Method Article

Visualisierung der Interaktion zwischen dem Qdot-markierten Protein und ortspezifisch modifizierte λ-DNA auf der Einzelmolekül-Ebene

DOI:

10.3791/57967

⸱

July 17th, 2018

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

In This Article

Summary

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Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur DNA-Protein Interaktionen durch Totalreflexion Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM) mit ein ortspezifisch modifizierte λ-DNA-Substrat und einem Quantenpunkt beschriftet Protein zu studieren.

Abstract

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Die Fluoreszenz-Mikroskopie hat große Beiträge geleistet, in die Mechanismen der komplexe biologische Prozesse auf der Ebene des einzelnen Moleküls sezieren. In Einzelmolekül-Assays für die DNA-Protein Interaktionen zu studieren, gibt es zwei wichtige Faktoren für die Prüfung: die DNA-Substrat mit genügend Länge für einfache Beobachtung und Kennzeichnung ein Protein mit einer geeigneten fluoreszierende Sonde. 48,5 kb λ-DNA ist ein guter Kandidat für die DNA-Substrat. Quantenpunkte (Qdots), können als eine Klasse von fluoreszierenden Sonden, langjähriger Beobachtung (Minuten bis Stunden) und qualitativ hochwertige Bilderfassung. In diesem Papier stellen wir ein Protokoll, um DNA-Protein Interaktionen Ebene der Einzelmolekül-Studie umfasst eine ortspezifisch modifizierte λ DNA Vorbereitung und Kennzeichnung ein Zielprotein mit Streptavidin-beschichteten Qdots. Für ein Proof of Concept wir wählen Sie ORC (Herkunft Erkennung komplexer) in angehende Hefe als ein Protein des Interesses und seiner Interaktion mit einer ARS (autonom replizierende Sequenz) mit TIRFM zu visualisieren. Im Vergleich mit anderen fluoreszierenden Sonden, Qdots haben offensichtliche Vorteile in Einzelmolekül-Studien aufgrund seiner hohen Stabilität gegen Immunofluoreszenz, aber es sei darauf hingewiesen, dass diese Eigenschaft die Anwendung in der quantitativen Assays schränkt.

Introduction

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Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA sind entscheidend für viele komplexe biologische Prozesse, wie DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Transkription. Obwohl konventionelle Ansätze die Eigenschaften dieser Prozesse beleuchten haben, sind viele wichtige Mechanismen noch unklar. Vor kurzem, wurden einige der Mechanismen, mit den sich rasch entwickelnden Einzelmolekül-Techniken, adressierte1,2,3.

Die Anwendung der Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie auf DNA-Protein Interaktionen in Echtzeit vor allem Visualisierung hängt von der Entwicklung de....

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Protocol

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1. Vorbereitung des λ-ARS317 DNA-Substrat

  1. DNA-Substrat Bau und Verpackung
    1. Native λ-DNA mit Hilfe Xhoverdauen ich Enzym; verstärken 543 bp DNA Fragment Lager ARS317 aus genomischer DNA des angehenden Hefe mit Primer mit 20 bp homologe Sequenzen von vorgelagerten und nachgelagerten Xhoich Enzym Website auf Lambda DNA. Addieren Sie 100 ng der Xhoich verdaut λ-DNA und 10 ng DNA-fragment, zu 10 µL der homologen Rekombination Reaktionssystem, und die Reaktion bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
    2. Um die Rekombination λ-DNA Verpacken, 25 µL der Lambda-Verpackung-Extrakte in der Rekombination Produkt hinzufügen, und die Reak....

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Results

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Um die Interaktion zwischen ORC Qdot beschriftet und die ARS zu visualisieren, errichteten wir zuerst das λ-ARS317 DNA-Substrat. Ein DNA-Fragment mit ARS317 wurde integriert in XhoI Seite (33,5 kb) der native λ-DNA durch homologe Rekombination (Abbildung 1A). Die Rekombination Produkt wurde verpackt mit Extrakten und die verpackten Phagen Partikel auf LB-Platten (Abbildung 1 b) kultiviert wurden. Die positive Phagen-Plaq.......

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Discussion

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Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Interaktion zwischen dem Qdot-markierten Protein und die ortspezifisch modifizierte λ-DNA mit Hilfe der TIRFM in einer Durchflusszelle beobachten. Die notwendigen Schritte sind standortspezifische Modifikation der DNA Substrat, DNA biotinylierungen Deckglas Reinigung und Funktionalisierung, Durchflusszelle Vorbereitung und Einzelmolekül-Bildgebung. Es gibt zwei wichtige Punkte, die beachtet werden sollten. Zunächst werden alle Schritte mit λ-DNA sanft manipuliert werden sollten.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

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Wir bedanken uns bei Dr. Hasan Yardimci und Dr.Sevim Yardimci des Francis Crick Institute for Art helfen bei der Einzelmolekül-Experimente, Dr. Daniel Duzdevich von Dr. Eric C. Greene-Labor der Universität von Columbia, Dr. Yujie Sun der Peking-Universität und Dr. Chunlai Chen von Tsinghua-Universität für nützliche Diskussion. Diese Studie wurde unterstützt durch die National Natural Science Foundation of China 31371264, 31401059, CAS interdisziplinärer Innovationsteams und die Newton Advanced Fellowship (NA140085) von der Royal Society.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lambda DNANew England BiolabsN3011Store 25 μ L aliquotiert bei -20 & ordm;C.
XhoI EnzymThermo Fisher ScientificFD0694
SchnellfusionsklonierungskitBiotoolB22611
MaxPlax Lambda
Verpackung Extrakte		EpicentreMP5110Bakterienstamm LE392MP
ist in diesem Paket enthalten.
MgSO4Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013092Jede Marke ist akzeptabel.
TrisAmresco0497-5KG
NaClBeijing Chemical WorksN/AJede Marke ist akzeptabel.
MgCl2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10012818
ChloroformBeijing Chemical WorksN/AJede Marke ist akzeptabel.
NZ-AminAmrescoJ853-250G
CasaminosäurenSigma-Aldrich22090-500G
PEG8000BeyotimeST483
MagnetrührgerätIKAKMO2 basic
15 mL Eppendorf RöhrchenEppendorf3012215115 mL, steril, los, 500 Stück
RnaseSIGMAR4875-100MG
DnaseSIGMAD5319-500UG
Proteinase KAmresco0706-100MG
Biotinylierte PrimerThermo Fisher ScientificN/A
T4 DNA-Ligase, T4 DNA-Ligase, Reaktionspuffer (10x)New England BiolabsM0202
DeckglasThermo Fisher Scientific22266882
EthanolSinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd10009259
Kaliumhydroxid (KOH)Sigma-Aldrich306568-100G
AcetonThermo Fisher ScientificA949-4
H2SO4Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd80120891Schwefelsäure
H2O2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd1001121830% Wasserstoffperoxid
MethanolSigma-Aldrich322415-2L
EssigsäureSigma-AldrichV900798
APTESSigma-AldrichA3648
mPEG
(Methoxy-Polyethylenglykol)		LysanmPEG-SVA-5000
Biotin-PEG
(Biotin-Polyethylenglykol)		LysanBiotin-PEG-SVA-5000
NaHCO3Sigma-Aldrich31437-500G
VakuumexsikkatorTianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.IPC250-1
VakuumiererMAGIC SEALWP300
Glasritzer mit DiamantspitzeELEKTRONENMIKROSKOPIE SCIENCES70036
GlasschieberSegel Marke7101
EinlassschlauchSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/2Innendurchmesser 0,38 mm; Außendurchmesser 1,09 mm.
AuslassschlauchSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/4Innendurchmesser 0,76 mm; Außendurchmesser 1,22 mm.
Doppelseitiges KlebebandSigma-AldrichGBL620001-1EA
EpoxidharzLEAFTOP9005fünf Minuten Epoxidharz
StreptavidinSigma-AldrichS4762
FluoreszenzmikroskopOlympusIX71
Infusion/Entnahme
programmierbare Pumpe		Harvard-Gerät70-4504
532 nm LaserCoherentSapphire-532-50
640 nm LaserCoherentOBIS-640-100
EMCCD KameraAndorDU-897E-CS0-BV
W-View Gemini Imaging
Splitting Optics		Hamamatsu Photonics K.K.A12801-01
TIRF-BeleuchtungssystemOlympusIX2-RFAEVA2
60-fach; TIRF-ObjektivOlympusAPON60XOTIRF
Quad-Edge Laser dichroit
Strahlteiler		SemrockDi01-R405/488/
532/635-25x36
Quad-Band-BandpassfilterSemrockFF01-446/510/
581/703-25
dichroitischer StrahlteilerSemrockFF649-Di01-25x36
EmissionsfilterChroma Technology CorpET585/65m
EmissionsfilterChroma Technology CorpET665lp
FocalCheck Fluoreszenz, Mikroskop Test Slide #1Thermo FisherScientific F36909
SYTOX OrangeThermo Fisher ScientificS11368
Qdot705 Streptavidin KonjugatThermo Fisher ScientificQ10163MPStore um 4 º C, nicht einfrieren.
ATPAmresco0220-25GBereiten Sie 200 mM ATP-Lösung mit ddH2O vor, stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 ein und lagern Sie 10 μm; L aliquotiert bei -20 & ordm;C.
DTTAmrescoM109-5GBereiten Sie 1 M Lösung mit ddH2O vor und lagern Sie 10 μ; l aliquotiert bei -20 °C.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
  2. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. C....

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