Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur DNA-Protein Interaktionen durch Totalreflexion Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM) mit ein ortspezifisch modifizierte λ-DNA-Substrat und einem Quantenpunkt beschriftet Protein zu studieren.
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Methodenartikel
Visualisierung der Interaktion zwischen dem Qdot-markierten Protein und ortspezifisch modifizierte λ-DNA auf der Einzelmolekül-Ebene
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Fluoreszenz-Mikroskopie hat große Beiträge geleistet, in die Mechanismen der komplexe biologische Prozesse auf der Ebene des einzelnen Moleküls sezieren. In Einzelmolekül-Assays für die DNA-Protein Interaktionen zu studieren, gibt es zwei wichtige Faktoren für die Prüfung: die DNA-Substrat mit genügend Länge für einfache Beobachtung und Kennzeichnung ein Protein mit einer geeigneten fluoreszierende Sonde. 48,5 kb λ-DNA ist ein guter Kandidat für die DNA-Substrat. Quantenpunkte (Qdots), können als eine Klasse von fluoreszierenden Sonden, langjähriger Beobachtung (Minuten bis Stunden) und qualitativ hochwertige Bilderfassung. In diesem Papier stellen wir ein Protokoll, um DNA-Protein Interaktionen Ebene der Einzelmolekül-Studie umfasst eine ortspezifisch modifizierte λ DNA Vorbereitung und Kennzeichnung ein Zielprotein mit Streptavidin-beschichteten Qdots. Für ein Proof of Concept wir wählen Sie ORC (Herkunft Erkennung komplexer) in angehende Hefe als ein Protein des Interesses und seiner Interaktion mit einer ARS (autonom replizierende Sequenz) mit TIRFM zu visualisieren. Im Vergleich mit anderen fluoreszierenden Sonden, Qdots haben offensichtliche Vorteile in Einzelmolekül-Studien aufgrund seiner hohen Stabilität gegen Immunofluoreszenz, aber es sei darauf hingewiesen, dass diese Eigenschaft die Anwendung in der quantitativen Assays schränkt.
Einleitung
Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA sind entscheidend für viele komplexe biologische Prozesse, wie DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Transkription. Obwohl konventionelle Ansätze die Eigenschaften dieser Prozesse beleuchten haben, sind viele wichtige Mechanismen noch unklar. Vor kurzem, wurden einige der Mechanismen, mit den sich rasch entwickelnden Einzelmolekül-Techniken, adressierte1,2,3.
Die Anwendung der Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie auf DNA-Protein Interaktionen in Echtzeit vor allem Visualisierung hängt von der Entwicklung de....
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Protokoll
1. Vorbereitung des λ-ARS317 DNA-Substrat
- DNA-Substrat Bau und Verpackung
- Native λ-DNA mit Hilfe Xhoverdauen ich Enzym; verstärken 543 bp DNA Fragment Lager ARS317 aus genomischer DNA des angehenden Hefe mit Primer mit 20 bp homologe Sequenzen von vorgelagerten und nachgelagerten Xhoich Enzym Website auf Lambda DNA. Addieren Sie 100 ng der Xhoich verdaut λ-DNA und 10 ng DNA-fragment, zu 10 µL der homologen Rekombination Reaktionssystem, und die Reaktion bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
- Um die Rekombination λ-DNA Verpacken, 25 µL der Lambda-Verpackung-Extrakte in der Rekombination Produkt hinzufügen, und die Reak....
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Ergebnisse
Um die Interaktion zwischen ORC Qdot beschriftet und die ARS zu visualisieren, errichteten wir zuerst das λ-ARS317 DNA-Substrat. Ein DNA-Fragment mit ARS317 wurde integriert in XhoI Seite (33,5 kb) der native λ-DNA durch homologe Rekombination (Abbildung 1A). Die Rekombination Produkt wurde verpackt mit Extrakten und die verpackten Phagen Partikel auf LB-Platten (Abbildung 1 b) kultiviert wurden. Die positive Phagen-Plaq.......
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Diskussion
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Interaktion zwischen dem Qdot-markierten Protein und die ortspezifisch modifizierte λ-DNA mit Hilfe der TIRFM in einer Durchflusszelle beobachten. Die notwendigen Schritte sind standortspezifische Modifikation der DNA Substrat, DNA biotinylierungen Deckglas Reinigung und Funktionalisierung, Durchflusszelle Vorbereitung und Einzelmolekül-Bildgebung. Es gibt zwei wichtige Punkte, die beachtet werden sollten. Zunächst werden alle Schritte mit λ-DNA sanft manipuliert werden sollten.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir bedanken uns bei Dr. Hasan Yardimci und Dr.Sevim Yardimci des Francis Crick Institute for Art helfen bei der Einzelmolekül-Experimente, Dr. Daniel Duzdevich von Dr. Eric C. Greene-Labor der Universität von Columbia, Dr. Yujie Sun der Peking-Universität und Dr. Chunlai Chen von Tsinghua-Universität für nützliche Diskussion. Diese Studie wurde unterstützt durch die National Natural Science Foundation of China 31371264, 31401059, CAS interdisziplinärer Innovationsteams und die Newton Advanced Fellowship (NA140085) von der Royal Society.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μ L aliquotiert bei -20 & ordm;C. |
| XhoI Enzym | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Schnellfusionsklonierungskit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Verpackung Extrakte | Epicentre | MP5110 | Bakterienstamm LE392MP ist in diesem Paket enthalten. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013092 | Jede Marke ist akzeptabel. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical Works | N/A | Jede Marke ist akzeptabel. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical Works | N/A | Jede Marke ist akzeptabel. |
| NZ-Amin | Amresco | J853-250G | |
| Casaminosäuren | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetrührgerät | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf Röhrchen | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, steril, los, 500 Stück |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylierte Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA-Ligase, T4 DNA-Ligase, Reaktionspuffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Deckglas | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd | 10009259 | |
| Kaliumhydroxid (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Aceton | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd | 80120891 | Schwefelsäure |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011218 | 30% Wasserstoffperoxid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Essigsäure | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (Methoxy-Polyethylenglykol) | Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| Biotin-PEG (Biotin-Polyethylenglykol) | Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vakuumexsikkator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vakuumierer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Glasritzer mit Diamantspitze | ELEKTRONENMIKROSKOPIE SCIENCES | 70036 | |
| Glasschieber | Segel Marke | 7101 | |
| Einlassschlauch | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | Innendurchmesser 0,38 mm; Außendurchmesser 1,09 mm. |
| Auslassschlauch | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | Innendurchmesser 0,76 mm; Außendurchmesser 1,22 mm. |
| Doppelseitiges Klebeband | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxidharz | LEAFTOP | 9005 | fünf Minuten Epoxidharz |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluoreszenzmikroskop | Olympus | IX71 | |
| Infusion/Entnahme programmierbare Pumpe | Harvard-Gerät | 70-4504 | |
| 532 nm Laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm Laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Kamera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging Splitting Optics | Hamamatsu Photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF-Beleuchtungssystem | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60-fach; TIRF-Objektiv | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-Edge Laser dichroit Strahlteiler | Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25x36 | |
| Quad-Band-Bandpassfilter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 | |
| dichroitischer Strahlteiler | Semrock | FF649-Di01-25x36 | |
| Emissionsfilter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emissionsfilter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck Fluoreszenz, Mikroskop Test Slide #1 | Thermo Fisher | Scientific F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Konjugat | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store um 4 º C, nicht einfrieren. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Bereiten Sie 200 mM ATP-Lösung mit ddH2O vor, stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 ein und lagern Sie 10 μm; L aliquotiert bei -20 & ordm;C. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Bereiten Sie 1 M Lösung mit ddH2O vor und lagern Sie 10 μ; l aliquotiert bei -20 °C. |
Referenzen
- Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. C....
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Nachdrucke und Genehmigungen
