF Massenspektrometer mit einer 32 k Obergrenze m/Z Quadrupol.

1. Nano-Elektrospray bereiten Sie Inhouse Kapillaren vor und führen Sie Masse Kalibrierung für präzise massenmessungen gemäß Kirshenbaum Et al. ¹.
2. Empfindlichkeit, positive Ionen-Akquisition und Mobilität-TOF-Modi auswählen.
3. Schalten Sie die Falle, API und IMS Gase. IM Trennung Stickstoff (60 mL/min) und Argon (8,4 mL/min für die Trap-Region) als Ausgangspunkt verwenden und dann passen.
4. Legen Sie eine geeignete m/Z Erwerb Bereich. Für eine unbekannte Protein sollten erste Optimierungsschritte verwenden, ein breites Spektrum wie 500-32.000 m/Z.
5. Laden Sie 2-3 µL der Protein komplexe Lösung in einer gold beschichtete Kapillare analysiert werden und legen sie in eine Kapillare Halter.
6. Sanft festziehen der Kapillare und die Kapillare in der Elektrospray-Quelle-Bühne und schieben die Bühne in Position, um die Datenerfassung zu starten.
7. Nano-Niederfluß Gas Druck (0,00-0,05 Bar) bis ein Tropfen an der Spitze der Kapillare gebildet wird. Die Nano-Fließdruck kann dann gelöscht werden, bis das Spray gepflegt wird.
8. Passen Sie die Kapillare im Hinblick auf den Kegel durch Verschieben der Kapillare x, y, Z-Positionen und Überwachen der Ionenstrom, eine stabile Ionenstrom zu erreichen. Anwenden eine Kapillare Spannung im Bereich von 0,9-1,6 kV.
9. Legen Sie die Probenahme Kegel (50-120 V), Quelle Versatz (60,0), Quelltemperatur (25 ° C) und Kegel Gasstrom (0.0 L/h). Diese schlug Anfangsbedingungen angepasst werden können.
10. Ein gut gelöst Massenspektrum erwerben und Ionen-Übertragung zu maximieren, MS Parameter einstellen und die daraus resultierende Veränderung in den Spektren zu überwachen. Dazu gehören die Anpassung der Gasstrom in der Falle (2-8 mL/min), er Zelle (180 mL/min) und IMS-Zelle (90 mL/min), beste Trennung auf maximale Kraftübertragung zu erreichen.
11. Stellen Sie die Falle Kollision Energien, wenn Spannung Offsets nicht ausreichen. Optimaler Ausgangspunkt liegt zwischen 10-50 V.
    Hinweis: Erhöhung der Falle Energie kann Addukte entfernen nicht kovalent gebunden. Jedoch induzierte darauf achten, dass die Kollision zu vermeiden Dissoziation und Entfaltung des Protein-Ligand-Komplexes. Durchführen Sie Ionen-Mobilität Messungen zu überprüfen, ob Instrument Bedingungen das Protein in der nativen gefalteten Zustand (Schritt 3 behalten).
12. Verbesserung der zugeführten durch die Optimierung der Trap-Bias-Spannung. Optimaler Ausgangspunkt ist 20-45 V.
13. Optimieren Sie die Wellengeschwindigkeit und Wellenhöhe, beste Mobilität Trennung zu erreichen. Eine detaillierte Erklärung und Protokoll³¹finden Sie hier. Verwenden Sie für die HerA-NurA-Studien Wellengeschwindigkeit von 40 (m/s) und Wellenhöhe von 550-650 (V).
14. Verwenden Sie alle anderen Parameter als Instrument Standardwerte.
15. Bereiten Sie eine Liganden-kostenlose Probe für die Analyse als Steuerelement für jeden Lauf (Abbildung 1). Durchführen Sie für Ligand verbindliche Experimente mindestens drei unabhängige Messungen.
16. Verwenden Sie die Software Masslynx Massen erzeugten Arten messen und die Bindung des Liganden, wie ATP und ADP Bindung und Oligomere Staaten (Abbildung 2 und 3) zu identifizieren. Andere verfügbare Software gehören UniDec³², PULSAR³³ und Amphitrite³⁴.
17. Um die relative Häufigkeit von Arten zu quantifizieren, verwenden Sie die entsprechenden Ionen-Intensitäten beobachtet in den rohen ESI-MS Spektren (z. B. Liganden gebunden, verschiedene Oligomere, etc..). Alternativ führen Sie Quantifizierung mit Spezialsoftware wie UniDec und Massign³⁵ (Abbildung 1 und 3 ).

3. Erwerb und Analyse IM-MS

Hinweis: IM-MS trennt Ionen in der Gasphase, die aufgrund ihrer Größe (Masse), Form und kostenlos. Jede Funktion in m/Z Spektrum gelöst ist eine Drift Zeitverteilung zugeordnet. IM-MS misst die Drift-Zeit eines ions, die zur Berechnung der Kollision Querschnitt (CCS). Drift-Time-Werte gemessen von IM-MS mit erfassten Daten ein Drift-Rohr linear zu CCS Werte³⁶korreliert werden kann. Für Reisen Welle IM-MS (TWIMS) Messungen, erfordert die CCS Werte berechnen eine Kalibrationskurve aus Proteinstandards mit bekannten CCS Werte³⁷gewonnen. Kompakte Strukturen Reisen schneller als erweiterte oder längliche Strukturen reduziert Interaktionen mit Sperrgas Mobilität Zelle³⁸. Daher können IM-MS verwendet werden, zu erkennen, ob die native gefaltete Struktur in den Gas Phase^39,40erhalten geblieben ist. In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie IM-MS Messen und berechnen die CCS Protein mit TWIMS.

1. Reduzieren Sie nach der Optimierung Instrument Voraussetzungen für stabile Übertragung (Schritt2) die Elektronenstruktur Energie und Probenahme Kegel so gering wie möglich Beibehaltung guter Spektren Qualität.
2. Nutzen Sie die optimierten Wellengeschwindigkeit und Wellenhöhe IM-MS (Schritt2) zu erwerben.
3. Messen Sie die Ionen-Drift Zeit mit IM-MS mit drei verschiedenen Welle Geschwindigkeiten (z. B. 550, 600 und 650 m/s), Beibehaltung der gleichen Wellenhöhe (z.B. 40 V).
4. Um festzustellen, die Protein-Ionen CCS, Maßnahme Protein Kalibrierstandards denselben Bedingungen Instrument verwendet für Protein untersucht. Optimale Drift-Zeit Kalibrierung erfordert die Messung von Proteinen mit bekannten CCS.
   1. Wählen Sie aus vier Kalibrierstandards, zwei mit einer Masse oben und zwei mit einer Masse unterhalb des Proteins unter Untersuchung³⁷. Vor allem ist darauf zu achten, dass die Wellenhöhe und Wellengeschwindigkeit identisch mit denen für das Protein untersucht aufgezeichnet sind.
5. Berechnen Sie CCS⁴¹ manuell oder mit Hilfe einer Spezialsoftware wie PULSAR³³ und Amphitrite³⁴ (Abbildung 5).
6. Um zu prüfen, ob das Protein ist Native-wie in der Gasphase, hochauflösende Strukturen vergleichen experimentelle CCS zu theoretischen CCS entnommen. Berechnen Sie für HerA-NurA theoretische CCS mit der Projektion Annäherung (PA) Methode in MOBCAL⁴²verwendet. Andere Methoden sind Flugbahn Methode (TM)⁴² und genaue harte Kugel Streuung (EHS)⁴³.

4. in-Lösung Störung der Proteinkomplexe für Native MS und IM-MS führte Strukturaufklärung

Hinweis: Sub Proteinkomplexe können in einigen Fällen von der gleichen Projektmappe wie der intakten Komplex identifiziert werden. Allerdings sind weitere Strukturinformationen wie Inter Untereinheit Konnektivität und aufwändige Montage erreicht werden können, von Protein-Interaktionen in Lösung, Sub komplexe Form zu stören. Dies kann auf verschiedene Arten wie die Zugabe von organischen Lösungsmitteln, Erhöhung der Ionenstärke oder Manipulation des pH-Werts erreicht werden. Um Einblick in die HerA-NurA komplexe Untereinheit Konnektivität und aufwändige Montage entstanden Sub-komplexe in Lösung durch Zugabe von Lösungsmittel die Untereinheit Interaktionen zu belästigen.

1. Bereiten Sie die Protein-Probe und Puffer-Tausch in Ammoniumacetat, wie in Schritt 1beschrieben.
2. 10-40 % der Lösungsmittel in 10 %-Schritten hinzufügen. In der Regel verwendeten Lösungsmittel sind Methanol (MeOH), Dimethyl Sulfoxid (DMSO) oder Acetonitril (ACN).
   Hinweis: Dies kann in einem Polypropylen Microcentrifuge Schlauch durchgeführt werden.
3. Inkubieren Sie die Mischung auf dem Eis für 1 h.
4. Erwerben Sie ein IM-MS-Spektrum für jede Bedingung (Schritte 2 und 3) (Abbildung 4).
5. Verwenden Sie die Gipfel Software⁴⁴ zuweisen Sub Proteinkomplexe und Protein-Interaktion-Netzwerke zu generieren. Alternativ manuell erstellen Sie eine Liste der theoretischen Massen der erwarteten Arten.
6. Um sicherzustellen, dass Subcomplexes gefaltet sind, berechnen die experimentelle CCS-Werte für die Sub-komplexe und vergleichen mit theoretischen CCS wie in Schritt 3 (Tabelle 1, Abbildung 5 und Abbildung 6).

5. Untersuchung von Protein Komplexstabilität mit Kollision induzierte Entfaltung (CIU)

Hinweis: CIU verwendet werden Sonde die strukturelle Stabilität der Proteine und ihre komplexe auf Ligand-Bindung. Spezialist für Software-Pakete wie PULSAR³³, Amphitrite³⁴ und CIU Suite⁹ lässt dann die Gasphase Entfaltung des Proteins untersucht mit und ohne Liganden-Modell. Als ein Beispiel in diesem Abschnitt werden Verfahren zur Überwachung der Gasphase Entfaltung Flugbahnen und untersuchen die stabilisierende Wirkung der DNA und ATP-Bindung auf dem HerA-NurA-Komplex.

1. IM-MS Daten gleichzeitig die Falle Beschleunigungsspannung von 10 V bis 200 V in 2-10 V Schritten nach und nach entfalten das Protein in der Gasphase zu steigern.
   Hinweis: Ergebniserfassung kleineren Schritten in mehrere Dateien zu verarbeiten, aber dieser Ansatz mehr gelöst sich entfaltende Handlung bietet, was wichtig für die Analyse von der Übergängen zwischen den Arten gefaltet/entfaltet ist.
2. Mit PULSAR³³, Amphitrite³⁴ oder CIU Suite⁹ erfassten Daten analysieren Sie und generieren Sie zweidimensionale sich entfaltenden Grundstücke in Einheiten von CCS als Funktion der Spannung (Schritt 3) zu beschleunigen. Für jede Ladezustand wird dies durch Stapeln der CCS Distributionen Intensität-normalisiert bei jeder Beschleunigungsspannung (Abb. 7 A-Bi) erstellt.
3. Eine theoretische Entfaltung Grundstück unter Verwendung eines Software-Pakete zu erzeugen. Die Daten werden auf einer sich entfaltenden Modell montiert werden. Dies macht es möglich, die Elektronenstruktur Energie zu quantifizieren, an dem sich entfaltenden Übergänge auftreten und bestimmen die Stabilität von Proteinen mit und ohne gebundenen Liganden³³. Ein sich entfaltenden Übergang ist, wenn eine Spezies Übergänge von einem Zustand (basierend auf den experimentellen CCS-Werten) in einen anderen Staat mit einer größeren CCS.
4. Um die Übergänge quantitate, berechnen Sie die Übergangszeit Midpoint(s) zwischen Staaten, die Verwendung von Algorithmen und Software wie PULSAR³³. Dies ist häufig als CV₅₀, berichtet die Kollision (Trap) Spannungswert ist an dem 50 % eines bestimmten Staates aufgebraucht ist.
5. Berechnen Sie mit dem CV₅₀ Wert, innere Gesamtenergie eines ions mit dem Massenmittelpunkt der Kollision Energie (KE_COM)⁴⁵. KE_COM zeichnet sich durch die gesamte innere Energie zur Verfügung, für den sich entfaltenden Übergang eines ions und errechnet sich aus der Bewegungsenergie und Massen der Kollision Partner (Protein-Ion und neutralgas) gemäß Gleichung (1)¹⁰
   KEcom (eV) = (Gleichung 1).
   Wo Z ist der Ion-Anklage M_N ist die Masse des neutralen Gases und M_ION ist die Masse des Ions Protein.
   Hinweis: Dies ist nämlich CIU Proteine kostenlos dependent46, 47. Es wird empfohlen, die KE_COM -Analyse zu mehr als einem Ladezustand ( Abbildung 7Aii) durchzuführen.

6. Verfahren für differenzielle molekulare Dynamik-Simulationen in Integrative MS verwendet Modellierung

Hinweis: Wenn Sie Modelle von Protein-Untereinheiten oder komplexe wie z. B. von Kristallstrukturen, differenzielle MD-Simulationen (Protein-Komplex mit und ohne Liganden) lässt sich bestimmen, welche Auswirkungen zum Beispiel Liganden Präsenz auf Protein-Struktur und Dynamik. In diesem Abschnitt werden eine Workflow und Werkzeuge für die Modellierung der Verfahren notwendig, Set-up differenzielle Molekulardynamik-Simulationen.

1. Identifizieren Sie die Untereinheiten, die den Komplex (Abbildung 8A, in den Schritten 2 und 3) zusammensetzen. Quelle bestehende Modelle der Untereinheiten, z. B. Kristallstrukturen aus der RCSB-Datenbank (https://www.rcsb.org). Die UniProt, den Eintrag des Proteins enthält eine Liste der kristallographischen/NMR Strukturen (http://www.uniprot.org) kennen. Wenn diese nicht verfügbar sind, kann die theoretische Abfolge zu Explosion zu identifizieren geeignete Vorlagen für Homologie Modellierung (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) eingegeben werden.
2. Montieren Sie die Anlage in der richtigen Topologie (Abbildung 8A-Ii). Dies kann durch verschiedene Methoden erfolgen. Die einzelnen Untereinheiten können in verfügbar Elektronenmikroskopie Karten finden Sie auf der EMDB eingepasst werden, zu den intakten Komplex (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/) zu montieren. Eine Anleitung für den Einbau PDBs in EM-Karten mit molekularen Dynamik Flexible Montage (MDFF) finden Sie hier: http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/science/mdff/tutorial_mdff-html/.
3. Fehlende Regionen des Komplexes (Abbildung 8A-Iii) zu identifizieren. Führen Sie mehrere Sequenzalignment (MSA) zwischen der PDB und theoretische Sequenz um Rückstände zu identifizieren, die unmontierte in Kristallstrukturen oder Mutationen von kristallographischen Experimente geerbt werden kann. MSA kann mit der Webserver z. B. T-Coffee (Http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular) durchgeführt werden.
4. Regenerieren Sie fehlende Rückstände über Homologie Modellierung (Abbildung 8A-iv). Fehlende Rückstände von der Protein-Komplex kann mit dem MODELLBAUER-Programm (https://salilab.org/modeller/) gebaut werden. MODELLBAUER kann ein Ensemble von n-Modelle in verschiedenen Konfigurationen regenerierten ausgeben. Gute Modelle können anhand ihrer diskreten optimiert Protein Energie (SCHMIERE) Partitur identifiziert werden. Ein umfassendes Tutorial ist auf der Website von Software (https://salilab.org/modeller/tutorial/) zur Verfügung gestellt.
5. Führen Sie differential (MD) Molekulardynamiksimulationen von der Protein-Komplex (Abb. 8B), um Regionen der Proteine zu identifizieren, die auf einen bestimmten Umweltveränderungen, z. B. Vorhandensein eines Liganden reagieren. In solchen Simulationen, verhaltensbezogene Parameter aus der Simulation A (nur Eiweiß) die als Referenz dient der Simulation B (Protein + Ligand) abgezogen ist. Die differentielle Root-Mean-Square-Fluktuation (RMSF) zwischen A und B Simulationen berechnet kann auf Bereiche des Proteins, die erhöhen oder verringern in Flexibilität in gewissem Sinne Liganden abhängige informieren.
   1. Durchführen Sie MD-Simulationen und nachgelagerte Analyse mit GROMACS (http://www.gromacs.org). Eine Anleitung finden Sie unter: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/Lysozyme/index.html. Elimate Modell Vorurteile sollte zunächst die Struktur des Liganden-gebundenen komplexes erstellt werden. Das Protein wird dann daraus ohne Ligand, ein Protein-Modell identisch mit der Liganden gebundene Komplex weichen kopiert.

Representative Results

Discussion

MS spielt eine zunehmend wichtige Rolle bei der Charakterisierung der Stöchiometrie, Interaktionen und Untereinheit Architektur von Proteinkomplexen. IM-MS Daten können verwendet werden, topologische Arrangements von Untereinheiten innerhalb von Mehrkomponenten-komplexe zu definieren. Im Vergleich zu anderen bestehenden Strukturbiologie, hat MS mehrere Vorteile. Native MS ist eine schnelle und hochempfindliche Technik und kann verwendet werden, um heterogene Proteinproben Sonde. Zusammen mit in-Lösung Störung Experimente können Dissoziation Wege Protein Baugruppen überwacht werden. Zusammen mit Kristallstrukturen oder Homologie Modelle das Informationsangebot von strukturellen MS bietet ein Tool für die Untersuchung von Protein-Ligand-Interaktionen und bieten fast nativer Modelle und Montage Wege¹¹.

Hier beschreiben wir die erforderlichen experimentellen Verfahren zur Analyse der Stöchiometrie und Zusammensetzung der Protein-Ligand-Interaktionen, mit einem oder mehreren Liganden mit integrativen MS. Dazu gehören MS Probenvorbereitung, Datenerfassung, Datenanalyse und die Integration von MS-Daten mithilfe von Berechnungswerkzeuge. Um dies zu tun, verwendeten wir die DNA-Resektion HerA-NurA Hetero-Oligomere Proteinkomplex, verpflichtet, drei Liganden (DNA, ATP und ADP), als unser Modellsystem. Das Protokoll zeigt die Verwendung der derzeit verfügbaren Software zur Datenanalyse und Präsentation.

Erwerb von hochwertigen Spektren ist wichtig für Ligand verbindliche Analyse, daher sind sorgfältige Vorbereitung Beispielschritte kritisch, einschließlich Proteinreinigung, Liganden Titration und Buffer Tausch. Eine Einschränkung der nESI ist native MS als Ligand Binding studierte unspezifischen Bindung. Unspezifische Bindung tritt während der zugeführten Tropfen während der Elektrospray-Prozesses. Dies erhöht die Liganden-Konzentration und verändert daher die Protein/Liganden Verhältnis²⁹. Die Bindung von Nukleotiden führt zu einer relativ geringen Massendifferenz zwischen Apo und Nukleotid-gebundenen Protein, das sich nicht, die Ionisation Effizienz^{50,51 ändert}.

Wir nutzten die Synapt G2-Si MS-System für unsere Arbeit, aber die Protokolle gelten für verschiedene Untersuchungen von anderen Protein-Ligand-komplexen mit anderen im Handel erhältlichen Nano-Elektrospray-Massenspektrometer. Integrative strukturelle MS spielt zunehmend eine wichtige Rolle im Hinblick auf biologische Probleme der größeren Komplexität. Der Workflow und die hier beschriebenen Methoden eignen sich für das Verständnis der strukturellen Konsequenzen und Mechanismen der Proteinkomplex und Protein-Ligand-Bildung, die sonst schwer zu studieren, mit herkömmlichen strukturelle Techniken sind Gebäude .

Materials

Adenosine 5′-(3-thiotriphosphate) tetralithium salt	Merck Millipore	119120-25MG
Adenosine 5′-diphosphate 	Sigma-Aldrich	20398-34-9
Ammonium acetate solution	Sigma-Aldrich	A2706
Micro Bio-Spin Chromatography Columns	Bio-Rad	7326204
Vivaspin concentrator	Sartorius	Z614041-25EA
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	246964
Water TraceSelect	Sigma-Aldrich	95305
Borosilicate Capillaries	Harvard Apparatus	300060